全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第5期
收稿日期:2008-04-09
基金项目:广东省科技攻关计划资助项目(A20403)与河南省杰出青年基金项目(051200200)
作者简介:王新卫(1971-),男,河南泌阳人,博士后,主要从事分子病毒学研究
通讯作者:毕英佐,E-mail:yzbi@scau.edu.cn;何宏轩,E-mail:hehx@ioz.ac.cn
禽流感(Avianinfluenza,AI)是禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)引起的一种禽类(家禽和野禽)的
感染和/或疾病综合征。该病严重危害养禽业,也威胁人类健康。禽流感病毒属于正粘病毒科 A型流感病毒
属的主要成员。病毒具有 8个基因片段,编码 10种蛋白,其中结构核蛋白(Nucleoprotein,NP)高度保守,在
禽流感各亚型之间的同源性高达 90%以上,是主要的型特异性抗原[1~3],常作为临床检测 AI的诊断抗原,
在临床诊断上具有重要意义。
T4噬菌体展示系统(T4phagedisplay)是利用 T4噬菌体衣壳表面上的 2个非必需外壳蛋白 SOC(smal
outercapsidprotein)和 HOC(highlyantigenicoutercapsidprotein)建立起来的双重 T4SOC-HOC蛋白展示系
禽流感病毒核蛋白在噬菌体表面的展示
王新卫 1,2,3 何宏轩 2 毕英佐 1 马静云 1 王宪文 1 詹爱军 1
(1华南农业大学动物科学学院,广州 510642;2中国科学院动物所 动物生态与保护生物学院重点实验室
国家野生动物疫病研究中心,北京 100101;3河南农业大学牧医工程学院,郑州 450002)
摘 要: 利用 PCR技术,扩增禽流感病毒(AIV)核蛋白基因片段,将其克隆至pR质粒的T4噬菌体 SOC基因C
末端获得重组质粒pR-np,以此重组载体转化大肠杆菌Escherichiacoli2(E2),用溶菌酶缺陷噬菌体 T4-z1感染重组E2
菌,重组载体与缺陷噬菌体T4-z1基因发生同源重组,将np基因整合到噬菌体基因组中,用PCR方法筛选重组噬菌体并
命名为T4-z1-np。经Westernblot免疫电镜与ELISA检测证实,T4-z1-np表达的NP融合蛋白具有免疫学活性。结果表
明,AIV核蛋白成功地在T4噬菌体表面展示,为禽流感防治奠定了基础。
关键词: 禽流感病毒 np基因 T4噬菌体 展示
DisplayofnpGeneofAvianInfluenzaVirusontheSurfaceof
BacteriophageT4
WangXinwei1,2,3 HeHongxuan2 BiYingzuo1 MaJingyun1 WangXianwen1 ZhanAijun1
(1ColegeofAnimalScience,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642;2NationalResearchCenterforWildlife
BornDiseases,KeyLaboratoryofAnimalEcologyandConservationBiology,InstituteofZoology,ChineseAcademyof
Science,Beijing100101;3ColegeofAnimalHusbandryandVeterinary,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002)
Abstract: A1320bpfragmentofnpgeneofAvianInfluenzaVirus(AIV)wasamplifiedbyPCR andclonedinto
theEcoR IsiteofpR vectortoobtainrecombinantplasmidpR-np.Therecombinantplasmidwastransformedinto
Escherichiacoli2(E2),thehostbacteriaofT4phage.AndthentherecombinantEcoliE2wasinfectedwithlysozyme-
defectedphageT4-z1.ThenpgenefragmentwasintegratedintotheSOCsiteofthegenomeofT4phagewithSOC-
deletedthroughhomologousrecombination.TherecombinantphagewasscreenedbyusingPCR anddesignatedasT4-
z1-np.TheresultsofSDS-PAGE,Western-blotandELISAshowedthatSOC-NPfusionproteinwasexpresedandcould
reactspecificalytohomologouspositiveserum.TheseresultsindicatedthatnucleoproteinofAIV wassuccesfuly
displayedontherecombinantbacteriophageT4,whichprovidedabaseforfurtherstudyonnewfunctionandcontrolof
AI.
