全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
莱茵衣藻血红素加氧酶 1过表达载体的构建和遗传转化
王五姐1 魏渊源 1 刘兆普 2 杨志敏 1
( 1南京农业大学生命科学学院,南京 210095; 2南京农业大学江苏省海洋生物学重点实验室,南京 210095)
摘 要: 莱茵衣藻 (Chlamydom onas reinhardti)是一种 3套基因组都能进行遗传转化的真核生物, 作为一种模式生物,它
被用于生物学研究的各个领域。目前, 发现血红素加氧酶具有多种功能活性,但关于它的作用机理还不是很清楚。本研究利
用分子生物学技术, 构建了莱茵衣藻 HO1过表达载体, 用 Spe I和 Bgl II双酶切, DNA测序, GUS染色, PCR检测证明表达载
体构建成功。将此构建通过农杆菌介导法导入莱茵衣藻细胞中, 获得了能够稳定遗传的转化子。上述结果为后续进一步的
功能研究奠定基础。
关键词: 血红素加氧酶1(HO1) 莱茵衣藻 遗传转化 农杆菌
Expression Vector Construction ofHemeOxygenase1
from Chlamydomonas reinhardtii and Transformation
W angWujie
1 W eiYuanyuan1 L iu Zhaopu2 Yang Zhim in1
(
1
College of L ife Science, N anjing Agricultural University, N anj ing 210095;
2
TheK ey Laboratory of M arine Biology, J iangsu Province, NAU, N anjing 210095)
Abstrac:t The g reen a lg aChlamydom onas reinhard tii, a unicellu lar euka ryote has three genom es It is a va luablem ode l system fo r
b io log ical studyRecently, hem e oxygenase1( HO1) is shown to p laym ultiple ro les in biolog ica l processes, but the accurate functions of
its gene are large ly unknow n In th is study, w e constructed an expression vector harbor ing HO1 from Chlamydom onas rein
hardtiiD igestion w ith Spe I and Bgl II, DNA sequenc ing, GUS sta in ing and PCR detecting proved tha t theHO1 gene has been cloned
into the expression vectorThe constructs we re then transferred into the ce lls byAgrobacteriumm ediated m ethodRTPCR resu lts ind i
ca ted that the reorgan ized vector has wo rked we ll in the ce lls and expressed a great quan tity o fHO1 productsThe result o f the present
study lays the founda tion for the further research on function
Key words: H em e Oxygenase1( HO1) Chlamydomonas reinhard tii T ransform a tion Agrobacter ium tum efaciens
收稿日期: 20091026
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 20877041)
作者简介:王五姐,女,硕士研究生,主要从事藻类分子生物学的研究; Em ai:l 2007103014@ n jau edu. cn
通讯作者:杨志敏,教授, Te:l 02584395057, Em ai:l zm yang@ n jau edu cn
