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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 6 期
分子标记对草原野生食用菌蒙古口蘑的鉴别分析
刘芳1 朱兵1 于景丽2 赵吉2
(1内蒙古大学生命科学学院，呼和浩特 010021;2内蒙古大学环境与资源学院，呼和浩特 010021)
摘 要: 对采自内蒙古锡林郭勒草原的野生食用菌蒙古口蘑(Tricholoma mongolicum Imai.)等 10 个菌种进行了 ITS 和
ISSR分子标记的鉴定，其中蒙古口蘑共计 4 个不同来源菌种，其它 6 个菌种为子实体与蒙古口蘑形态相近的常见草原菇类或
市售食用菌，鉴定结果用 RAPD进行辅助分析验证。从 12 条 ISSR引物中筛选出 2 条可用引物，扩增总条带数为 246 条，多态
性标记为 215 个，多态性频率为 87 4%。经过 NT-SYS软件聚类分析，发现在 ISSR分析中结合 ITS方法可以有效地将蒙古口
蘑与其它菌种区分开，这与 RAPD法的分析结果相一致，获得了可靠的野生食用菌分子标记方法。研究表明 ISSR分子标记是
蒙古口蘑等野生食用菌鉴定的理想手段之一。
关键词: 野生食用菌 蒙古口蘑 ISSR标记 聚类分析 分子鉴定
Identification of Wild Edible Fungus Tricholoma mongolicum
Imai on Grassland with Molecular Markers
Liu Fang1 Zhu Bing1 Yu Jingli2 Zhao Ji2
(1College of Life Science，Inner Mongolia University，Huhhot 010021;2 College of
Environment ＆ Resources ，Inner Mongolia University，Huhhot 010021)
Abstract: ISSR molecular labeling technique and ITS method were employed to identify ten strains coming from Xilingol League
of Inner Mongolia Autonomous Region The results were compared with RAPD method Totally we had four Tricholoma mongolicum
Imai strains The other six strains were common grassland mushrooms，whose sporophores similar to Tricholoma mongolicum Imai in
appearance，or edible mushrooms common in markets We used 2 primers selected from 12 ISSR primers A total of 246 DNA frag-
ments were amplified and 215 (87 4% of all bands)were polymorphic We found that ISSR marker which is consistent with the re-
sults of ITS method was effective for the identification of Tricholoma mongolicum Imai strains from other strains after cluster analysis of
NT-SYS software ISSR molecular marker is one of the ideal research tool to identify Tricholoma mongolicum Imai strains