Keywords: Avianinfluenzavirusnpgene T4phage Display
2008年第5期
统[4~6]。该系统在表达外源蛋白方面具有其独特的优点:表面 2个非必需蛋白 SOC和 HOC的数量分别达到
960和 160拷贝,与 SOC或 HOC融合表达的外源蛋白可在子代噬菌体释放时装配到噬菌体表面,二者缺
失不影响其感染性;表达的外源蛋白在宿主细胞内组装,不必通过细胞分泌,对某些具有毒性的蛋白质尤
其适用;T4噬菌体表达外源蛋白的容量大,在诊断试剂的研制、抗原抗体库的建立、重组亚单位疫苗的研
究等方面具有广阔的应用前景[7]。本研究旨在构建表达 AIV核蛋白的重组噬菌体,检测其免疫原性,为生
产新型的 AI检测抗原,进一步研究 AIV核蛋白的功能提供基础资料。
1 材料和方法
1.1 菌种和质粒
含有禽流感病毒 np基因的 NP-T重组质粒、pR整合质粒、大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5a、E2、BL-21
(DE3)由华南农业大学动物科学学院基因工程实验室保存。
1.2 病毒和抗体
溶菌酶缺陷型噬菌体(T4-z1)和野生型 T4噬菌体由美国马里兰州立大学任兆均惠赠;AIV广东分离株
(GD/5/01)由华南农业大学动物科学学院基因工程实验室分离鉴定(未发表)。AIV标准阳性血清购自哈尔
滨兽医研究所;酶标记兔抗鸡 IgY深圳百奥生物技术有限公司产品。
1.3 主要试剂
工具酶及试剂:ExTaqDNA聚合酶、EcoRⅠ、T4DNA连接酶、溶菌酶和 DNA片段快速纯化回收试剂盒
均购自中国大连宝生物 TaKaRa公司。预染蛋白质标准购自深圳百奥生物技术有限公司。
1.4禽流感病毒 np基因的 PCR扩增
根据 NP-T重组质粒中 np基因序列设计 1对引物,用于扩增删除其 C-末端部分序列、长度为 1320bp
的 np基因片段,并分别在 5′端加 EcoRⅠ限制位点(黑体部分):NP1和 NP2分别为 CAAGAATTCTATGATAA
CAATAGAGAGA和 TCGAATTCTCAATTGTCATACTCCT。扩增条件为 95℃预变性 3min;94℃45s,55℃45s,
72℃1.5min,30个循环;72℃后延伸 10min。扩增产物-20℃保存备用。
1.5 重组载体 pR-np的构建
用酚-氯仿抽提 PCR产物,EcoRI酶切消化,同法消化 pR质粒,用琼脂糖凝胶电泳回收 np基因片段
和 pR载体片段,在 T4DNA连接酶作用下连接后转化 DH5a感受态细胞。PCR方法筛选阳性重组菌。另用
pR质粒上的一段序列作为上游引物(pSOC-UP:GAATCATATGGCTAGTCTCGCGG)与 np基因下游引物进行
PCR扩增,选择插入方向正确的克隆,提取重组质粒用 EcoRⅠ进行酶切鉴定。取 PCR及酶切鉴定正确的
克隆送交上海博亚生物工程公司测序。重组整合质粒命名为 pR-np。
1.6 T4重组噬菌体的构建
T4-zl噬菌体的 SOC基因及溶菌酶(e)基因部分序列缺失,穿梭质粒 pR-np中含有缺失的序列,用 T4-
z1噬菌体感染含有 pR-np质粒的重组菌时,np基因与上述序列经同源重组整合到噬菌体基因组中(图 1)。
首先以 pR-np质粒转化 E.coliE2菌,重组 E2菌用
SC培养基培养至 OD600约 0.3～0.4后,用 T4-z1噬菌
体感染,取细菌裂解液 10"l点样于不含溶菌酶的
SC培养平皿上 37℃过夜。用灭菌牙签蘸取噬菌斑接
种于 SC顶层琼脂,37℃过夜培养。刮取噬菌斑生长
良好的顶层琼脂,浸泡于磷酸盐缓冲液中 24h以上。
用上述重组噬菌体浸出液为模板进行 PCR检测,重
组噬菌体命名为 T4-z1-np,参照噬菌体的制备方法
进行扩大培养、纯化[8]。 图 1 重组噬菌体的构建
