全 文 ：·896· 中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第6期2008年6月
甘草酸单铵盐对H9N2禽流感病毒的作用机制研究
陈建新1’2，邱灵才1，方炳虎1，李满妹2，张晓琦2，叶文才2
(1．华南农业大学兽医学院广东省兽药研制与安全评价重点实验室。广东广州 510642，
2．暨南大学中药及天然药物研究所，广东广州 510632)
摘要：目的 考察甘草酸单铵盐对人工感染流感和禽流感病毒小鼠肺炎的抑制作用，探讨其抗病毒作用机制。方
法 分别建立禽流感病毒H。Nz和流感病毒FM。株感染的小鼠肺炎模型，以肺指数抑制率为指标考察甘草酸单铵
盐对感染小鼠的肺炎保护效果，流式细胞仪分析感染H。Nz小鼠脾脏T淋巴细胞亚群的变化；用鸡胚感染模型以4
种不同给药方式进行甘草酸单铵盐抗病毒机制研究。结果 甘草酸单铵盐具有减轻小鼠肺炎的实变、调整感染
H。N：小鼠脾脏T淋巴细胞亚群比例的作用；预防给药能抑制病毒在鸡胚内的复制。结论甘草酸单铵盐是通过抑
制禽流感病毒对组织细胞的吸附及调节机体细胞免疫而达到抗禽流感病毒的作用。
关键词：甘草酸单铵盐；流感病毒；禽流感病毒
中图分类号：R286．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)06—0896一04
2003年爆发的高致病性H。N。亚型禽流感已跨
越物种屏障由禽传染给人，导致近200人死亡[1]，严
重威胁人类的生命健康。目前，人禽流感疫苗尚处于
临床试验阶段，现有的防治人高致病性禽流感药物
的疗效也较差，因此，寻找和开发新的防治禽流感药
物已刻不容缓。本课题组在抗禽流感病毒(Avian
influenzavirus，AIV)的中药筛选研究中发现甘草
提取物对AIV有显著的抑制活性，能显著抑制人工
感染AIV小鼠的肺炎实变，延长感染小鼠的生存时
间。对甘草酸、甘草次酸和甘草黄酮等甘草中几种主
要活性成分的抗AIV作用研究结果表明，甘草酸单
铵盐的抗AIV活性较强[2]。本实验在已有研究基础
上，进一步比较甘草酸单铵盐对人工感染普通流感
病毒(FMl株，H，N，亚型)和禽流感病毒(H。N。亚
型)小鼠肺炎的抑制作用，考察甘草酸单铵盐对感
染禽流感病毒小鼠的脾脏T细胞亚群的影响及4种
不同给药方式鸡胚内抗病毒效果，初步探讨甘草酸
单铵盐对禽流感病毒的作用机制。
1材料
1．1药物：甘草酸单铵盐，惠州市东方植物保健科
技有限公司提供，质量分数98％；病毒唑，广东肇庆
星湖生物化学制药厂生产。
1．2动物：SPF级昆明小鼠，体重为13～15g和
20～22g，雌雄约半，合格证号：SCXK(粤)2003—
0002，粤监证字2006A018，由广东省医学实验动物
中心提供。
1．3鸡胚：10日龄未免鸡胚，购自佛山墟岗黄畜牧
有限公司；10日龄SPF鸡胚，由华南农业大学兽医
科技中心提供。
1．4病毒株：鸡源H。N：亚型禽流感病毒，华南农业
大学兽医科技中心提供，经昆明小鼠传代获得其鼠肺
适应株；流感病毒鼠肺适应FM，株(H。N：)，由中国
预防医学科学院病毒所提供，经本室鸡胚传代保存。
1．5试剂：LB肉汤，广东环凯微生物科技有限公
司；PE标记抗小鼠CD。单克隆抗体、FITC标记抗
小鼠CD。单克隆抗体、FITC标记抗小鼠CD。单克
隆抗体购自美国BeckmanCoulter公司；红细胞裂
解液购自美国GenMed公司。
1．6 仪器：CoulterXL流式细胞仪(Beckman
公司)。
2方法
2．1 药物配制：甘草酸单铵盐先用少量无水乙醇溶
解，然后加生理盐水稀释至所需浓度，乙醇终体积分
数为2％；病毒唑用生理盐水稀释至所需浓度。
2．2 H9N2AIV鼠肺适应株的建立：H。N：AIV经
