全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第 6期
收稿日期：2008-05-30
作者简介：张迎春（1982-），女，在读硕士，研究方向：微生物药物与细胞生物学；E-mail：zycgm2008@126.com
通讯作者：韩素贞，讲师，研究方向：根瘤菌的分类、多样性及其应用；E-mail：hansuzhen99@vip.sina.com
放线菌是重要的土壤微生物，其代谢产物多种多样。 统计表明，已经发现的抗生素大多数来源于放线
菌，各种酶制剂如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、木质素酶等很多也都是由放线菌产生的。 目前研究者又从放
线菌中分离到多种有用的化学成分 [1]。 因此，放线菌仍然是生物学领域中主要研究对象之一。
由于土壤中发现放线菌新种的几率越来越小，研究者把眼光集中到极端环境和海洋等特殊生态。其中
西藏地区海拔高、气温低，太阳辐射强、日照时间长，土壤中放线菌资源丰富 [2]，引起了研究者的广泛关注。
西藏念青唐古拉山主峰海拔 7 117m，在其属半干旱高原季风气候区的卡拉山支脉土壤中，分离了 40 株放
线菌，对其中的 13 株菌进行了多相分类研究，试图确定它们的分类地位、挖掘它们的巨大潜力。
1 材料和方法
1.1 菌种
西藏卡拉山土样中放线菌的多相分类研究
张迎春 阚丽娟 刘少佳 刘磊 杨秀萍 韩素贞
（首都师范大学生命科学学院，北京 100048）
摘 要： 从西藏念青唐古拉山卡拉山支脉的土样中分离到40株放线菌，对其中的13株菌进行了多相分类。形态、
培养特征和系统发育结果表明，所有菌株均属于链霉菌属。从系统发育结果看，840018、850003和Z851023各处于一个独
立的分支，分别与 Streptomyces rishiriensis、Streptomyces cyanoalbus 和 Streptomyces albus subsp.albus的相似性达到99%。
菌株Z851010、Z851004、850011和850070聚成一个小群，它们之间的相似性达到95%，与Streptomyces sp.YIM26的相似
性达到98%；Z851013和Z851024聚成小群，它们之间的相似性达到100%，它们有可能是同一种菌株；850008和Z851020
聚成小群，它们的相似性达到95%；Z850007和850040聚成小群，与已知菌种的相似性只有96％，有可能是新的分类单
元。
关键词： 西藏 放线菌 16S rDNA 多相分类
Polyphasic Taxonomy of Actinomycetes Isolated from the Soil
Collected from Kala Mountains in Tibet
Zhang Yingchun Kan Lijuan Liu Shaojia Liu Lei Yang Xiuping Han Suzhen
（Life Science College，Capital Normal University，Beijing 100048）
Abstract： 40 actinomycete strains were isolated from the soil of Kala Mountains in Tibet，and 13 of them were
selected for polyphasic taxonomy. The results from morphological observation，cultural characteristics and phylogenetic
analysis indicated that these strains belong toStreptomyc s. The phylog netic results showed that 840018，85000 and
Z851023 were separately in a absolute branch at the similarity of 99% withStreptomyces rishiriensis，Streptomyces
cyanoalbus andStreptomyces albus subsp.Albus Z851010，Z851004，85001 and 850070 were in the same branch with
95% similarity and they had the similarity of 98% withStreptomyce sp. YIM26. Z851013 and Z851024 assembled in
one group at the similarity of 100%，therefore they are likely to be the same strain. 850008 and Z851020 were also at
the same group at the similarity of 95%. Z850007 and 850040 gathered in one branch，but had lower similarity of 96％
with known species，thus they may be a new taxon.
Key words： Tibet Actinomycetes 16S rDNA Polyphasics
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
将采集自西藏念青唐古拉山卡拉山支脉地区的土样制成土壤悬液，用平板稀释法在 ISP2（酵母膏 4g，
麦芽汁 10g， 葡萄糖 4g，pH 7.3） 和高氏一号 （可溶性淀粉 20g，KNO3 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，
K2HPO4·3H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，pH7.3）培养基平板上分离纯化放线菌，28℃培养至单菌落出现。 将单
菌落接入高氏一号斜面，28℃培养后保存于 4℃冰箱。 本试验共分离纯化放线菌 40 株，选用 13 株放线菌作
为供试菌株。
1.2 形态及培养特征观察
供试菌用 ISP2 和高氏一号培养基埋片培养，28℃培养 7~14d 后用光学显微镜观察形态特征。在 7 种不
同培养基上 [3]，28℃培养 7~28d，观察供试菌的生长及基内菌丝、气生菌丝的发育及其色素产生 [4]。
1.3 生理生化特性
根据 Shirling 等 [5]的方法观察记录 13 株菌的生理生化特性；同时检测 13 株菌对 25 种碳源的利用及对
氯霉素、卡那霉素、红霉素和新霉素等 4 种抗生素的抗性。
1.4 细胞壁化学成分分析
参照阮继生 [6]和王平 [7]改进的 TLC 方法，用微晶纤维素薄层层析的方法分析细胞壁的氨基酸成分和全
细胞壁水解液的糖成分。 DAP 标准品购自 Sigma 公司。
1.5 菌株 16S rDNA 序列测定
采用酚-氯仿抽提法提取放线菌总 DNA[8]。 16S rDNA 的 PCR 引物：上游引物（Primer A）5′-AGAGTTTG
ATCCTGGCTCAG-3′，下游引物（Primer B）5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。 PCR 反应体系：总体积 50μl，
含有 10×Buffer （1× ）5.0μl，dNTP （200μmol/L）1.0μl，MgCl2 （1.5mmol/L）3.0μl，Primer A （0.5μmol/L）1.0μl，
Primer B（0.5μmol/L）1.0μl，Taq 酶（2.4U/μl）0.24μl，DNA 模板 2.0μl，去离子水 37.76μl。 PCR 条件：94℃预变
性 5min，94℃变性 1min，50℃复性 1min，72℃延伸 3min，30 个循环；72℃充分延伸 5min。 PCR 产物用 0.8％琼
脂糖凝胶电泳检测，16S rDNA 序列测定交由上海英骏公司完成。
1.6 系统发育树的构建
GenBank 中搜索与供试菌序列相近种属的 16S rDNA 序列；用 CLUSTALX 1.81 对供试菌及相近种属的
16S rDNA 序列进行比对；再用 MEGA3.1 中的 Neighbor-joining 构建进化树，重复次数为 100。
2 结果分析
2.1 形态及培养特征
从基内菌丝和气生菌丝的形态、产生的色素颜色来看 ，全部供试菌均具有链霉菌属的特性 （图 1，表
1）。基内菌丝发育良好，多分枝，不形成横隔；气生菌丝分枝，孢子丝直、波曲或螺旋形，孢子球形、椭圆形或
柱形，表面光滑，具有链霉菌属的特征，初步确定供试菌属于链霉菌属。

