全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 5期
白地霉遗传多样性与生态地理起源地的相关性分析
刘天明 王会会 王娟娟
(山东轻工业学院食品与生物工程学院,济南 250353 )
摘 要: 采用随机扩增多态性 DNA( RAPD )分子标记方法从 22个随机引物中筛选出 TubeB03、TubeB07、TubeB12三
个最佳引物分析来源于 7个省区的 23株白地霉的种内遗传多样性, 并用 UPGMA聚类分析法评价它们之间的亲缘关系。结
果表明, 不同来源地的白地霉通过 RAPD分析显示出较高的遗传差异性,并且, 在系统进化树上处于同一分枝的菌株来源于生
态地理相近的区域, 仅有个别例外。因此, 应用 RAPD分子标记技术对来自不同生态区的白地霉种内遗传多样性和亲缘关系
进行分析是可行的。
关键词: 白地霉 RAPDPCR 种内遗传多样性 亲缘关系
Relationship Analysis Between Genetic D iversity ofGeotrichum
candidum and Geographical Regions
L iu T ianm ing W angHu ihui W ang Juanjuan
(College of Food and B ioengineering, Shandong Institute of Light Industry, J inan 250353)
Abstrac:t The gene tic d ive rs ity of 23 Geo trichum candidum stra ins from 7 prov inces were studied w ith random amp lified po lymo r
ph ism DNA ( RAPD ) analysis by using 22 random prim ers. The best three prim ers w ere TubeB03, TubeB07, TubeB12. The genetic
re lationship among 23 stra ins w as analyzed by UPGMA m ethod. The result show ed that there was genetic d iversity be tw een stra ins from
d ifferen t reg ions, and the stra insw hich sha red the sam e cluster on the phy logenetic tree o rig inated from sim ilar eco log ica lgeog raphy are
as, on ly therew ere a few exceptions. H ence, RAPD is feasible on ana lyzing gene tic d ive rs ity and genetic re lationship o fGeo trichum can
d idum stra ins from var ious eco log ica l reg ions.
Key words: Geo trichum cand idum RAPDPCR Intraspecific g enetic d ive rsity Genetic re lationship
收稿日期: 20101119
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30970091)
作者简介:刘天明,男,教授,研究方向:微生物资源开发与利用工作; Em ai:l L iu tm 2008@ 163. com
并列第一作者王会会,女,硕士研究生,研究方向:生物工程; Em ai:l ahu i841225@ 163. com
白地霉 (G eotrichum cand idum )是一类形态特征
介于典型酵母菌和霉菌之间的真核微生物, 广泛分
布于世界各地的土壤中,具有生态适应性强,生长繁
殖速度快,单株白地霉有一定程度的表型可变性,而
不同菌株间存在高度的形态多样性, 利用传统分类
方法难于区分同种不同生态类型之间的遗传差
异 [ 1]。随机扩增多态性 DNA ( RAPD)分子标记技术
已被广泛的用于分子分型、基因定位和克隆等领域,
该方法不仅操作简单、灵敏度高,而且成本低和信息
丰富, 对展示微生物基因组间细微的遗传差异有独
特价值 [ 2]。
RAPD分子标记技术 [ 3, 4]是利用一系列 10个碱
基的随机引物对整个基因组 DNA进行 PCR扩增,
得到多个片段的指纹图谱用来显示菌株之间的微小
差异。本研究对来源于不同地区的 23株白地霉的
基因组 DNA用随机引物进行 RAPD扩增以获得指
纹图谱,旨在探讨白地霉种内菌株之间的遗传多样
性及亲缘关系,并为 RAPD分子标记技术在白地霉
生态地理演化研究方面的应用提供依据。
1 材料和方法
11 材料
111 菌株 试验所用白地霉菌株分离自七省区
农田土壤或葡萄果粒,现保藏于山东轻工业学院分