SPF鸡胚复壮后，滴鼻感染SPF级昆明种小鼠，每
只0．05mL，3d后取小鼠肺，加灭菌LB肉汤研磨，
制成10％肺组织悬液，再次滴鼻感染小鼠，连续传
5代以提高病毒对小鼠的毒力。第5代病毒再经过鸡
胚增殖活化，最终得到的病毒转入一80℃下保存。
病毒对小鼠的半数致死剂量(LD。。)根据Reed—
Muench两氏法确定。
收稿日期：2007—08一15
基金项目：广东省科技计划项目(2006820801001；20078031407006)
作者简介：陈建新(1967一)，男，副研究员，硕士生导师，暨南大学药学院在职博士研究生，近年主要从事抗漉感及禽流感病毒中药研究．
Tel：(020)88257119Fax；(020)85284896E-mail：jxchen@$cau．edu．cn
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第6期2008年6月·897·
2．3甘草酸单铵盐对H。N。AIV致小鼠肺炎的抑
制试验[3]：体质量为13～15gSPF级小鼠随机分
组，每组11只，设模型组、对照组、病毒唑(70mg／
kg)组、甘草酸单铵盐低剂量和高剂量(40、80mg／
kg)组。各药物处理组于攻毒前1d开始ig给药，
0．2mL／只，每天2次，连续给药5d；对照组ig等体
积无菌生理盐水，攻毒时除对照组小鼠滴鼻生理盐
水外，其余各组小鼠在乙醚轻度麻醉下感染15倍
LD。。的鼠肺适应H。N：AIV。攻毒后第4天，将小鼠
称重后放血处死，解剖取胸腺、肺、脾，摘除气管、肺
门淋巴等组织。将脏器用0．9％生理盐水清洗2次，
然后用滤纸吸干表面水分，分析天平称质量，并计算
胸腺指数、肺指数和肺指数抑制率。
肺指数=肺质量(g)／体质量(g)x100％
胸腺指数=胸腺质量(g)／体质量(g)×100％
肺指数抑制率=[(病毒对照组肺指数均值一给药组肺
指数均值)／病毒对照组肺指数均值]×100％
2．4甘草酸单铵盐对FMl(H。N，)致小鼠肺炎的
抑制试验：感染小鼠病毒毒株用FMl株，动物分
组、处理方法和结果计算等同2．3项方法。
2．5鸡胚内甘草酸单铵盐抗H9N2AIV效果[4]：10
日龄健康鸡胚随机分组，先测定甘草酸单铵盐对鸡
胚的毒性作用及病毒对鸡胚的半数感染量
(EID；。)，将药物从对鸡胚无毒质量浓度开始用灭菌
生理盐水倍比稀释成低、中、高3个质量浓度(1．25、
2．5、5．0mg／mL)，内加青链霉素(1000U)，4℃
内放置4～6h后，照胚、定位、表面消毒、打孔后，按
预防性给药方式(先给药，1h后接种病毒)、治疗性
给药方式(先接种病毒，1h后加入药物)、同时给药
方式(药物病毒体外混和后马上接种鸡胚)、体外混
合1h(病毒与等体积药物体外作用1h后接种鸡
胚)等4种方式进行给药。病毒量为50倍EID。。H。N。
病毒，接种量0．2mE／枚，封蜡后于生化培养箱中
37℃孵育，定时照胚检查鸡胚存活情况并记录到
96h，及时测定死亡及存活胚的血凝效价。去除24h
内死亡的鸡胚，根据鸡胚死亡率并结合HA测定效
价结果判断中药对病毒的抑制作用。
2．6甘草酸单铵盐对感染H。N：AIV小鼠脾脏T
细胞亚群的影响：体质量为20～22gSPF级昆明小
鼠按体重随机分为对照组、甘草酸单铵盐对照组
(40mg／kg)、模型组、攻毒给药(40mg／kg)组，每
组11只。在乙醚轻度麻醉下，攻毒给药组、模型组每
只小鼠鼻内接种5倍LD。。H。N：AIV液0．05mL，对
照组按同法接种灭菌生理盐水0．05mL。在感染前
1d开始ig给药，0．2mL／只，每天2次，连续给药4
d，对照组、模型组按同法ig等量的生理盐水。分别
于感染后第4天禁食禁水4h，摘除眼球放血处死动