Key words: Wild edible fungi Tricholoma mongolicum Imai ISSR marker Clustering analysis Molecular identification
收稿日期:2010-01-13
基金项目:科技部“973”计划前期研究专项(2009CB125909) ，内蒙古自治区自然科学基金重点项目(20080404Zd13) ，国家基础科学人才培养基
金(J0730648)
作者简介:刘芳，女，硕士研究生，研究方向:环境微生物学;E-mail:liufang6633@ 126 com
通讯作者:赵吉，E-mail:ndzj@ imu edu cn
蒙古口蘑(Tricholoma mongolicum Imai )是中外
驰名的稀有野生食用菌，为我国之特产。主要产于内
蒙古自治区北方草原，锡林郭勒盟是其主要产地。蒙
古口蘑不仅仅是一种珍贵的野生食用菌，它对牧草植
物的生长，尤其是生长在蘑菇圈上的禾本科羊草，具
有极其明显的促进作用［1］。蒙古口蘑子实体较大，菌
肉肥厚，具散热解表的功效，蛋白质含量较高，必需氨
基酸含量占氨基酸总量的 35 85% ［2，3］。蒙古口蘑多
糖是药用有效成分之一，具有增强免疫、抗肿瘤、抗病
毒、抗溃疡、抗衰老等多方面的生物活性和生理功
能［4］。近年来，由于草原退化及人为过度采集等原
因，蒙古口蘑生境受到破坏，产量不断下降。蒙古口
蘑外观与一些市售常见草原菇类相近，制成干制品后
从外观上难以判别真伪［5，6］。鉴于此，开发一种能够
用来鉴定蒙古口蘑地理型差异，且能够有效地将蒙古
口蘑与市场上外观相近的菇类相区别的标记方法显
2010 年第 6 期 刘芳等:分子标记对草原野生食用菌蒙古口蘑的鉴别分析
得尤为重要。
ISSR是基于 PCR 的分子标记技术，由 Zietk-
iewicz等［7］在 1994年创建。它以 SSR基序序列为基
础，设计长度一般为 16 － 18 bp 的锚定微卫星序列引
物(ISSR引物) ，对 SSR 区域之间的 DNA 直接扩增，
无需预先克隆和测序。SSR由 1 －6 个碱基对的重复
DNA序列构成，在真核生物的基因组内广泛存在［8］。
锚定的微卫星序列引物是在微卫星序列引物的 3′或
5′端添加 1 － 7 个锚定碱基，将引物锚定在微卫星序
列的 5′或 3′端［7］，可以有效防止扩增过程中引物的滑
动，避免扩增产物电泳时涂抹带的产生。在真菌方
面，国外已将 ISSR 技术应用到遗传变异的鉴定
上［9，10］，国内起步也不算晚，在隐花青鹅膏菌(Amanita
manginiana)［11］、高卢蜜环菌(Armillaria gallica)［12］、侧
耳［13］、金针菇［14］和香菇［15］均有报导。ISSR 分子标
记与常见的几种分子标记技术特点的比较［16］，具有
可靠性高，稳定性较强，模板数量少，成本较低等优
点。从各个分子标记的可靠性、复杂性及成本高低考
虑，ISSR标记无疑是比较理想的。
1 材料与方法
1 1 供试菌株
本次试验选用了 10 个菌种，其中 4 个为蒙古口
蘑，其它 6 个菌种为子实体与蒙古口蘑形态相近的
常见草原蘑菇或常见市售食用菌。菌种详细情况见
表 1。
1 2 主要试剂和仪器
参考文献［17］，选取了 12 种 ISSR引物(表 2)。
表 1 供试菌种详细情况
试验序号 菌种编号 菌种种名 分类地位 菌种来源
L1 ND002 褐口蘑(Agaricus crocopelus peck) 伞菌目伞菌科蘑菇属(Agaricales，Agaricaceae，Agaricus) 河北省张家口市
L2 ND004 双孢菇(Agaricus bisporus) 伞菌目伞菌科蘑菇属(Agaricales，Agaricaceae，Agaricus) 内蒙古呼和浩特市
L3 ND005 香菇(Lentinual edodes) 伞菌目口蘑科香菇属(Agaricales，Tricholomataceae，Lentinus) 内蒙古呼和浩特市
L4 ND006 平菇(Pleurotus ostreatus) 伞菌目口蘑科侧耳属(Agaricales，Tricholomataceae，Pleurotus) 内蒙古呼和浩特市