莱茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)是一种单
细胞真核绿藻,素有 绿色酵母!之称 [ 1, 2] ,具有生长
快、世代时间短、适应能力强和易于培养, 可以在平
板上形成单克隆,也能进行液体培养,遗传背景清晰
等优点,而且衣藻细胞结构简单﹑有与高等植物类
似的代谢途径,长久以来一直是研究植物光合作用、
叶绿体起源和代谢调控的模式植物 [ 3]。衣藻具有
核染色体、叶绿体和线粒体等 3套基因组,衣藻也是
少数 3套基因组均能进行遗传转化的植物之一 [ 4 ]。
长期以来,莱茵衣藻由于其自身的特点,一直被用作
遗传研究的材料, 研究分子生物学各种过程 [ 5, 6]。
为研究衣藻自身基因功能和外源基因表达, 目前已
经建立了几种比较成熟的衣藻核转化技术, 常用的
有: ( 1)基因枪法: 1988年, Boyn ton等 [ 7]首次采用基
因枪法成功将野生型 atpB基因导入 atpB衣藻缺陷
株的叶绿体中, 恢复了受体细胞的光合作用能力;
( 2)玻璃珠搅拌法: 1989年, K indle等 [ 8]通过玻璃
珠外源 DNA衣藻共振荡技术, 把硝酸盐还原酶基
因导入去壁的 nitl衣藻缺陷株中, 恢复了该突变株
的硝酸盐还原酶活性; ( 3)电穿孔法: 2002年, Lady
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
gin等 [ 9]通过电激法把潮霉素磷酸转移酶基因 ( hp t)
导入细胞壁缺陷的莱茵衣藻。hp t整合进衣藻核基
因组后,可以在衣藻中稳定表达和遗传; ( 4)激光微
束穿孔法; ( 5)多聚物介导法 [ 10, 11 ] ; ( 6)低能离子束
法等 [ 12]。这些方法共同点就是几乎都需要细胞壁
缺陷型突变株,而细胞壁缺失型不易培养,这对操作
带来很大麻烦。
农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌, 它含有
T i质粒, 能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤, 即诱
发冠瘿瘤。T i质粒上有一段转移 DNA ( transfer
DNA,又称 TDNA ), 在侵染植物时, 这段 DNA可
以插入到植物基因组中, 使其携带的基因在植物
中得以表达 [ 14]。由于 TDNA 能够进行高频率的
转移,而且 T i质粒上可插入大到 50 kb的外源基
因。 20世纪 80年代初科学家们首次利用根癌农杆
菌 (Agrobacterium tumefaciens)将外源基因导入植物
细胞并获得抗卡那霉素的植株 [ 13] ,此后这种方法受
到越来越广泛的应用。目前有报道农杆菌也可以介
导莱茵衣藻的核转化 [ 16 ] ,它可直接转化野生型藻细
胞,且转化效率是玻璃珠法的 50倍。乙酰丁香酮
( acetosyringone, AS)是一类酚类物质, 可诱导农杆
菌 DNAv irus区激活, 从而具有侵染力, 提高转化
效率。
血红素加氧酶 ( heme oxygenase, HO)是催化血
红素降解的微粒酶系统, 催化降解血红素产生胆
绿素 ( b iliverd in )、一氧化碳 ( CO )和自由态的铁
( Fe) , HO有 3种同工异构酶, 分别是 HO1、HO2
和 HO 3。近年来有关植物体内 HO的研究发现表
明, HO具有抗炎症、抗氧化、抗凋亡等效应, 而且
在细胞调节和信号转导方面也起着重要作用 [ 17]。
HO1是诱导酶, 分子量为 32 kD, 可被血红素、氧
化应激、紫外照射、缺铁以及 GSH的耗竭等多种因
素诱导激活。在动物组织中关于 HO1的研究已
经很深入, 但在植物中的研究任很少。本研究旨
在构建莱茵衣藻 HO1过表达载体, 并通过农杆菌
介导法将其导入莱茵衣藻细胞中, 获得能稳定遗
传的转化子, 为后续进一步的功能研究奠定基础,
也为更深入的研究高等植物中 HO 1作用机理奠
定基础。
1 材料与方法
11 材料
1. 1. 1 藻种 莱茵衣藻 cc125由中国科学院武汉
水生生物所提供。
1. 1. 2 质粒 克隆载体 pMD19T (购于 T aK aRa
公司 )及具有 CaMV35S启动子和 NOS终止子的双
元表达载体 pCAMB IA1303, 由江苏农科院陈松研究
员惠赠。
1. 1. 3 培养基 TAP 培养基 ( g /L ): NH4 C l 04;
M gSO4 7H2O 01; CaC l2 2H 2O 0065; K 2HPO 4
