全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 3期·技术与方法·
收稿日期：2008-10-06
基金项目：黑龙江省科技厅农业攻关项目，黑龙江省教育厅海外学人合作项目（1151hz022）
作者简介：宋晓宏（1980-），女，在读博士，研究方向：耐旱藓类抗旱分子机制；E-mail：sxh829@126.com
通讯作者：沙伟（1963-），女，教授，博士生导师，从事苔藓植物遗传学、分子生物学研究；E-mail：shw1129@163.com
cDNA 文库是基因文库的一种， 是指某种生物
在某一发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形
成的 cDNA 片段，与某种载体连接后转入受体细胞
中，进而形成的克隆的集合。 理论上代表了生物体
某一发育阶段的所有可表达的遗传信息，与基因组
文库相比，有着库小、易筛选且更能直接反映细胞
特征的优点。自 1976 年 Hofstetter[1]成功地构建了第
一个 cDNA 文库以来 ，随着 mRNA 提取方法 ，反转
录酶， 噬菌体包装等技术的大幅度改进，cDNA 文
库的构建技术也不断得到了完善与发展，已成为研
究功能基因组学的基本手段之一，是分离新的组织
特异基因，克隆新型细胞因子，研究不同发育阶段
及特定发育期基因表达变化最常使用的基因文库，
在植物抗病虫、抗逆境的分子生物学研究领域具有
广泛用途。近年来，一些新方法、新技术不断被研发
出来，使 cDNA 文库的构建更简便 、迅速 、高效 、高
质量，以满足研究的需要。
1 cDNA文库类型
cDNA 文库的构建作为当前真核生物分子生物
学研究和基因工程操作的基础，可根据不同标准进
行分类。依据起始 mRNA 经过预处理与否可分为非
标准化 cDNA 文库和标准化 cDNA 文库；依据第一
链反转录引物分为随机引物 cDNA 文库和 Oligo d
（T）cDNA 文库； 依据是否对文库克隆进行全长选
择分为普通 cDNA 文库和全长 cDNA 文库；依据载
体分为质粒 cDNA 文库、噬菌体 cDNA 文库和反转
录病毒 cDNA 表达文库。
1.1 全长 cDNA 文库
全长 cDNA 文库的构建是在普通 cDNA 文库构
建原理的基础上，着眼于真核生物 mRNA 5′端的帽
子结构进行设计的 ， 是从生物体内一套完整的
mRNA 分子经反转录而得到的 DNA 分子群体 ，是
cDNA文库技术在植物抗旱机制研究中的应用
宋晓宏 2 沙伟 1
（1齐齐哈尔大学，齐齐哈尔 161006；2东北林业大学，哈尔滨 150040）
摘 要： cDNA文库是指生物不同生长发育时期特定组织或器官所转录的全部 mRNA经反转录形成的 cDNA与
载体连接后形成的克隆的集合，在基因分离、克隆及功能研究中具有重要作用。就 cDNA文库构建及其在植物抗旱机制
研究中的应用进行综述。
关键词： cDNA文库 抗旱 EST 应用
Application of cDNA Library in Research of Plant Drought
Resistance Mechanism
Song Xiaohong2 Sha Wei1
（1Qiqihar University，Qiqihar 161006；2Northeast Forestry University，Harbin 150040）
Abstract： cDNA library is the pool of cDNA fragments which are ligated with vectors，and reverse -transferred
from total mRNAs of some organism at certain period. cDNA libraries play an important role in gene isolation，cloning
and gene function research . The paper reviewed the construction of cDNA library and application in the study on
mechanism of plant drought resistance.
