全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
巨噬细胞特异性启动子 /抗菌肽 PR39基因
腺病毒载体的构建及其表达
余雪梅 文阳安 李朴 孔飞飞 陈光辉 邱欣欣 涂植光
(重庆医科大学医学检验系,重庆 400016)
摘 要: 旨在构建由巨噬细胞特异性启动子调控的抗菌肽 PR39基因腺病毒表达载体, 检测目的基因在小鼠巨噬细胞
RAW 2647中的表达。 PCR扩增巨噬细胞启动子 /抗菌肽 PR39成熟肽基因序列, 插入腺病毒穿梭载体 pAdT rack中, 重组穿梭
质粒 ( pAdT rackSP /PR39)与腺病毒骨架 ( pAdEasy1)共转化大肠杆菌 BJ5183, 通过细菌内同源重组产生重组腺病毒载体
( pAdSP /PR39)。 pAdSP /PR39经 Pac I线性化后转染 293细胞, 包装出重组腺病毒 ( AdSP /PR39)。AdSP /PR39感染小鼠
巨噬细胞 RAW 2647, 经 RTPCR和免疫细胞化学检测 PR39的靶向表达特异性。成功构建了由巨噬细胞特异性启动子调控
的抗菌肽 PR39基因腺病毒表达载体。包装出的重组腺病毒仍然能感染小鼠巨噬细胞且高效表达抗菌肽 PR39。构建的重组
腺病毒能够在巨噬细胞中表达抗菌肽 PR39基因,为靶向表达抗菌肽在胞内菌感染治疗中的应用奠定了基础。
关键词: 抗菌肽 PR39 腺病毒载体 胞内菌
Construction of an Adenovirus Expressing Vector of Antim icrobial
Peptides PR39 andModulated byMacrophagespecific Promoter
and Its Target Expression in RAW2647 Cell
Yu Xuem ei W en Yangan L iPu Kong Fe ifei Chen Guanghui Q iu X inx in Tu Zh iguang
(D epartm ent of LaboratoryM edicine, Chongqing M edical University, Chongqing 400016)
Abstrac:t Th is study w as to construct an adenov irus expressing vector o f antim icrob ia l peptides PR39 m odu la ted by mac rophage
spec ific prom oter, and observe its expression in m ouse m acrophage RAW264 7 ce lls. PR39 and mac rophage spec ific promo ter gene
w as amp lified w ith PCR and inserted into adenov irus shuttle vecto r pAdT rack, w hich was co transform ed intoE. co li BJ5183. InE. coli
BJ5183, recomb ination occurred to obta in recomb inan t adenov irus vector ( pAdSP /PR39), w hich was used to transfect 293 ce lls after
linearized byP ac I to obta in recomb inant adenov irus AdSP /PR39. RTPCR, imm unocy tochem istry and antim icrob ial activ ity testw ere
app lied to de tect the expression of PR39 gene in m ousem acrophageRAW 2647. Recomb inant adenov irusm odulated by a mac rophage
spec ific prom oter and encoding antim icrob ia l peptide PR39 w ere successfu lly constructed, wh ich could infect RAW264 7 ce ll effic ient
ly, and expressed antim icrobial peptides PR39 gene. Recomb inant adenov irus AdPR39 is m acrophagespec ific, w hich can express an
tim icrob ia l peptide PR39 in mousem acrophage RAW 2647 ce l.l Our study has prov ided a founda tion o f in trace llular bacter ia l in fection
therapy w ith targe t expression o f an tim icrob ia l peptides.