00935; KH 2PO 4 0062; M gSO4 7H 2O 02465; T ris
base 2423; Hutner∀ s trace element 1mL。
1. 1. 4 试剂 RTPCR试剂、Taq DNA聚合酶、
dNTP;质粒提取试剂盒、核酸回收试剂盒 (购自博飞
生物公司 ) ; 限制性核酸内切酶 Spe I、Bgl II、T4DNA
连接酶 ( TaKaR a公司 ) ; 乙酰丁香酮;大肠杆菌 ( E
coli) DH 5和根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefacie
na ) EHA105(均为本室保存 )。
1. 2 方法
1. 2. 1 莱茵衣藻培养 TAP培养基 (固体培养时
加 15%的琼脂 ) , 于 250 mL的三角瓶中, 28# , 80
mmo l/m
2 s光照 12 h /d培养, 每天摇 3次。
1. 2. 2 细胞培养 LB培养基 (平板加 15% 的琼
脂 ) ,大肠杆菌细胞于 37# 培养, 农杆菌于 28# 培
养。保持细胞生长状态良好, 每次试验使用细胞均
处于对数生长期。
1. 2. 3 质粒 PMD19HO1的鉴定 氯化钙法制备
感受态细胞,质粒 pMD19HO1转化感受态大肠杆
菌, 涂平板 (Amp抗性 ) , 37# 过夜培养, 挑取阳性克
隆, 摇菌, 菌液 PCR检测条带是否正确,测序确定基
因是否正插入。若测序结果正确则提取质粒, 使用
小量质粒提取试剂盒提取。用 Sp e I /Bg l II双酶切
质粒, 1%琼脂糖凝胶电泳检测, 使用凝胶成像系统
分析酶切结果。
1. 2. 4 表达载体 pCAMB IA1303HO1的构建 按
胶回收试剂盒说明书分别回收经 Sp e I /Bg l II酶双
酶切后的质粒 PMD19HO1的小片段和 pCAM
B IA 1303的大片段。纯化后片段在 T4DNA连接酶
作用下进行连接。连接反应产物转化感受态农杆
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2010年第 2期 王五姐等:莱茵衣藻血红素加氧酶 1过表达载体的构建和遗传转化
菌,涂平板 ( Kan和 R if抗性 ) , 28# 培养 2 d, 挑取
阳性克隆, 摇菌, 菌液 PCR检测条带是否正确并送
测序。
1. 2. 5 农杆菌法转化衣藻 衣藻液体培养到对数
生长期,离心收集细胞至 107, 然后涂布于平板培养
基 (加 100 M 乙酰丁香酮 )上生长, 待长成草坪状
(约 2 d) , 用于侵染。同时开始大摇已转入重组质
粒的农杆菌,待浓度达到一定值 ( A600 = 05)离心收
集菌体,用加入了 100 M 乙酰丁香酮的液体 TAP
培养基重悬细胞; 取 200 L菌液加到平板藻上,
23# 共培养 2 d。共培 2 d后,用加 500 mg /L的头
孢的液体 TAP培养基将藻洗下收集藻细胞, 1 500
∃ g 8m in离心去上清, 反复操作多次直至上液清
澈 (因为菌细胞较小不易离下而在上清中被去
掉 )。将收集的藻重新悬浮细胞至 2 ∃ 106 - 3 ∃
10
6转入选择培养基 ( 500 mg /L头孢和 10 mg /L的
潮霉素 )筛选转基因藻, 一周后转化子长出, 于选
择培养基上继续继代培养保持转化克隆。
1. 2. 6 转化子鉴定 GUS染色观察。用 CTAB法
提取衣藻总 DNA。扩增 05 kb的潮霉素磷酸转移
酶 HPT 基因片段, 引物 5%ATCGCCTCGCTCCAGT
CAATG3% (正 向 引 物 ), 5%AGCTGCGCCGATG
GTTTCTACAA3%(反向引物 ), 进行 DNA水平分析。
提取总 RNA, RTPCR分析 HO1基因表达情况。
2 结果
21 莱茵衣藻血红素加氧酶 1编码区全长基因的
克隆
提取衣藻总 RNA, 用 RTPCR反应方法扩增血
红素加氧酶 1基因编码区 ( CDS)全长为 927 bp,加
上引物序列,长度约为 950 bp,装入 pMD19载体后,
挑取阳性克隆进行 PCR及酶切验证并测序, 结果所
获 DNA序列与 GenBank中收录的莱茵衣藻血红素
加氧酶 1(登录号: 5728227)序列几乎完全一致 (图
1)。
22 pCAMBIA1303 /HO1表达载体的构建
用限制性内切酶 Bg l II和 Sp e I双酶切质粒
pMD19 /HO1,电泳 (图 2)并回收目的片段。同时