Key words： cDNA library Drought resistance EST Application
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
mRNA 分子群的一个完整的拷贝。 全长 cDNA 文库
不仅能提供完整的 mRNA 信息，并可以通过基因序
列比对得到 mRNA 剪接信息，还可以对蛋白质序列
进行预测及进行体外表达和通过反向遗传学研究
基因的功能等 [2]。 有关全长 cDNA 文库构建的最初
报道是在 1994 年由 Kato 等 [3]提出的。 目前构建全
长 cDNA 文库的方法主要有 Oligo-Capping 法，CAP-
ture 法 ，SMART 法 ，Cap-trapper 法 ，Cap-Select 法以
及 CAP-jumping 法 [4]。 其中 SMART 方法技术成熟，
并已由 Clontech 公司开发出试剂盒。 基于该方法所
需的起始 RNA 量少，全长 cDNA 和长片段的 cDNA
含量高，无 rRNA 污染，代表性好，目前已广泛应用
于医学、植物学和动物学研究领域 [5~8]。
1.2 差减 cDNA 文库
差减文库也称扣除文库 ， 最早报道于上世纪
80 年代初期。 其构建的原理是从两种遗传背景相
同或大致相同但在个别功能或特性上不同的材料
（如不同基因处理细胞系，或植物的近等基因系等）
提取 mRNA（或反转录成 cDNA），在一定条件下以
远远过量但不含目的基因的一方为驱动子 （drive）
与含有目的基因的检测方 （tester）进行杂交 ，选择
性地除去部分共同的表达产物，收集未杂交目的产
物，并连接到载体构建成 cDNA 文库。
消减杂交是构建差减 cDNA 文库的核心，差减
文库的质量在很大程度上取决于消减杂交的效率 [9]。
目前，根据消减杂交的策略可以将差减文库的构建
方法分为以下几种 ： （1） 羟基磷灰石柱层析法
（HAP）；（2） 生物素标记——链亲和蛋白结合排除
法；（3） 限制性内切酶与 PCR 技术相结合的方法；
（4）抑制性消减杂交法（SSH）；（5）磁珠介导的差减
法（MAST），其中 SSH 法最为常用。
抑制性消减杂交是 Diatchenko 等 [10]于 1996 年
建立的以抑制性 PCR 和 DNA 扣除杂交为基础的
基因克隆技术， 后由 Clontech 公司将其商品化，并
开发出 SSH 试剂盒。 该技术的突出优点是假阳性
率较低，灵敏性好，检测效率高。 目前，SSH 技术已
成功运用于研究肿瘤组织或细胞的相关基因克隆，
机体各种疾病相关基因表达，生殖、发育、遗传相关
基因的克隆等方面 [11~13]。 近年来开始在植物生长发
育、组织特异性研究及抵抗各种胁迫（生物和非生
物）研究中广泛应用 [14~16]。
1.3 均一化 cDNA 文库
均一化 cDNA 文库又称等量化 cDNA 文库 ，指
某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含在文
库中， 且表达基因的 cDNA 的拷贝数相等或接近。
目前其构建方法主要有两种 [17，18]：一种是基于复性
动力学原理 ，在退火条件下 ，高丰度的 cDNA 复性
速度快， 而低丰度的 cDNA 复性需要很长时间，从
而通过延长复性时间使各种单链 DNA 分子的浓度
趋于均衡；另一种是基因组 DNA 饱和杂交法，通过
cDNA 与基因组 DNA 饱和杂交而降低在文库中高
拷贝存在的 cDNA 的丰度。
1.4 固相 cDNA 文库
固相 cDNA 文库由 Roeder[19]开发 ，大致与传统
的 cDNA 文库构建方法相同，只是在 cDNA 合成的
过程中引入了固定支持物，使 cDNA 通过一个生物
素固定在链霉素偶联的磁珠上 ， 并完成合成与修
饰。这样在反应过程中就可以简便而迅速地实现酶
和缓冲液的更换 ， 这一改进简化了 cDNA 合成步
骤，并且构建的文库质量高，包含了较小的 cDNA。
2 cDNA文库技术在植物抗旱机制研究中的
应用
植物在抵抗干旱胁迫时，会逐渐形成一整套极
其复杂的抗性机制， 整个过程的基因表达十分复
杂，因此有必要从整体水平研究干旱胁迫下基因的
表达情况。 EST 技术是近年来广泛应用的大规模、