Key words: Antim icrob ial peptide PR39 Adenov irus Intracellu lar bac teria
收稿日期: 20100405
基金项目:国家自然科学基金 ( 30600790 )
作者简介:余雪梅,硕士,研究方向:抗菌肽生物活性研究; Em ai:l yu jik eer2004@ yahoo. cn
通讯作者:涂植光,从事医学微生物及临床生化检验方面的研究; Em ai:l tuzhiguang@ yahoo. com. cn
目前构成全球性威胁的疾病如结核、A IDS、肝
病等均与细胞内感染有关。在很多情况下巨噬细胞
虽能吞噬胞内致病微生物,但不能彻底杀灭它们,胞
内菌反而在细胞内生存、繁殖 [ 1 ]。另外, 由于大多
数抗菌药在细胞内的浓度低, 导致胞内菌不能被有
效杀灭, 容易导致毒副反应的发生和耐药性的出
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
现 [ 2]。因此, 针对胞内菌感染的治疗, 新型抗菌药
物和治疗方法的开发显得尤其重要。
PR39是抗菌肽 cathelic id in家族中的一员,对细
菌 (如结核分支杆菌、伤寒沙门菌等 )具有广谱的抗
菌作用,而且不易诱导细菌耐药 [ 3, 4]。因此, 在细菌
感染的治疗中, 具有多方面优势。目前已有文献报
道成功构建了抗菌肽基因 PR39的真核表达载体,
并在小鼠巨噬细胞 RAW2647中成功表达了抗菌
肽,发挥了杀灭胞内菌的作用 [ 5]。但是抗菌肽也有
一定毒副作用, 会对机体正常细胞产生损伤。为减
少抗菌肽对机体正常细胞的毒副作用, 增强目的基
因表达特异性和基因治疗靶向性, 本研究拟构建靶
向巨噬细胞高效表达抗菌肽 PR39的腺病毒载体,
探讨其在小鼠巨噬细胞 RAW2647中的靶向性表
达,为研究抗菌肽 PR39在胞内菌感染基因治疗新
途径奠定基础。
1 材料与方法
11 材料
骨架质粒 pAdE asy1和大肠杆菌 B J5183由美
国芝加哥大学分子肿瘤实验室何通川教授馈赠。大
肠杆菌 DH5、腺病毒穿梭质粒 pAdTrack、小鼠巨噬
细胞 RAW 2647、293细胞由本室保存。含巨噬细
胞启动子和抗菌肽 PR39基因的真核表达载体 pSP
PR39由本课题组构建。抗菌肽 PR39多克隆抗体
由本课题组制备。质粒提取试剂盒、高保真酶 Prim
erS tar、DNA M arker、胶回收试剂盒、T4 DNA连接酶、
RTPCR试剂盒、RNA提取试剂盒和各种限制性内
切酶等购自大连 TaKaRa公司。 Lipofectam in2000脂
质体购自美国 Inv itrogen公司。免疫组化检测试剂
盒购自中杉金桥公司。
12 重组腺病毒载体的构建
以质粒 pAdTrackCMV 为模板, 以 po lyA:f 5
GAAGATCTCGCGTTAAGATACATTGATG3 、po lyA r: 5
GGGGTACCTGGAGTTCGTGACCGCCG3 为 引物 扩增
po lyA尾巴序列。扩增产物用限制性内切酶Kpn I和Bgl
II双酶切后插入载体 pAdTrack。得到的重组质粒进行
双酶切和测序鉴定,命名为: pAdTrackpo lyA。以质粒
pSPPR39为模板,以 spPR39:f 5 CGTATTCTCGAGATG
CATTAGGTATTAATAAG3 和 pTrack ( CMV ) down: 5
GGGGTACCAAGCTTTCATTAGGGGAATCTGGGAG3 为引
物, 扩增巨噬细胞特异性启动子和 PR39基因序列。
经 Xho I和 Kpn I双酶切后插入载体 pAdTrack
po lyA,得到重组穿梭质粒。进行双酶切和测序鉴
定, 命名为: pAdTrackSP /PR39。重组穿梭质粒经
Pm e I酶切线性化后, 转化含腺病毒骨架质粒
pAdE asy1的大肠杆菌 BJ5183( AdE asier ce ll) ,筛出
重组腺病毒质粒 ( pA dSP /PR39)。同上法另构建不
含目的基因的腺病毒质粒对照 ( pA dC)。
13 重组腺病毒的包装、纯化和滴度测定
按 5 !105 /孔将 293细胞接种于 6孔板内,待密
度达到 75%左右进行转染。用 Pac I酶切重组腺病
毒质粒并纯化回收,按照 Lipo fectam in2000使用说明
转染 293细胞。约 10 d后收集细胞,经反复冻融裂