物，立即取脾脏进行实验，按常规方法制备5×106／
mL脾细胞悬液。采用抗小鼠CD。、CD．和CD。单克
隆抗体来检测小鼠脾脏T淋巴细胞亚群，参照T细
胞亚群检测试剂说明加入相应的荧光标记抗体，用
流式细胞分析仪分析。
2．7统计处理：采用SPSS软件进行数据处理，计
量资料用z士s表示，组间比较采用单因素方差分
析，计数资料组间比较采用X2检验。
3结果与分析
3．1 药物对流感(H，N。)和禽流感(H。N：)病毒致
小鼠肺炎的抑制效果：表1可见，正常对照组小鼠的
肺指数与两种病毒感染模型对照组比较有显著性差
异，表明造模成功。H。N：感染模型中，病毒唑组、甘
草酸单铵盐40和80mg／kg组小鼠的肺指数与病
毒对照组相比差异极显著(P<0．01)。FMl
(H，N。)感染模型中，病毒唑组、甘草酸单铵盐40
mg／kg组小鼠的肺指数与病毒对照组相比差异极
显著(P<0．01)，80mg／kg组肺指数差异显著
(P
的胸腺萎缩(P<0．01)。
3．2鸡胚内甘草酸单铵盐对H。N：AIV的抑制效
果：表2可见，与病毒对照组比较，预防性给药时，甘
草酸单铵盐5．0mg／mL能显著抑制病毒在鸡胚内
增殖(P
抑制病毒(P<0．05、0．01)，抑制率达到50％以
上，效果优于病毒唑。
3．3 甘草酸单铵盐对感染H。N。小鼠的T细胞亚群
的影响：表3可见，模型组脾脏总T淋巴细胞(CD})
和Th(CD}CD／)比例比对照组显著下降(P<
0．05)，Ts(CD}CD+)略有上升，可见感染小鼠的T
细胞亚群比例出现紊乱；给药后甘草酸单铵盐能显
著提高Th／Ts(CD；-／CD；-)，使小鼠的免疫趋向正
常状态。
3讨论
H。N：AIV小鼠感染模型，对探索哺乳动物感染
禽流感病毒的致病机制和防治药物筛选具有重要意
义。小鼠感染病毒后引起肺炎，导致肺组织内炎症细
胞渗出增多，形成肝样实变，使肺质量增加。肺质量
增加与肺炎的严重程度相关，所以肺指数抑制率可
万方数据
-898· 中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第6期2008年6月
表1 甘草酸单铵盐对流感病毒(H。N。)或禽流感病毒(H，N：)致小鼠肺炎的抑制效果饧=11)
TableI Inhibitionofglycyrrhetateonmicpneumonitisinducedbyinfluenzavirus(HIN．)orAIV(H，N2)(庸=11)
与模型组比较：。P<0．05～P<0．01
‘P<0．05一P<0．01wmodelgroup
裹2鸡胚内甘草酸单铵盐对H，N：AIV的抑制效果
Table2 InhibitionofglycyrrhetateonmultiplicationofH，N2AIVinchickembryoes
与病毒对照组比较：。P<0．05～P
裹3甘草酸单铵盐对感染H，N：AIV小■T细胞亚群的影响(；士s，席一11)
Table3 EffectsofglycyrrhetateonTcellsubsetsofspleeninmiceinfectedbyH，N2AIV(；士s，万一11)
与模型组比较：。尸
以用来评价药物的抗病毒活性。肺指数试验结果表
明，甘草酸单铵盐能显著减轻H。N：和FMl两种流
感病毒引起的肺部炎症，减轻病毒导致的胸腺萎缩，
其抗病毒效果接近于病毒唑。
病毒对机体的感染包括对机体细胞的吸附、穿
人、脱壳、复制、释放等步骤。利用鸡胚试验可初步探
讨药物对病毒的作用环节。预防性给药方式、治疗性
给药方式、同时给药方式和体外混合1h后给药方
式可分别用于考察药物对病毒的吸附、复制环节的
抑制作用和直接灭活作用。鸡胚试验表明，甘草酸单
铵盐体外对AIV有直接灭活作用，鸡胚内能抑制