高通量的研究基因表达的重要方法，其核心就是构
建 cDNA 文库。 近年来，由于 cDNA 文库在基因表
达、功能鉴定、克隆等研究方面的特殊优势，已广泛
用于植物抗旱机理的研究， 主要集中在利用 cDNA
文库进行抗旱基因的筛选与克隆，及抗旱基因表达
谱的建立等方面。
干旱胁迫是目前全球农业生产所面临的严重
问题， 也是制约我国农业和经济发展的重要因素。
据统计 ， 我国每年农作物受旱面积约 2 000 万~
2 600 万 hm2，成灾面积近 1 300 万 hm2，每年损失粮
食至少 150 亿 kg， 占各种自然灾害损失总量的
60%。 因此，为满足粮食需求，作为人类主要粮食作
物 ，水稻 （Oryza sativa L.）、小麦 （Triticum aestivum
L.）、玉米 （Zea Mays L.）的抗旱性研究显得尤为重
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2009年第 3期
要。 Markandeya 等 [20]以水稻幼苗为材料建立了干旱
诱导表达的 cDNA 文库，鉴定出可能与干旱胁迫有
关的基因 589 个， 同时利用 ESTs 软件确定了一些
干旱相关的数量性状位点（QTL），并证实了一些候
选基因；王建革等 [21]构建了干旱胁迫下旱稻幼苗的
差减文库，发现许多与抗旱相关的基因，如泛素交
联酶和谷胱甘肽还原酶等，进一步丰富了有关抗旱
机理的认识 ；同样以旱稻品种为材料 ，刘运华等 [22]
利用 SMART 技术成功构建了干旱胁迫诱导中 “旱
3 号” 全长 cDNA 文库， 为发掘和研究抗旱相关功
能基因奠定了基础；Way 等 [23]为分离鉴定小麦干旱
胁迫下差异表达基因，构建了干旱胁迫下小麦的正
反向差减文库 ， 从两个文库中分别分离了大约 2
500 个克隆，获得了 600 条 Unigene（正向库 500 条，
反向库 100 条），经微阵列及 Northern 分析表明，部
分基因在干旱胁迫下明显上调或下调表达；李会勇
等 [24]以耐旱自交系 CN165 为材料 ，利用 SSH 技术
构建了土壤干旱胁迫下玉米幼苗叶片的正向抑制
差减 cDNA 文库 ，筛选出大量抗旱相关基因 ，涉及
到植物代谢的多种途径，且许多 Unigene 是已知功
能的非生物胁迫诱导的基因，这充分说明干旱胁迫
反应和其它非生物逆境胁迫反应在分子水平上存
在着很大的相关性，在抗逆境的某些代谢途径上表
现一致； 为了研究水分胁迫引起基因表达的变化，
Zheng 等 [25]用 SSH 和 cDNA 微阵列技术分离玉米幼
苗受水分胁迫诱导的基因，分析表明 533 个克隆受
水分诱导表达，测序后经聚类分析和 BLAST 比对，
得到 190 个特殊的 EST 序列。
在林木研究中 ，柽柳属 （Tamarix L.）植物因其
分布特点及耐旱特性研究较多。 2005 年，刘桂丰等 [26]
利用 SSH 方法构建了干旱胁迫下刚毛柽柳 （Tama-
rix hispida Willd.）抑制性消减文库 ，通过对文库阳
性克隆的随机测序，获得了如 Mn-SOD、myb 相关蛋
白、锌指蛋白等 17 种与干旱胁迫相关的基因，生物
信息学分析表明它们涉及了植物的渗透调节、信号
传递、转录调控、活性氧清除等方面；同年，刘桂丰
等 [27]又以多枝柽柳（Tamarix ramosissima）为材料，构
建了其叶片正反向差减 cDNA 文库，随机测序及生
物信息学分析发现了许多已知的抗旱相关基因，如
信号传导类基因（钙调蛋白基因、钙依赖蛋白激酶
等）， 活性氧清除类基因 （谷胱甘肽还原酶基因 、
SOD 酶基因等），细胞防御类基因，蛋白质代谢类基
因，光合作用相关基因等，为柽柳重要抗旱基因的
选择和克隆奠定了基础；2007 年，蔡勤安等 [28]构建
了白花柽柳 （Tamarix albiflonum M.T.Liu.）抑制性消
减文库， 克隆出多个抗旱相关基因的 EST 片段，并
对这些 EST 片段进行了分析。 此外，Wang 等 [29]以抗
旱阔叶树黄柏为材料，通过差减文库的构建及生物
信息学分析 ，筛选出与抗旱相关的 EST 序列，如热
激同源蛋白，脱水应答蛋白，金属硫蛋白 II，LEA 蛋