解之后得到含腺病毒颗粒的上清液,不断扩增病毒,
数轮后收集的腺病毒颗粒用氯化铯密度梯度离心
纯化。
按 1 ! 105 /孔将 293细胞接种于 24孔板, 待
融合至 80%左右时参照江千里等的方法 [ 6]进行病
毒滴度测定, 将病毒作倍比稀释, 分别取 100 L
感染细胞, 1 h后换液继续培养。在荧光显微镜下
计数, 一个发绿色荧光的细胞视为一个表达单位
( expressionform ating un its, efu ) , 计算病毒滴度。
病毒滴度 ( efu /mL) = 发荧光的细胞数 !病毒稀释
倍数 /0 1。
14 重组腺病毒感染小鼠巨噬细胞 RAW2647及
PR39基因表达的检测
重组腺病毒对小鼠巨噬细胞 RAW2647最佳
感染复数 ( mutip licity of infection, MO I)的确定: 按 5
! 105 /孔将小鼠巨噬细胞 RAW2647接种到 6孔板
中, 培养 2- 4 h。待细胞贴壁后, 将腺病毒 AdSP /
PR39分别以不同的感染复数 ( 1、5、10、25、50、100、
200、300)感染细胞。用荧光显微镜观察绿色荧光
蛋白表达情况,计算感染效率,绘制感染效率 -感染
复数曲线图。
分别用重组腺病毒 AdSP /PR39和对照病毒
AdC感染小鼠巨噬细胞 RAW2647, 感染复数为
100, 用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况。
提取细胞总 RNA, RTPCR检测 PR39基因 mRNA
水平表达情况。免疫细胞化学方法检测 PR39基因
蛋白水平表达情况:细胞爬片经 40 g /L多聚甲醛固
202
2010年第 10期 余雪梅等 :巨噬细胞特异性启动子 /抗菌肽 PR39基因腺病毒载体的构建及其表达
定, PBS清洗; 3% H 2O2灭活内源性过氧化物酶, PBS
清洗; 封闭后加一抗, 4∀ 孵育过夜, PBS清洗;加二
抗, 37∀ 孵育 30 m in, PBS清洗; DAB显色, 苏木精
复染; 封片; 显微镜下观察目的基因的表达。
2 结果
21 重组穿梭质粒和重组腺病毒质粒的构建和鉴定
腺病毒穿梭质粒 pAdT rack的多克隆位点不含
启动子和 po lyA尾。以质粒 pAdT rackCMV为模板,
PCR扩增出了 po lyA尾巴序列,经 Kpn I和 Bg l II双
酶切后插入载体 pAdTrack。用双酶切和测序进行
鉴定, 结果正确 (图 1) ,命名为 pA dTrackpo lyA。
以质粒 pSPPR39为模板, PCR扩增出了巨噬细
胞特异性启动子和 PR39基因序列, PCR扩增产物经
Xho I和Kpn I双酶切后插入载体 pAdTrackpo lyA,构
建了含巨噬细胞启动子和 PR39基因的重组穿梭质
粒。该重组穿梭质粒经 Xho I和 Kpn I双酶切和测序
鉴定,结果正确 (图 2),命名为 pAdTrackSP /PR39。
MDL 2000m arker; 1.质粒 pAdT rackpo lyA; 2.质粒 pAdT rack
图 1 重组穿梭载体 pAdTrackpolyA
双酶切鉴定结果
M. DL 2000m arker; 1.重组穿梭质粒 pAdTrackSP /PR39;
2. 穿梭质粒对照 pAdT rack
图 2 重组穿梭载体 pA dTrackSP /PR39
双酶切鉴定结果
重组穿梭质粒 pAdT rackSP /PR39及穿梭质粒对照
pAdT rack分别用 Pm e I酶切线性化后转化感受态
AdEasier ce ll。穿梭质粒和骨架质粒在细胞内发生
同源重组,得到腺病毒质粒,并命名为 pAdSP /PR39
和 pAdC。
22 重组腺病毒的包装、扩增、纯化和滴度测定
用限制性内切酶 Pac I酶切重组腺病毒质粒,
酶切产物回收纯化后转染 293细胞。转染后 2 d
可见绿色荧光蛋白的表达, 随后几天荧光强度逐
渐增加。转染后 10- 12 d, 293细胞发生病变, 部
分细胞从瓶壁上脱落。此时收集细胞, 经 37∀ /-
80∀ 反复冻融后, 离心收集上清中的病毒液。用
初代病毒再次感染 293细胞, 次日能观察到 293细
胞中大量绿色荧光蛋白基因的表达 (图 3)。表明
已经成功包装出了腺病毒, 并具有较高的感染能
力。包装出的腺病毒分别命名为 AdSP /PR39和
AdC。进一步扩增收集腺病毒, 并将腺病毒初液