AIV对鸡胚细胞的吸收，但对鸡胚内AIV的复制
没有抑制作用。
流感病毒进入肺部，首先感染肺部支气管黏膜
和肺泡壁上皮细胞，触发机体细胞免疫，引发T淋巴
细胞和NK细胞增殖反应[5]。T细胞淋巴亚群变化
可以反映机体的免疫状态，其中CD．+／CD。+值对于
稳定和调节免疫系统的生理功能及免疫反应强度起
着重要作用。与对照组相比，小鼠感染AIV后，其脾
脏CD。十、CD。+CD。+细胞百分率显著下降，表明机
体的细胞免疫机能迅即下降，这与卢芳国等[63报道
的流感病毒感染小鼠免疫功能的变化相一致。甘草
酸单铵盐能显著提高小鼠脾脏T淋巴细胞中的Th／
Ts值(P
附、改善和调整感染小鼠的免疫功能等多种途径而
达到抗AIV的效果。
参考文献：
[13JonathanS，NguyenVT，ChloeS．Avianinfluenzaa dthe
threatof henexthumanpandemicEJ]．JHospln7，2007，
65(2)：10—13．
[23方炳虎。邱灵才，陈建新，等．甘草主要成分抗HgN2亚型
流感病毒作用研究EJ]．广东农业科学，2007，204(3)：66～
69．
[3]杨子峰，徐活腾，刘妮，等．贯叶金丝桃醇提物抗流感病
毒作用的研究I-j]．现代中西医结合杂志，2004，13(6)：
712—713．
万方数据
中草黄ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第6期2008年6月·899·
[4]黄亚东，李燕梅，营永峰，等．莪术油复方口服液对禽流感
病毒H；N。亚型的抑制作用和攻毒保护试验[J]．中国兽医学
报，2007，27(6)：893—898．
Is]RobertoF，GiuliaL．IdaA．eta1．SpleniccntandCDtT
cellsfrominfluenzaimmunemiceconcurrentlyproducein
vitroIL2，IL4，andIFN一7[J]．CellImmunol，1996，170
(2)：222—229．
[6]卢芳国，田道法，朱应武，等．麻杏甘石汤加味方对A型流
感病毒感染小鼠免疫功能的影响[J]．中医药学报，2005，
33(2)：36—37．
四磨汤联合帕罗西汀治疗功能性消化不良临床观察
王建华
(浙江省舟山市人民医院消化科，浙江舟山 316000)
功能性消化不良是指具有上腹痛、上腹胀、早
饱、嗳气、食欲不振、恶心、呕吐等上腹不适症状，经
检查排除引起这些症状的器质性疾病的一组临床综
合征。
功能性消化不良患者中有相当一部分合并明显
的情感障碍，诊断容易而治疗棘手。笔者在2006年7
月一2007年6月，应用四磨汤、帕罗西汀、莫沙比利
联合治疗功能性消化不良，旨在观察综合治疗的疗
效，现报告如下。
1资料与方法
1．1临床资料：病例为2006年7月一2007年6月在
本院消化科门诊就诊的患者112例，其中男42例，
女70例，年龄21～64岁，平均(38．2±4．3)岁，病
程最长12年，最短4个月。将患者随机分为2组：治
疗组56例，对照组56例。两组在性别、年龄、病程
等方面无显著性差异(P>O．05)，具有可比性。全部
病例符合以下标准：持续或反复发作的上腹疼痛或
不适，包括上腹胀、早饱、暖气、食欲不振。具备条件：
(1)上述症状一项或数项，持续或间歇发作超过3个
月；(2)胃镜或上消化道钡餐检查未发现有食管和胃
的炎症、溃疡、肿瘤、糜烂等器质性病变，也无上述病
史；(3)实验室、X线、B超检查未发现肝、胆、胰、肠
道病变；(4)既往无结缔组织病、糖尿病、肾病、精神
病等其他全身性疾病史；(5)无腹部手术史；(6)同时
伴有抑郁焦虑症状。
1．2治疗方法：治疗组口服四磨汤(湖南中达骛马