L5 ND007 金针菇(FlammμLina velutipes) 伞菌目口蘑科金针菇属(Agaricales ，Tricholomataceae，FlammμLina) 内蒙古呼和浩特市
L6 ND008 大白桩(Leucopaxillus giganteus) 伞菌目口蘑科桩菇属(Agaricales ，Tricholomataceae，Paxiflus) 河北省张家口市
L7 ND011 蒙古口蘑(Tricholoma mongolicum) 伞菌目口蘑科口蘑属(Agaricales ，Tricholomataceae，Tricholoma) 河北省张家口市
L8 ND012 蒙古口蘑(Tricholoma mongolicum) 伞菌目口蘑科口蘑属(Agaricales ，Tricholomataceae，Tricholoma) 河北省张家口市
L9 ND013 蒙古口蘑(Tricholoma mongolicum) 伞菌目口蘑科口蘑属(Agaricales ，Tricholomataceae，Tricholoma) 内蒙古农业大学
L10 ND014 蒙古口蘑(Tricholoma mongolicum) 伞菌目口蘑科口蘑属(Agaricales ，Tricholomataceae，Tricholoma) 内蒙古农业大学
表 2 供试用 ISSR引物序列
序号 引物名称 碱基序列(5′ － 3′)
1 ILE80 AGAGAGAGAGAGAGAGC
2 ILE79 ACAACACACACACACAC
3 ILE67 GAGAGAGAGAGAGAGACC
4 ILE46 GAGAGAGAGAGAGAGACT
5 ILE35 ACACACACACACACACT
6 ILE34 CACACACACACACACAT
7 ILE23 AGAGAGAGAGAGAGAGC
8 ILE11 AGAGAGAGAGAGAGAGT
9 ILE93 AGCAGCAGCAGCAGCAGCG
10 ILE112 AAGAAGAAGAAGAAGAAGC
11 ILE131 CACCACACACACACACA
12 ILE120 CACGAGAGAGAGAGAGA
1 3 菌丝体的培养和提取菌丝体基因组 DNA
将供试保藏菌株接种于 PDA 液体培养基内，
置于恒温振荡培养箱内 25℃ 150 r /min 培养 10
d。菌丝体 DNA 提取的方法参考文献［18］，并略
有改进。提取 DNA 后用紫外分光光度计测定
DNA 样品吸光度计算各样品总 DNA 浓度。最后
将 DNA 浓度稀释到 5 ng /μL 置于 － 20℃冰箱贮
存备用。
1 4 ITS分析
ITS引物为通用引物 ITS1 和 ITS4，碱基序列
(5′ － 3′) :ITS1，TCCGTAGGTGAACCTGCGG;ITS4，
TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR 反应体系为 25
521
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
μL:dNTP Mixture(2 5 mmol /L)1 5 μL，Primer(20
μmol / L)各 1 μL，rTaq(5 U /μL)0 2 μL，Template 30
ng，10 × PCR Buffer(Mg2 + Plus)2 5 μL，补加灭菌
ddH2O至 25 μL。PCR反应条件:94℃3 min，94℃40
s，45℃ 1 min，72℃ 1 min，30 个循环;72℃ 10 min，
4℃保存。
1 5 ISSR分析
根据不同引物 PCR 产物电泳条带的质量和丰
富性，筛选出合适的 ISSR 引物 ILE93 和 ILE79。利
用正交试验设计优化出 PCR反应条件。
PCR 扩增体系为 25 μL:dNTP Mixture(2 5
mmol /L)1 5 μL，Primer(20 μmol /L)1 μL，rTaq(5
U /μL)0 2 μL，Template 30 ng，10 × PCR Buffer