用 C sC l密度梯度离心的方法纯化。纯化后的腺病
毒采用空斑法测定病毒滴度, 测得的病毒滴度分
别为 5 ! 1011 pfu /mL ( A dSP /PR39 )和 2 ! 1011
pfu /mL( AdC )。
图 3 293细胞感染重组腺病毒后荧光显微镜
观察 GFP表达 (A. AdSP /PR39; B. AdC )
23 重组腺病毒在小鼠巨噬细胞 RAW2647中的
表达和检测
重组腺病毒 AdSP /PR39感染小鼠巨噬细胞
RAW 2647后, 胞浆内可见较多绿色荧光蛋白表达
(图 4), 表明构建的腺病毒能够有效感染小鼠巨噬
细胞 RAW2647并表达 GFP基因。用不同的感染
复数的腺病毒感染细胞, 腺病毒的感染效率与感染
复数成正相关 (图 5)。
203
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
图 4 巨噬细胞 RAW264 7感染腺病毒后
荧光显微镜观察 GFP表达
图 5 腺病毒 AdSP /PR39对巨噬细胞
的感染效率
用重组腺病毒感染小鼠巨噬细胞 RAW2647,
次日收集细胞提取总 RNA。用 RTPCR扩增 PR39
基因, 产物用琼脂糖凝胶电泳分析, 结果显示: Ad
SP /PR39感染后的小鼠巨噬细胞 RAW 2647中,可
以扩增出约 150 bp左右的目的条带 (图 6), 与理论
预测值相符。表明构建重组腺病毒感染巨噬细胞
RAW2647后能够在 mRNA水平有效表达抗菌肽
PR39基因。
M. DL2000 m ark er; 1- 2. AdSP /PR39感染小鼠巨噬细胞
RAW 2647后; 3. AdC感染小鼠巨噬细胞 RAW 2647后
图 6 感染腺病毒的巨噬细胞 PR39
基因表达检测
用重组腺病毒 AdSP /PR39感染小鼠巨噬细胞
RAW2647, 用免疫细胞化学技术检测抗菌肽 PR39
基因蛋白水平表达。结果表明感染重组腺病毒 Ad
SP /PR39的巨噬细胞中 PR39基因有较高的表达,而
转染对照病毒的细胞则无目的基因表达 (图 7)。
A.感染重组腺病毒 AdSP /PR39的 RAW 2647细胞;
B.感染对照病毒 AdC的 RAW 2647细胞
图 7 感染腺病毒的 RAW 2647细胞
免疫细胞化学结果
3 讨论
细胞内感染是病原微生物感染的重要方式之
一。胞内寄生菌感染机体之后, 主要被巨噬细胞吞
噬, 那些不能被机体免疫系统清除而潜伏下来的细
菌也主要寄生于巨噬细胞中。在哺乳动物细胞中导
入抗菌肽基因并让其高效表达是治疗细菌感染的有
效方式 [ 7, 8]。而本研究将抗菌肽基因导入巨噬细
胞, 增强其杀灭胞内菌的能力也将成为治疗胞内感
染的一种新方式。
基因治疗是将人类正常基因或者具有治疗作用
的外源性基因,通过一定的基因转运系统导入人体
靶细胞,表达具有功能的蛋白质, 以达到治疗疾病的
目的。但是,由于基因治疗的载体往往缺乏靶向性,
当载体进入机体后表达的目的基因往往会对正常组
织细胞产生毒副作用,造成机体损伤。所以,基因治
疗的靶向性是决定基因治疗成功与否的关键点之
一 [ 9]。巨噬细胞靶向性基因表达的主要原理就是
用巨噬细胞特异性启动子来启动目的基因的表达,
使目的基因的表达仅限于巨噬细胞, 从而减轻其对
正常组织细胞的损伤。
本试验中,我们采用靶向基因治疗策略,成功构
建了巨噬细胞特异性启动子 /抗菌肽 PR39基因腺
病毒载体,转染巨噬细胞, 在 mRNA和蛋白水平检
(下转第 209页 )
204
2010年第 10期 姜文国等:基于 41BBL和 CD3双信号的融合蛋白协同抗肿瘤作用研究
体外杀伤活性试验表明联合应用比单独使用 dia
body或者 41BBL /CD20更能有效导致肿瘤细胞杀
伤。应用裸鼠移植瘤模型也表明联合应用人 4
1BBL / CD20融合蛋白和抗 CD20 d iabody能明显抑
制肿瘤生长。充分说明基于 41BBL和 CD3双信号
的协同抗肿瘤作用能更有效地激发 PBLs的活性,
从而清除肿瘤。
参 考 文 献
[ 1] C ochloviu s B, K ipriyanov SM, S tassarM J, et a.l Treatm en t of hu
m an B cell lym phom a xenograftsw ith a CD3 x CD19 diabody andT
cells. J Imm unol, 2000, 165( 2 ): 888895.