pCAMB IA1303质粒 (图 3)也用相同的酶进行双酶
切,电泳回收大片段, 将回收的两部分片段进行定向
连接。连接产物转入大肠杆菌后经 Kan筛选, 阳性
克隆经 PCR及酶切鉴定含有与目的基因大小一致
的条带,同时送去测序验证, 结果比对分析序列几乎
完全一致,表明 HO1已成功插入表达载体 pCAM
B IA 1303(图 4)。
23 转化衣藻细胞报告基因 GU S的组织化学
活性检测
用 GU S作为报告基因有很多优点, 主要优点之
一就是易于观察。采用组织化学定位法分析, 首先
取 1mL转化细胞, 1 500 ∃ g离心 5m in收集细胞,
用 500 L GUS染液悬浮细胞, 37&C过夜。用 70%
的乙醇冲洗后即可用 40倍光学显微镜观察, 结果见
图 5,从显微镜下看到部分细胞被染成蓝色。从观
察结果可初步确定重组质粒已经转入衣藻细胞中,
且能够表达。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
图 4 pCAMBIA1303 /血红素加氧酶 1表达载体测序
箭头所指即 GUS阳性细胞
图 5 转化衣藻细胞 GUS组织化学染色检测
24 转化衣藻细胞 DNA水平分析
提取衣藻总 DNA, PCR扩增 05 kb的 HPT基
因片段,琼脂糖电泳检测, 观察电泳结果可知抗性藻
能扩出与质粒 DNA大小一致的条带, 而阴性对照扩
不出任何条带, 说明含有莱茵衣藻 HO1基因的重
组质粒已整合到衣藻基因组中,且获得能稳定遗传
转化子 (图 6)。
25 转化衣藻细胞表达水平分析
提取衣藻细胞总 RNA, 使用反转录酶 AMV合
成 cDNA第一链, 以转录产物作为 PCR扩增的模
板,扩增约 950 bp HO1基因的特异片段, 同时 18S
做内参对照, 1%琼脂糖凝胶电泳分析 RTPCR扩增
结果。观察电泳结果可知转化藻 HO1基因表达量
明显高于正常藻 (图 7), 说明重组质粒能在细胞中
过量表达 HO1。
1.阳性对照 (质粒 ) ; 2.阴性对照; 37.转化藻; 8.未加模板 (空白对照 )
图 6 PCR 分析 HPT基因
1.阴性对照; 24.转化藻
图 7 RTPCR鉴定基因表达
3 讨论
基因工程的目的是建立一个基因高效表达体
系, 从而更深入地研究其功能, 或获得有价值的蛋
白。本研究采用定向克隆法将莱茵衣藻 HO1基因
成功插入到真核高效表达载体 pCAMB IA 1303中。
pCAMB IA1303表达载体构建方法简便、不需要病毒
辅助、有 CaMV 35S启动子、表达效率高, 最重要的
是它有 GU S报告基因, 转染后可以直接在显微镜下
观察从而直观地了解转染效率, 并且它含有潮霉素
抗性基因,导入莱茵衣藻中后使衣藻具有潮霉素抗
性, 而衣藻本身对潮霉素敏感且不会产生具抗性的
自发突变株 [ 9]。
将 HO1基因用 Sp e I /Bg l II两种限制酶进行消
化, 形成两个不互补的末端, 彼此不能连接, 再将其
与用相同酶处理过的质粒载体 pCAMB IA1303相
连, 形成高比例且含预定方向的单倍体环状重组质
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2010年第 2期 王五姐等:莱茵衣藻血红素加氧酶 1过表达载体的构建和遗传转化
粒。在现有衣藻核转化中常用的有玻璃珠法或基因
枪法等,这些方法虽在衣藻转化中成功的得到应用,
但也有很多缺点,如转化效率不高, 且需去细胞壁,
或使用细胞壁缺陷型,而缺壁细胞不易培养,容易死
亡。本试验采用农杆菌介导衣藻核转化法在国内尚
属首次,且成功使重组质粒导入野生型莱茵衣藻细
胞内,并获得了能稳定遗传的转化子。此方法易操
作,不需要去细胞壁,可直接转化野生型细胞, 且转
化效率也很高,约是是玻璃珠法的 50倍。
用 GUS染色观察细胞变蓝,说明重组质粒已成
功导入细胞。用 CTAB法提取抗性藻 DNA, 用野生
型藻 DNA做阴性对照, 以质粒 DNA为阳性对照,
PCR扩增大小约为 05 kb的潮霉素磷酸转移酶
HPT基因, 电泳检测后发现, 抗性藻能扩出与质粒
DNA大小一致的条带, 而阴性对照扩不出任何条
带,说明重组质粒已整合到衣藻基因组中,表达水平
分析发现,抗性藻 HO1基因表达量明显高于正常
藻,说明重组质粒能在细胞中过量表达 HO1。从以
上结果可得出本试验已成功构建 HO1过表达载
体,且获得能稳定遗传的转化子,为后续进一步试验
奠定了基础。
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