A B
图 1 供试菌 Z851020 生长 28d 的形态
A：光镜下形态（400X）；B：扫描电镜示其孢子形态
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2008年第 6期
2.2 生理生化特性
根据阮继生等的分类签定方法对 13 株供试菌生理生化特性和碳源利用情况进行了测定， 结果见表 2
和表 3。

 
 
   
850003    
Z851004    
Z851007    
Z851010  !  
850011  "#  
840018   !  $%
Z851020  &!  
Z851023 ! ’!  
850040 ! !  $%
850070 ()% *% + *,
850008 ! !  
Z851013 &! &!  -.
Z851024 /01 /01  -.

表 1 13 株菌在高氏 1 号培养基上的生长情况
表 2 13 株菌的生理生化特性

      
850003 + + - + + -
Z851004 + - - + - -
Z851007 + - - - - +
Z851010 + + - - + -
850011 + + - - + -
840018 + - - - + +
Z851020 + - - - + -
Z851023 + + - + -
850040 + - - - - +
850070 - - - - - +
850008 - - - - - -
Z851013 - - - + - +
Z851024 + - - + - +


    L-    
850003 - - - - - + -
Z851004 + - + + + + +
Z851007 + + + + + + +
Z851010 + + + + + + +
850011 + - + + + + +
840018 - - + - - + +
Z851020 + - - + + + +
Z851023 + + + + + + +
850040 + + + + + + +
850070 + + + + + + +
850008 + + - + + + +
Z851013 - - - - - - -
Z851024 + + + + + + +

表 3 13 株菌对部分碳源的利用
张迎春等：西藏卡拉山土样中放线菌的多相分类研究 181
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
从表 2 可以看出，明胶液化结果显示阳性的菌株占 77.8％，牛奶凝固和胨化及产硫化氢阳性的菌株均
占 46.1％，而淀粉水解阳性的菌株占 30.3％。 所有的菌株均无水解纤维素的能力。 从表 3 可以看出，所有的
供试菌都能利用 D-半乳糖，大多数能利用蔗糖、菊糖、L-阿拉伯糖、柠檬酸钠、淀粉、麦芽糖和葡萄糖。
同时测定了供试菌对 50μg/ml、l50μg/ml 和 300μg/ml 3 种不同浓度氯霉素、卡那霉素、红霉素和新霉素
的抗性。4 株菌对于 300μg/ml 的氯霉素有抗性，3 株对 300μg/ml 的新霉素有抗性。所有的菌株对 300μg/ml
的红霉素有抗性，但对卡那霉素敏感，在含 50μg/ml 卡那霉素的培养基里不能生长。
2.3 细胞壁化学成分分析
全细胞壁氨基酸分析表明，所有检测菌株的全细胞壁水解液均含 LL-DAP、天冬氨酸 、谷氨酸和甘氨
酸，属于细胞壁Ⅰ型。 全细胞壁糖成分分析表明，所有菌株都含有木糖和核糖，部分菌株还含有甘露糖、阿
拉伯糖、葡萄糖等（表 4）。