[ 2 ] X iong D, Xu Y, L iuH, et a.l E ff icient inh ib it ion of hum an Bcell
lym phom a xenografts w ith an an t iCD20 x ant iCD3 b ispecific d ia
body. Can cer Lett, 2002, 177( 1 ): 2939.
[ 3 ] Gao Y, X iong D, Y angM, et al. E f ficien t inh ib ition ofm u lt idrug
res is tan t hum an tum ors w ith a recomb inant b ispecific ant iPglyco
p rotein x an tiCD3 d iabody. Leukem ia, 2004, 18( 3 ) : 513520.
[ 4] L iu R, JiangWG, L iu F, et a.l C onstru ct ion and expression of hu
m an 41BBL /ant iCD20 fu sion protein. Ch in ese Jou rnal of C ellu lar
andM olecu lar Immunology, 2008, 24( 6) : 543545.
[ 5] Bukczynsk i J, W en T, W atts TH. Costim u lat ion of hum an CD28T
cells by 41BB ligand. Eu r J Imm uno,l 2003, 33( 2 ): 446454.
[ 6] J iang WG, X iong DS, Shao XF, et a.l C lon ing and express ion of
the extracellular dom ain of 41BBL. Ch in ese Journal of B iotechnolo
gy, 2005, 21( 5 ): 703707.
[ 7] H olliger P, M an zke O, Span M, et a.l Carcinoem bryon ic an tigen
( CEA) sp ecific Tcel l act ivat ion in colon carcinom a induced by an
t iCD3 x ant iCEA b ispecif ic d iabod ies and B7 x an t iCEA b isp ecific
fusion proteins. C ancer Res, 1999, 59( 12 ): 29092916.
[ 8] Coch lovius B, K ip riyanov SM, S tassar M J, et a.l Cu re of Burk itt s
lym phom a in severe comb in ed immunodeficiency m ice by T cells,
tetravalen t CD3 x CD19 tand em d iabody, and CD28 costim u lat ion.
C ancer Res, 2000, 60 ( 16) : 43364341.
(上接第 204页 )
测到携巨噬细胞株特异性启动子的重组腺病毒能够
靶向巨噬细胞高效表达抗菌肽 PR39基因。本研究
为抗菌肽 PR39在巨噬细胞胞内菌感染的靶向基因
治疗后续试验研究奠定了基础。
参 考 文 献
[ 1] L eem ans JC, Th epen T, W eijer S, et a.l M acrophages play a dual
role du ring pu lm onary tubercu los is in m ice. J Infect D is, 2005, 191
( 1) : 6574
[ 2] 罗家琴,李富祥,张以芳.抗胞内菌感染免疫及其治疗.微生物学
杂志, 2004, 24( 2) : 4649.
[ 3 ] Gennaro R, Zanett iM, B eain casa M, et a.l Prorich ant im icrob ial
pep tid es from an im als: structu re, b iological fun ct ion s and m echa
n ism of action. Cu rr Ph arm Design, 2002, 8( 9) : 763778.
[ 4] Wu JP, Parngo C, Wu GF, et a.l PR39 inh ib its apoptos is in
hypoxic endoth elial cells. C ircu lat ion, 2004, 109( 13) : 16601667.
[ 5]文阳安, 郭金英,余晓林,等.抗菌肽 PR39真核表达载体的构建
及其在巨噬细胞中的表达和抗菌作用. 第三军医大学学报,
2008, 30( 21 ): 20442046.
[ 6] 江千里,王建民,温丽敏, 等.批量快速测定法测定标志基因为
GFP的重组病毒滴度. 第二军医大学学报, 2002, 23 ( 9 ):
10341035.
[ 7] Bals R, W ein er DJ, M oscion i AD, et a.l Augm entation of innate
h ost defen se by express ion of a cathelicid in ant im icrob ial pept ide.
In fect and Immun, 1999, 67 ( 11) : 60846089.
[ 8] Lee PHA, Ohtake T, Zaiou M, et a.l Expression of an add it ion al
cath elicidin ant im icrob ial p ept ide p rotects against bacterial sk in in
fect ion. Proc Nat lAcad S ciU SA, 2005, 102( 10) : 37503755.
[ 9] 高艳虹,李定国.基因治疗靶向方法的研究进展.中华内科杂志,
2006, 45( 5 ): 432434
209