制药有限责任公司)20mL每天3次，帕罗西汀(中
美天津史克制药有限公司0712043420mg，每天1
次；同时口服莫沙比利(湖北丰源医药有限公司，
H19990315)5mg，每天3次，对照组同样剂量口服
帕罗西汀和莫沙比利。疗程观察4周。治疗期间均禁
收稿日期：2007．12—19
烟酒，停用其他药物，同时给予正确的心理疏导，安
慰鼓励患者保持积极乐观的心态。治疗前后分别采
用Zung抑郁自评量表SDS，焦虑自评量表SAS测
定。其严重程度用SAS、SDS量表指数指示，SAS、
SDS指数一各条目累计分／80(最高总分)。
1．3统计处理：数据采用X2检验进行分析。
2结果
2．1临床疗效评定标准：治疗前后分别对上腹胀、
早饱、上腹痛、嗳气等症状评分，严重程度以0～3
分计。0分：无症状；1分：轻度，稍加注意感到有症
状；2分：中度，自觉有症状，不影响工作；3分：重度，
明显影响生活和工作。各项症状分数相加即为该患
者症状积分。显效：症状积分降低>80％；有效：症状
积分降低>50％；无效：症状积分降低<50％。总有
效率为(显效例数+有效例数)／总例数×100Vo。
2．2疗效比较：经过4周治疗后，治疗组总有效率
为91．1％，对照组总有效率为64．3％，经X2检验，
两组差异显著(P<0．01)。见表1。
寰1两组疗效比较
Table1 Comparisonoftheraputiceffect
betweentwogroups
组别 例数 显效／例 有效／例 无效／例 总有效率／％
对照 56 21 15 20 64．3
塑堑 !! !! !! ! ． !!：!：：
与对照组比较：一P
疗组治疗前后比较差异非常显著(P
2．4 不良反应：全部患者在治疗前后血尿常规、肝
肾功能均在正常范围内。治疗过程中，治疗组有个别
患者出现恶心、口干症状，但仍能坚持治疗。
万方数据
甘草酸单铵盐对H9N2禽流感病毒的作用机制研究
作者： 陈建新， 邱灵才， 方炳虎， 李满妹， 张晓琦， 叶文才
作者单位： 陈建新(华南农业大学兽医学院,广东省兽药研制与安全评价重点实验室,广东,广州
,510642;暨南大学中药及天然药物研究所,广东,广州,510632)， 邱灵才,方炳虎(华南农业
大学兽医学院,广东省兽药研制与安全评价重点实验室,广东,广州,510642)， 李满妹,张晓
琦,叶文才(暨南大学中药及天然药物研究所,广东,广州,510632)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(6)
被引用次数： 7次
参考文献(6条)
1.Jonathan S;Nguyen V T;Chloe S Avian influenza and the threat of the next human pandemic[外文期刊]
2007(02)
2.方炳虎;邱灵才;陈建新 甘草主要成分抗H9N2亚型流感病毒作用研究[期刊论文]-广东农业科学 2007(03)
3.杨子峰;徐活腾;刘妮 贯叶金丝桃醇提物抗流感病毒作用的研究[期刊论文]-现代中西医结合杂志 2004(06)
4.黄亚东;李燕梅;营永峰 莪术油复方口服液对禽流感病毒H5N1亚型的抑制作用和攻毒保护试验[期刊论文]-中国兽
医学报 2007(06)
5.Roberto F;Giulia L;Ida A Splenic CD+,4 and CD+,8 T cells from influenza immune mice concurrently
produce in vitro IL2,IL4,and IFN-γ[外文期刊] 1996(02)
6.卢芳国;田道法;朱应武 麻杏甘石汤加味方对A型流感病毒感染小鼠免疫功能的影响[期刊论文]-中医药学报
2005(02)