(Mg2 + Plus)2 5 μL，补加灭菌 ddWater 至 25 μL;
其中 rTaq、dNTP Mixture、10 × PCR Buffer(Mg2 +
Plus)为 TaKaRa 公司产品套装。PCR 反应条件:
94℃3 min，94℃40 s，退火(经条件优化最终确定
引物 ILE79 的退火温度 52℃，ILE93 退火温度
54℃。)1 min，72℃1 min，30 个循环;72℃10 min，
4℃保存。
1 6 RAPD扩增
RAPD引物为随机引物 OPA20，碱基序列(5′
－ 3′) :GTTGCGATCC。OPA20 为前期试验确定的
PCR产物电泳条带较为稳定的引物。PCR 反应体
系 25 μL:dNTP Mixture(2 5 mmol /L)1 5 μL，
Primer(20 μmol /L)2 μL，rTaq(5 U /μL)0 2 μL，
Template 30 ng，10 × PCR Buffer(Mg2 + Plus)2 5
μL，补加灭菌 ddH2O 至 25 μL。PCR 扩增条件:
94℃预变性 5 min，94℃变性 40 s，35℃退火 30 s，
72℃延伸 90 s，45 个循环，最后 72℃下延伸 10
min，4℃保存。
1 7 电泳检测并处理数据
PCR扩增产物采用 1 5%的琼脂糖凝胶电泳
分离。电泳重复两次以确定稳定性。电泳完毕
后，在 EB 染液中染色后用紫外光下照相。PCR 重
复试验稳定出现的电泳条带用来聚类分析。把用
UVIband软件所读取的条带数据(正负误差不超过
1%)转换成 0，1 数据，并利用 NT-SYS软件进行分
析得到不同菌株之间的相似性指数矩阵，构建聚
类分析图谱。
2 结果与分析
2 1 ITS扩增结果
褐口蘑、双孢菇、香菇、平菇、金针菇和大白桩蘑
分别各自拥有一条大约 740 bp、730 bp、750 bp、650
bp、800 bp和 680 bp左右的条带。蒙古口蘑的 4 个
菌株条带长度比较一致，约为 670 bp 左右。可见用
ITS方法可将蒙古口蘑与褐口蘑、双孢菇、香菇、平
菇和金针菇明显区分，但是与大白桩蘑区分不明显，
故而需要有其它方法的有利补充(图 1)。
M. DL2000 Marker;L1 － L10 菌株分别为褐口蘑、双孢
菇、香菇、平菇、金针菇、大白桩和四株蒙古口蘑，下同
图 1 ITS扩增产物电泳图谱
2 2 ISSR扩增结果
2 2 1 ISSR扩增结果 用优化出的引物 ILE79 和
ILE93 分别对 10 个菌株进行 ISSR 扩增，多态性比
较高，4 株蒙古口蘑相对其他菌株特异性明显，既有
共有带又有特征带。引物 ILE79 扩增的结果中，305
bp、610 bp、810 bp、1 060 bp长度条带可作为蒙古口
蘑区分其他菌株的多态性条带;引物 ILE93 扩增的
结果中，567 bp、670 bp、784 bp、882 bp 长度条带可
作为蒙古口蘑的多态性条带(图 2)。两个引物扩增
的总条带数为 246 条，多态性标记为 215 个，多态性
频率为 87 4%。
2 2 2 ISSR指纹聚类结果 用 NT-SYS 软件对 10
个供试菌株扩增结果进行数据分析得到两两菌株间
的遗传相似性系数矩阵表(表 3) ，并以 UPGMA 法
进行聚类分析(图 3)。可以看到不同的菌株间相似
性系数有所不同，4 株蒙古口蘑的相似性系数在
0 5091 － 0 8364 间，表现出了较大的遗传相似性。
其余两两菌株间相似性系数均不到 0 4000。可见
ISSR方法区分度比较高。
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2010 年第 6 期 刘芳等:分子标记对草原野生食用菌蒙古口蘑的鉴别分析
图 2 供试菌株的 ISSR-PCR产物电泳图谱
表 3 10 个菌株之间的相似性系数矩阵
L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10
L1 1 0000
L2 0 3415 1 0000
L3 0 1304 0 2857 1 0000
L4 0 2800 0 1538 0 2272 1 0000