子生物学实验室, 26S rDNA D1 /D2区序列分析结果
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
显示其与模式菌株的同源相似率均在 994%以上
(表 1)。
表 1 白地霉试验菌株来源地和分类地位
菌株编号 来源地
26S rDNA D1 /
D2区序列 G en
Bank登录号
与白地霉
模式菌株
同源相似
率 (% )
X J45B 新疆石河子果园土壤 DQ664535 994
X J58A 新疆喀什泽普土壤 DQ849321 100
XZ12 西藏拉萨尼木县土壤 GQ227690 994
GS28B 甘肃天水秦安土壤 DQ862844 100
GS10A 甘肃定西岷县土壤 EF536930 998
GS38D 甘肃天水甘谷土壤 DQ862853 994
GS7C 甘肃陇南宕昌土壤 EF536928 100
GS6A 甘肃陇南两当土壤 HM754437 100
Q361b 青海黄南州土壤 HM754441 100
Q362 青海黄南州土壤 HM754442 998
Q12 青海互助嘉定镇土壤 HM754439 998
Q301 青海大通镇土壤 HM754440 998
Q542 青海民和古鄯土壤 HM754443 996
Q552 青海北山农场土壤 HM754444 100
NX5 宁夏玉泉营土壤 HM754438 100
SX70B 陕西咸阳玫瑰葡萄 EF536926 100
SX71A 陕西宝鸡土壤 EF536927 100
SD4c 山东济宁嘉祥土壤 HM754450 996
SD3a 山东青岛即墨土壤 HM754448 100
SD1a 山东枣庄滕州土壤 HM754445 998
SD2a 山东潍坊诸城土壤 HM754446 100
SD3b 山东青岛即墨土壤 HM754449 100
SD2d 山东潍坊诸城土壤 HM754447 100
对照模式
菌株 NRRL Y17569 U 40118 100
112 试剂 22个随机引物由上海生工生物工程
有限公司合成; 基因组 DNA提取和 PCR扩增试剂
购自 TaK aRa公司;常规试剂为国产分析纯。
12 方法
121 基因组 DNA提取 基因组 DNA提取采用
玻璃珠法 [ 5]。DNA纯度和完整性检测使用 08%琼
脂糖凝胶电泳。
122 PCR扩增及随机引物筛选 以各白地霉菌
株提取的基因组 DNA为模板,用 22个随机引物分
别进行 RAPDPCR扩增。反应体系: 10 PCR Buffer
5 L, M gC l2 ( 25 mmo l/L ) 4 L, dNTPs ( 25mo l/L )
4 L,随机引物 ( 5 mo l/L ) 2 L,模板 DNA 2 L, Taq
酶 ( 5 U /L) 06 L,用 ddH2O补至 50 L;采用分段
PCR扩增 程序: 94 5 m in, ( 94 3 m in, 35
15m in, 72 2 m in) 5个循环, ( 94 30 s, 35
1m in, 72 15m in) 30个循环, 72 5 m in。扩增
产物用 15%琼脂糖凝胶电泳检测, 拍照记录结果。
每个试验重复两次,选取条带清晰,重复性强,多态性
好的图谱统计分析。
123 聚类分析 对 RAPDPCR指纹图谱按 有
条带记为 1,无条带记为 0的原则统计,将谱带信息
输入计算机, 用统计软件 DPS转化为遗传距离矩
阵, 再按照 UPGMA方法用 MEGA软件构建聚类树
状图。
2 结果分析
21 引物的筛选
通过对模板 DNA加入量、退火温度等 PCR体系
因素进行优化,确定最佳 PCR扩增条件。在此基础
上用合成的 22条随机引物分别对 23个白地霉菌株
进行 RAPDPCR扩增和电泳图谱分析。结果表明,
TubeB03、TubeB07和 TubeB12三条引物的图谱不
仅条带清晰、重复性强,而且多态性好,对白地霉的遗
传多样性有很好的鉴别作用。其引物序列分别为:
TubeB03 ( 5CATCCCCCTG3)、TubeB07 ( 5GGT
GACGCAG3)和 TubeB12( 5CCTTGACGCA3)。
22 RAPD扩增结果
用筛选的 3个最佳引物 ( TubeB03、TubeB07
和 TubeB12)对 23个白地霉菌株基因组 DNA完成
RAPD扩增及电泳图谱分析。结果 (图 1)显示, 3个
引物对不同地理生态来源的 23个供试菌株 PCR
扩增, 产物片段长度均在 200 - 2 500 bp之间, 指
纹图谱不仅条带清晰, 而且在各菌株间不尽相
同, 存在菌株间的差异性。结果表明, RAPD分子
标记技术可用来区分白地霉种内菌株间的微小
遗传差异性。
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2011年第 5期 刘天明等:白地霉遗传多样性与生态地理起源地的相关性分析
A.引物 Tub eB03, B.引物 Tub eB07, C. 引物 TubeB12; 1- 24XJ45B, XJ58A, XZ12, GS28B, GS10A, GS38D, GS7C, GS6A, Q361b,