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1.7 重组噬菌体的 PAGE和 westernblot检测
浓缩纯化的重组噬菌体于-80℃和 37℃冻融 3次后,SDS-PAG检测;然后将之转移至硝酸纤维素(NC)
膜,用含 3%BSA的 Tris-HCL缓冲液(pH7.5)封闭过夜,分别用 AIV阳性血清和 HRP标记的兔抗鸡 IgY
分别作用 2h,充分洗涤后,用 DAB和 H2O2显色。
1.8 重组 T4噬菌体的免疫电镜观察
取收获的重组 T4噬菌体 T4-z1-np0.2ml、生理盐水 0.7ml、流感抗血清 0.1ml,将 3者充分混合,37℃
感作 1h,直接涂片,磷钨酸负染后,在 JEM-1010型透射电镜下观察结果并拍照,同时设不加阳性血清的
对照[9]。
1.9 表达蛋白的 ELISA检测
取收获的重组 T4噬菌体 T4-z1-np抗原包被 96孔酶标板,,4℃过夜,5%BSA封闭 1h,分别加入 1:160
稀释的 H9N2亚型 AIV标准抗血清,临床检测阳性流感血清,37℃孵育 45min,再加入辣根过氧化物酶
(HRP)标记兔抗鸡 IgG,TMB为显色底物,于 450nm波长下测 OD值。设标准鸡阴性血清做对照。
2 结果
2.1 np基因的 PCR扩增
PCR产物用 l%琼脂糖电泳检测,获得了约 l320bp的特异性扩增条带(图 2),与预期结果相符。
2.2 pR-np重组载体的构建
以 NP1/NP2和 pSOC-UP/NP2引物分别进行 PCR筛选,获得大小约 1320bp和 1600bp的特异性扩增
条带。提取重组质粒用 EcoRⅠ酶消化,获得大小分别为 5100bp的载体条带和 1320bp的目的条带(图 3),
结合序列测定结果表明,读码框正确的 np基因成功克隆至 pR载体。
图 2 np基因的 PCR结果
M.DNA分子量标准 DL2000;1.np
的 PCR产物,大小约 1320bp
图 3 重组质粒 pR-np的酶切鉴定
M1.DL2000DNA分子量标准;1.EcoRI酶切产物;
2.重组 pR质粒对照;M2.DL15000DNA分子量标准
2.3 重组 np基因噬菌体的获得
重组噬菌体恢复溶菌酶活性,可在不含溶菌酶的 SC培养基上增殖并形成噬菌斑,以噬菌斑作为模板,
用 pSOC-UP/NP2引物进行 PCR筛选,获得约 1600bp的特
异条带(图 4),表明 np基因已按正确方向重组至噬菌体基
因组。
2.4 重组噬菌体 T4-z1-np的 SDS-PAGE与 Westernblot
检测
T4-z1-np感染宿主菌 E2,扩增后,以 12%的 SDS-PAGE
检测重组噬菌体表面展示的蛋白,结果如图 5所示,融合蛋
白大小约 58kD。然后将之转移至 NC膜上进行 Westernblot,
图 4 重组噬菌体 T4-z1-np的 PCR筛选
1～5.重组噬菌体 PCR产物,获得 3个(1、2、5)含有 np
基因片段的阳性克隆;M.DL2000DNA分子量标准
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重组 SOC-NP蛋白可与 AIV阳性血清发生特异性结合反应,产生分子量约 58kD的特异条带(图 6),进一
步表明 np基因已在 T4噬菌体表面成功展示。
图 5 重组噬菌体 T4-z1-np的 SDS-PAGE检测 图 6 重组噬菌体 T4-z1-np的 Western-blot检测
M.蛋白质分子量标准;1.噬菌体 T4-z1-np,箭头
所示为目的条带;2.普通噬菌体
M.蛋白质分子量标准;1.重组噬菌体 T4-z1-np
2.5 重组噬菌体 T4-z1-np的免疫电镜
在透射电镜 TEM下,T4噬菌体由头部、尾与尾丝组成。重组噬菌体 T4-z1-np头部变黑(图 7)。这证实