白等，为抗旱基因的克隆及黄柏抗旱分子机制的系
统研究提供了依据。
干旱胁迫对植物生长有极大的伤害，然而一些
抗旱植物在长期的生物进化历程中，形成了一套独
特的适应恶劣环境的机制 ， 积累了丰富的抗旱基
因 ，通过构建抗旱植物 cDNA 文库 ，必将有利于发
掘、利用抗旱相关的重要基因。禾本科植物中，小米
（Setaria italica L. Beauv.） 因其耐旱特性比玉米、小
麦、高粱（Sorghum vulgare Pers.）有较高的水分利用
率 ，Zhang 等 [30]为阐明小米适应干旱胁迫的分子机
制 ， 构建了其干旱胁迫差减 cDNA 文库 ， 并通过
cDNA 微阵列分析对抗旱相关基因在干旱胁迫下的
表达进行分析；林凡云等 [31]利用 SSH 方法对干旱复
水条件下诱导的糜子 （Panicum miliaceum L.）特异
表达基因进行分离与分析， 结果有 32 个 cDNA 片
段与已知 cDNA 片段具有较高的同源性，且多数与
植物受到生物或非生物胁迫时的反应机制相关。
复苏植物作为一种古老的维管植物，能抵抗整
年干旱，再水化后又可以完全恢复，为更好的了解
其耐旱的分子机理，Gabriel 等 [32]构建了复苏植物复
活草（Selaginella lepidophylla）的 cDNA 文库，共获得
1 046 个克隆，代表 874 个转录本，通过与蛋白数据
库比对获得了部分与干旱耐受力相关的特异基因。
苔藓植物是自然界的拓荒者之一，许多属种具
有很强的耐旱能力，是进行植物抗旱性改良的重要
基因资源，如土生墙藓（Tortula ruralis）。1999 年 Wood
等 [33]建立了土生墙藓干旱组织核糖核蛋白 cDNA 文
库，测序表明，在 152 条 EST 序列中有 70%代表特
异序列，30％与已知基因有相似性， 有些与耐旱被
子植物的未知基因存在同源性，这表明苔藓植物中
宋晓宏等：cDNA文库技术在植物抗旱机制研究中的应用 59
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
可能存在大量新的 EST 克隆，深入研究有助于确定
植物组织脱水后细胞修复所必须的基因产物范围；
2004 年 Oliver 等 [34]又建立了土生墙藓快速干旱后
复水配子体 cDNA 文库， 鉴定了 10 368 条 EST，代
表 5 563 个基因， 通过蛋白质序列同源性比对，有
2 242 条为未知基因 ， 且文库中大部分序列编码
LEA 蛋白，这些蛋白在干旱组织再水化的恢复中起
重要作用。
此外，还有其它一些抗旱植物的研究 ，如南非
天然植物豇豆（Vigna unguiculata（L.）Walp），在其干
旱胁迫下的差减 cDNA 文库中 Gazendam 等 [35]筛选
出 4 160 个单克隆，初步分析有 2 个为已知的植物
抗逆基因，同时鉴定了一些候选基因，并对基因在
干旱胁迫下的差异表达情况进行了微阵列分析。斑
茅（Saccharum arundinaceum Retz.）是甘蔗（Saccharu-
m officenarum L.） 近缘野生植物之一， 在长期的环
境压力选择下形成了一系列适应干旱环境的特性，
刘文荣等 [36]以干旱胁迫下斑茅叶片为材料构建差
减文库， 通过随机对 16 个文库阳性克隆的测序及
分析表明， 其中 10 个与抗逆性相关，Northern 验证
表明部分克隆为干旱胁迫上调表达的 EST 序列，说
明文库质量较高， 为进一步利用 SSH 文库结合芯
片表达谱分析作物水分胁迫下的相关抗旱基因网
络奠定了基础。
3 小结
干旱是限制农业发展的重要因素，提高植物的
抗旱能力，挖掘植物抗旱相关基因已成为目前植物
遗传育种与品种改良研究的关键问题 。 近年来 ，
cDNA 文库技术已广泛用于植物抗旱性研究， 使人
们对干早胁迫分子机制的认识逐步加深，对抗旱分
子机理的研究逐步深入。相信随着分子生物学理论
和技术的发展，cDNA 文库技术将在植物抗旱相关
基因的分离、克隆、基因表达模式研究等领域发挥
更大、更广泛的作用。
参考文献
1 Hofstetter H，Schambock A，Van Den Berg J，et al. Biochim Biophys
Acta，1976，454（3）：587~591.