Q362, Q12, Q301, 100 bp DNA M arker; Q542, Q552, NX5, SX70B, SX71A, SD4c, SD3a, SD1a, Sd2a, Sd3b, Sd2d
图 1 23株白地霉的 RAPD扩增图谱
23 聚类分析
采用人工识读清晰谱带, 并将 23株白地霉的
RAPD电泳图谱条带转换为数据信息输入计算机,
建立 01数据矩阵, 然后用统计软件 DPS转化为遗
传距离矩阵, 再按照 UPGMA方法根据遗传距离矩
阵信息使用 MEGA软件构建聚类树状图展示各供
试菌株之间的亲缘关系 (图 2)。
由图 2可见, 当以遗传距离 013为划界标准
时, 23个菌株可划分为 6组。第 组: 1个菌株, 即
XZ12, 来自青藏高原南麓的拉萨; 第 组: 1个菌
株,即 Q542;第组: 1个菌株,即 Q361b都分离自青
藏高原东北部的青海; 第 组: 8个菌株, 分别为
GS10A、GS28B、XJ45B、Q301、Q 362、GS6A、GS38D
和 X J58A,分离自青海、甘肃和新疆 3个毗邻的干旱
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
生态区;第组: 2个菌株, 分别为 Q12, GS7C; 第
组: 10个菌株, 分别为 SD4c、Q552、SD3a、NX5、
SX70B、SX71A、SD1a、SD2a、SD2d和 SD3b, 分离
自以山东为主,还包括黄土高原陕西和宁夏的个别
菌株。按照遗传距离划分, 处于同一地理生态区的
菌株归于一组,它们的来源地域相近,而遗传距离较
远的菌株所处生态地理相隔较远; 但也有个别菌株
例外,如 NX5和 Q 552。这表明, 以 RAPD扩增指纹
图谱构建的聚类树状图可以较好地展示白地霉菌株
之间在生态地域上的亲缘关系。
图 2 23个白地霉菌株 RAPD扩增的聚类树状图
3 讨论
白地霉广泛分布于我国各生态环境中 [ 6] , 其表
型具有高度的多态性, 仅依据表型特征和生理生化
特征很难加以区分,而 Gente等 [ 7]研究表明,白地霉
菌株之间存在相当大的染色体长度多态性,因此,分
子生物学方法是研究白地霉遗传多样性的最佳途
径。有学者认为 RAPDPCR所用引物似乎定位在
单拷贝染色体位点上 [ 1 ] , 因此, 使用 RAPDPCR技
术时必须先从大量的引物中筛选最适引物, 再进行
PCR扩增。本研究所用引物即从 22个引物中筛选
出的 3个最佳引物来完成白地霉菌株间的遗传多样
性分析。
我国气候复杂多样, 东、西部地区环境差异很
大, 不同的生态条件为白地霉的自然进化提供了特
有的环境,收集并分析东、西部不同生态环境中白地
霉菌株的遗传多样性,比较不同菌株的遗传差异性
将为推测白地霉的演化特点提供可能性。
本研究以分离自我国东、西部 7省份的 23株白
地霉为材料,利用 RAPDPCR研究了白地霉的遗传
多样性。结果显示,各白地霉菌株之间存在一定的
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2011年第 5期 刘天明等:白地霉遗传多样性与生态地理起源地的相关性分析
遗传差异性,利用 RAPD可以将其区分开来,并且不
同来源的白地霉也显示出地区之间的差异性。在聚
类树状图上,来源于相似生态环境的菌株趋于归为
一组。例如,山东和陕西关中的菌株归为一组,这两
地的海拔和生态条件与其他几个省份有明显差异,
而它们彼此之间却高度相似;青海、甘肃和新疆三地
区的菌株归为一组,这三个地区的地理位置紧邻,生
态气候接近;西藏拉萨地处青藏高原南麓的高海拔
地区, 气候条件十分特殊, 其菌株与其他地域菌株的
遗传差异性较大。值得一提的是, 青海 6个菌株被
归到 5个组中,且彼此遗传距离差异性也较大, 这可
能是由于青海位于黄河上游,与很多省份毗邻,海拔
从西向东由高向低急剧过渡,其复杂多样的生态环
境导致微生物菌种之间存在很大的差异性。也有个
别菌株例外,例如宁夏 NX5, 青海 Q552却与陕西和
山东的菌株归为一组,这或许与大陆季风流向、动植
物迁徙及人类活动引发的微生物漂移有关, 有待今
后更广泛收集更多白地霉或其他酵母菌株进行深入
研究。
综上, 同种不同地理来源的白地霉菌株间存在
一定的遗传差异性,而相近地域菌株这种差异性小。
因此, RAPD分子标记技术不仅可用来分析白地霉
菌株的遗传多样性, 也有可能用于探索白地霉菌株
在生态地理上的亲缘演化关系。
23株供试菌株依据形态和 26S rDNA D1 /D2区
确定了分类地位,与起源于北美的模式菌株 NRRL
Y17569碱基同源性达到 994% - 100%。但据各
菌株 26S rDNA D1 /D2区碱基序列聚类分析所得结
果与生态地理来源地间并不存在明显相关性, 各菌
株间碱基差异无规律可循。由此推断,作为酵母类
微生物重要分类鉴定指标的 26S rDNA D1 /D2区序
列不适宜用于种内遗传起源关系划分指标。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫 )
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