   Gl      
850003 - + - - + - +
Z851004 - - - - + - +
Z851007 - - - + + - +
Z851010 + - - - + - +
850011 - + + - + - +
850018 - + - + + - +
Z851020 + - + - + - +
Z851023 - - - + - - +
850040 - - - + + - +
850070 - + - - + - +
850008 - - + - + - +
Z851013 - + + - + - +
Z851024 - - + - + - +

表 4 13 株菌的全细胞壁水解液糖成分
2.4 菌株 16S rDNA 序列分析
对 13 株菌的 16S rDNA 进行了扩增和测序。13 株菌的序列
长度均在 1 400bp~1 500bp 之间，与 GenBank 中已知序列比对，
发现它们均属于链霉菌属（Streptomyces）。 将这 13 株菌的 16S
rDNA 序列与链霉菌属中相关种序列比对后构建了系统发育树
（图 2）。 从图 2 可以看出 ， 菌株 Z851010、Z851004、850011 和
850070 聚成一个小群 ， 它们之间的相似性达到 95% ， 其中
850070 与 Streptomyces sp.YIM26 最相似 ， 相似性达到 98% ；
Z851013 和 Z851024 聚成小群， 它们之间的相似性达到 100%；
850008 和 Z851020 聚成小群，它们的相似性达到 95%；Z851007
和 850040 聚成小群；840018 处于一个独立的分支， 与 Strepto-
myces rishiriensis 的相似性达到 99%；850003 处于一个独立的
分支，与 Streptomyses cyanoalbus 的相似性达到 99%；Z851023 也
处于一个独立的分支， 与 Streptomyces albus subsp.albus 的相似
性达到 99%。
3 讨论
从土样中分离到的放线菌数量比较少，这可能与唐古拉山的地理位置和气候条件有关。 唐古拉山海拔
图 2 依据 16S rDNA 序列构建的 13 株菌株
及其相关种、属的系统发育进化树
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2008年第 6期
高，气温低，长时间冰雪覆盖，封冻期长达半年以上，有可能影响放线菌的活动，使得土壤中菌数偏少，这与
张晓琳、朱铭莪等人的研究结果相同 [9]。
从形态、生理生化特性和系统发育的结果来看，全部菌株都属于链霉菌属，这可能与分离方法和培养
条件有关。 土样中可能有稀有放线菌存在，如果采用一些特殊方法如低温培养，分离到的放线菌数量和种
类可能增加。 13 株菌液化明胶能力较强，其中具有牛奶凝固和胨化及产硫化氢阳性的菌株均占 46.1％，淀
粉水解阳性的菌占 30.3％，表明西藏地区放线菌是生产蛋白酶和淀粉酶等制剂的重要资源。
从测试菌的糖成分分析结果可以发现，很多种都含有特征性糖，这与现有化学分类系统里关于链霉菌
属不含有特征性糖的说法相矛盾，这种现象在 Wellington 等 [10]，刘志恒等 [11]和颜霞等 [12]的研究中也存在，表
明放线菌化学分类系统存在着缺陷，还需要进一步改善。
从系统发育结果来看，虽然 13 株供试菌都属于链霉菌属，但从形态和生理生化特性上分析，几种供试
菌同已知菌存在着差别，有些可能属于其变种，可通过 DNA-DNA 杂交来确定它们的地位。 比如，850040 与
Streptomyces humidus 的相似性有 96％，但生理生化方面 Streptomyces humidus 不产生色素，850040 却产生可
溶性色素；Streptomyces humidus 不产生硫化氢，而 850040 产生硫化氢等等，还存在很多差别。 因此，850040
有可能是新种或者已知种的变种，值得进一步研究。
参考文献
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5 Shirling EB，Gottieb D.Int J System Bacteriol，1966，16：313~340.
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11 刘志恒，张亚美，阎逊初，等.微生物学学报，1985，25（2）：170~172.
12 颜霞，薛泉宏，朱铭莪.西北农林科技大学学报（自然科学版），2007，35（10）：213~218.
张迎春等：西藏卡拉山土样中放线菌的多相分类研究 183