2 谢卡斌，张建伟，等.中国科学 C辑，2005，35（1）：6~12.
3 Kato S，Sekine S，Oh SW，et al. Gene，1994，150（2）：243~250.
4 毛新国，景蕊莲，等.遗传，2006，28（7）：865~873.
5 Du LX，Liu SF，Zhu J，et al. Agricultural Sciences in China，2007，
6（11）：1390~1395.
6 Skiba B，Ford R，et al. Physiological and Molecular Plant Pathology，
2005，66：55~67.
7 马金彪，王晓杰，等.植物病理学报，2007，37（3）：265~270.
8 Zhang YH，Qu ZP，Zheng WM，et al. Acta Phytopathologica Sinica，
2007，37（5）：487~499.
9 骆蒙，龙秀英，等.生物技术通报，2000，6：14~17.
10 Diatachenko L，Lauy FC，CampbellAP，et al. Pro Natl Sci USA，
1996，93：6025~6030.
11 Wentzensen N，et al. Int J Oncol，2004，24（4）：987~994.
12 Swearingen ML，et a1. Cnacer Lett，2003，198：229~239.
13 刘会宁，李剑，等.河北医科大学学报，2008，29（2）：165~169.
14 Ryo Tsuwamoto，et al. Planta，2007，225：641~652.
15 Namasivayam P，Hanke D. Plant Cell Tiss Organ Cult，2006，86：
417~421.
16 Wang HG，et al. Theor Appl Genet，2007，115：1109~1126.
17 Sasaki YF，Ayusawa D，Oishi M. Nucleic Acids Research，1994，
22：987~992.
18 Bonoldo MF，et al. Genomo Pes，1996，6：791~806.
19 Roeder T. Nucleic Acids Research，1998，26（14）：3451~3452.
20 Markandeya G，et al. Current Science，2005，89（3）：496~517.
21 王建革，等.江西农业大学学报，2007，29（1）：138~141.
22 刘运华，刘灶长，等.分子植物育种，2007，5（3）：367~370.
23 H Way，et al. Plant Sci，2005，168：661~670.
24 李会勇，黄素华，等.中国农业科学，2007，40（5）：882~888.
25 Zheng J，Zhao JF，Tao YZ，et al. Plant Molecular Biology，2004，
55：807~823.
26 刘桂丰，侯英杰，等.植物研究，2005，25（1）：69~73.
27 刘桂丰，侯英杰，等.东北林业大学学报，2005，23（5）：1~2，5.
28 蔡勤安，王玉成，等.农业生物技术学报，2007，15（2）：354~
355.
29 Wang HM，et al. Chin J Biotech，2008，24（2）：198~202.
30 Zhang JP，et al. Genomics，2007，90：121~131.
31 林凡云，胡银岗，等.农业生物技术学报，2006，14（4）：537~541.
32 Iturriaga G，et al. Plant Science，2006，170：1173~1184.
33 Wood AJ，et al. Plant Cell Physiol，1999，40：361~368.
34 Oliver MJ，et al. BMC Genomics，2004，5：89.
35 Gazendam I，Oelofse D. Water SA（Special Edition），2007，33
（3）：387~392.
36 刘文荣，张积森，等.作物学报，2007，33（6）：961~967.
60