其表面的核蛋白与相应的特异性抗血清发生了免疫学反
应。
2.6 表达蛋白的 ELISA检测
ELISA检测结果如表 1所示,重组噬菌体可与 22份
AIV鸡血清反应,其 OD450的平均值为 0.505,而与 AIV标
准隐性血清反应的 OD值的平均值为 0.043。进一步证实
重组噬菌体展示的重组流感核蛋白具有特异性,可与相应
的抗血清发生免疫反应。
图 7 重组噬菌体 T4-z1-np的免疫电镜
1.野生噬菌体对照;2.重组噬菌体 T4-z1-np;放
大倍数:130nm×120k,TEM
表 1 表达蛋白的 ELISA检测
3 讨论
T4噬菌体展示系统是 20世纪 90年代中期建立起来的一种新的展示系统,该展示系统由其重组载
体、噬菌体阳性选择载体组成,具有 3种展示方式,HOC、SOC位点展示与 HOC和 SOC位点同时双展示[7]。
其中 SOC位点展示较成熟,在其 C末端插入的外源基因的片段大,可展示较大的多肽和蛋白质,应用范围
更广,而且已经有多个病原微生物的功能蛋白被展示,表达的蛋白具有很好的生物学活性[10]。在本研究中,
首次将 AIVNP蛋白成功展示于 T4噬菌体 SOC位点,且重组噬菌体具有较好的感染性,为进一步利用 T4
噬菌体展示系统开展新型诊断试剂以及基因工程疫苗的研究奠定了基础。
T4噬菌体展示系统 SOC位点展示外源蛋白时,同源重组具有其自身的特点:必须通过缺失溶菌酶基
因 e的噬菌体阳性选择载体与携带有外源基因和溶菌酶基因 e重组质粒发生同源重组而将其整合入 T4
噬菌体基因组中,从而将外源蛋白展示于 T4噬菌体的表面[4~7,10]。重组载体 pR-NP中含有同源重组需要的
基因序列 e-SOC-NP-denV,当相应部分基因(e-IPII-IPI-denV-SOC-)缺失的噬菌体 T4-Z1感染含有 pR-
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质体对 DCs细胞无毒性。
本研究构建了稳定的 anti-DEC-205iLPSM,并证明其在体外可被 DCs高效摄取,为进一步研究将抗原
或药物靶向 DEC-205受体后的免疫应答效应奠定了基础。
参考 文献
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9 ButlerM,MorelAS,JordanWJ,etal.Immunology,2007,120(3):362~371.
NP质粒的 E2菌时,e-SOC-NP-denV基因易于同源整合进噬菌体基因组,重组噬菌体重新获得完整的 e
基因和 denV基因(包括溶菌酶基因),同时将外源基因导入噬菌体基因组(SOC基因下游)。而且,重新获得
溶菌酶基因的重组噬菌体可在无溶菌酶的 SC培养基上生长,易于进行初步的筛选。
AIVNP是较为保守的群特异性抗原。针对 NP的抗体不能给动物提供被动保护,但 NP却是细胞毒性
淋巴细胞识别的主要抗原,在抗异源亚型流感病毒感染中起重要作用[11~14]。因此,核蛋白的免疫功能对于
解决禽流感病毒感染的交叉保护具有现实意义。构建了表达流感病毒核蛋白的重组噬菌体,使流感病毒的
核蛋白成功地展示于噬菌体表面,并通过 SDS-PAGE、免疫印迹、免疫电镜以及 ELISA检测证实其表达的融
合蛋白具有特异的免疫学反应性(图 5,6,7;表 1),进一步证实 T4噬菌体展示系统可以用于生产检测流感
的诊断试剂、研究新型流感重组亚单位疫苗。利用此重组噬菌体作为诊断试剂,生物安全性高,生产方便。
但尚需建立适当的检测方法,进一步研究其实际诊断价值;另外,表达核蛋白的的重组噬菌体可以进一步
研究其刺激动物机体产生的细胞免疫,深入研究新功能,筛选新的抗原表位,为生产新型流感基因工程疫
苗奠定基础。
参考 文献
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