本文读者也读过(10条)
1. 王莉.于俊荣.高章圈.王国华 不同剂量甘草酸单铵盐对大鼠子宫角粘连预防作用的实验研究[期刊论文]-中国计
划生育学杂志2004,12(5)
2. 冯书晓.陈文.冯俊阳.江发寿 抗流感病毒植物药有效部位筛选研究概况[期刊论文]-中国中医药信息杂志
2005,12(11)
3. 齐绣花.石凤海.张文东.叶丛化.张富强.宋建领.董波.张应国 云南边境H5N1亚型禽流感病毒聚合酶基因分子结
构特征分析[期刊论文]-畜牧与兽医2010,42(11)
4. 冯润.孙坚.何士勤 A型流感病毒NP蛋白研究进展及流感的中药治疗[期刊论文]-江西医药2009,44(3)
5. 马臻.王尊元.沈正荣.朱家蕙.MA Zhen.WANG Zun-Yuan.SHEN Zheng-Rong.ZHU Jia-Hui 甘草酸单铵盐定量测定
对照品的制备[期刊论文]-中国医药工业杂志2001,32(4)
6. 杨晓松 自拟中药方防治甲型流感的探讨[期刊论文]-中国现代药物应用2010,04(13)
7. 刘映霞.杨大国.李慧涓.高雪.刘艳.谢靖婧.李建民.刘水腾.张明霞.杨桂林.陈心春.周伯平.LIU Ying-xia.
YANG Da-guo.LI Hui-juan.GAO-Xue.LIU Yan.XIE Jing-jing.LI Jian-min.LIU Shui-teng.ZHANG Ming-xia.YANG
Gui-lin.CHEN Xin-chun.ZHOU Bo-ping 甲型H1N1流感患者排毒规律及抗病毒治疗研究[期刊论文]-中华实验和临床
病毒学杂志2010,24(4)
8. 郭姗姗.刘颖.高英杰.金亚宏.时宇静.时瀚.刘方舟.崔晓兰.GUO Shan-shan.LIU Ying.GAO Ying-jie.JIN Ya-
hong.SHI Yu-jing.SHI Han.LIU Fang-zhou.CUI Xiao-lan 小儿肺热咳喘口服液对甲型H1N1流感病毒感染小鼠的影
响[期刊论文]-中国实验方剂学杂志2011,17(2)
9. 高章圈.于俊荣.王丽.刘效群.Gao Zhangquan.Yu Junrong.Wang li.Liu Xiaoqun 甘草酸单铵配伍复方丹参注射
液对大鼠盆腔粘连及组织生长因子的影响[期刊论文]-中药药理与临床2005,21(2)
10. 曹红.翟红莉.刘云 高效液相色谱法测定复方乌贼墨胶囊中甘草酸的含量[期刊论文]-解放军药学学报
2002,18(6)
引证文献(7条)
1.蒲秀瑛.梁剑平.王学红.华兰英.刘宇 贯叶连翘提取物抗甲1型流感病毒活性的研究[期刊论文]-中草药 2010(2)
2.杨婕.储燕萍.张书靖.张哲.王成龙.王丽娟 甘草酸单铵对蟾蜍离体心脏功能的影响[期刊论文]-齐齐哈尔医学院
学报 2012(9)
3.黄群荣.马哲 甘草酸的药理作用研究进展[期刊论文]-药物评价研究 2011(5)
4.黄岩.祖元刚.张琳.赵修华.赵野.曹姗 注射用甘草酸纳米无菌粉对大鼠慢性肝损伤的影响[期刊论文]-中草药
2011(10)
5.李耿.申小花.陈建新.苏子仁.曾惠芳.赖小平 克感利咽口服液在小鼠体内抗H9N2亚型禽流感病毒的作用[期刊论
文]-中药新药与临床药理 2010(5)
6.陈建新.陈良柱.刘雅红.韦兰萍.方炳虎 神经氨酸酶抑制剂帕拉米韦的合成及其抗禽流感病毒药效[期刊论文]-中
国抗生素杂志 2009(8)
7.周雪梦.陆春妮.亓文宝.马勇江.汤有志.陈建新 清开灵和双黄连口服液体内抗禽流感病毒作用[期刊论文]-中草
药 2011(7)
本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200806033.aspx