L5 0 3265 0 3158 0 3721 0 2979 1 0000
L6 0 1538 0 1463 0 3478 0 2800 0 3265 1 0000
L7 0 3019 0 2380 0 2979 0 1961 0 2800 0 3019 1 0000
L8 0 2500 0 2667 0 2800 0 2593 0 3396 0 3214 0 7368 1 0000
L9 0 1887 0 1905 0 2553 0 2353 0 3200 0 3774 0 5556 0 7368 1 0000
L10 0 2222 0 1395 0 2083 0 1923 0 3137 0 3704 0 5091 0 6552 0 8364 1 0000
图 3 ISSR聚类分析的树状图
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
在大约 0 236 的水平上，供试菌株被聚为两大类:褐
口蘑和双孢菇被聚为一类，4 株蒙古口蘑和大白桩、
香菇、金针菇、平菇被聚为一类。可见两株伞菌科的
菌株与口蘑科的菌株差异很大，遗传距离较远。
在蒙古口蘑的聚类组中，在大约 0 292 的水平
上，平菇自己聚为一类，其余 7 株聚为一类;7 株菌
株的聚类组中，在大约 0 342 的水平上，香菇和金针
菇聚为一类，4 株蒙古口蘑和大白桩蘑聚为一类。
这说明大白桩蘑与蒙古口蘑有一定的遗传相似性;
而在 0 618 的水平上，4 株蒙古口蘑聚为一类，大白
桩蘑自己聚为一类;4 株蒙古口蘑聚类组中，在
0 736 的水平上，不同来源的口蘑分别被聚成两类:
河北张家口的口蘑聚成一类，内蒙古农业大学的菌
株聚成一类，说明 4 株蒙古口蘑间的亲缘关系比较
相近，但是也有遗传变异，有一定的遗传多样性，这
可能与不同的地理来源有关。可见利用 ISSR 可以
对蒙古口蘑菌种进行种内鉴定。
2 3 RAPD扩增结果
通过用 OPA20 扩增得到指纹图谱中总条带数
为 64 条，多态性标记为 46 个，多态性频率为
71 9%。蒙古口蘑的 4 株菌株既有共有条带又有特
征带。多态性条带为 311 bp、530 bp、810 bp 长度条
带。RAPD的对比试验中，扩增位点较 ISSR 少，条
带多态性也较 ISSR分析所得的多态性低(图 4)。
图 4 供试菌株的 RAPD扩增产物电泳图谱
3 讨论
DNA分子标记技术具有较形态学观察不可比
拟的优越性，而 ISSR标记可广泛应用于动植物种质
鉴定、遗传作图和基因定位，尤其在分子遗传学基础
贫乏的作物研究中显示出极大优势［19］，但在蒙古口
蘑的研究中还未用到 ISSR技术进行鉴定。
本试验先用 ITS对 10 株供试菌株进行扩增，发
现可以用 ITS将蒙古口蘑与大部分其他属外参照株
区分开，但仍需要其它分子标记进行补充鉴别。利
用 ISSR 标记进行分析，综合引物 ILE79 和引物
ILE93 分析结果，ISSR 方法可以明显地将蒙古口蘑
与其它跟蒙古口蘑形态相近的常见草原蘑菇或常见
市售食用菌鉴别开，并且明显地反映出了蒙古口蘑
种内之间的差异。两引物得到的结果显示，蒙古口
蘑 L9 和 L10 的相似性水平为 0 8364，蒙古口蘑 L7
和 L8 的相似性水平在为 0 7368，4 个蒙古口蘑菌株
之间的相似性水平为 0 618。同时发现，ISSR 方法
对于同是蘑菇属的褐口蘑和双孢菇在 0 3415 的水
平就可以区分开，可以对物种间进行很明显的区分。
不同的 DNA分子标记，由于引物扩增的基因组
片段不同，即不同标记检测的基因组区域不同，在某
些区域有些位点发生变异，则能检测出品种之间的
差异;而有些位点在进化过程中比较保守，则检测不
到差异。体现在不同的核酸分子标记上，就表现为
不同的标记试验结果有所不同，造成不同标记之间
结果的差异［20］。为了验证 ITS 和 ISSR 标记方法在
蒙古口蘑鉴定上的可靠性，又进行了 RAPD 分析。
从指纹图谱看，也可以利用特征条带将 4 株蒙古口
蘑与其它菌株区分开，但从本试验看，ISSR 相比于
RAPD标记方法获得的多态性较高。此外，该技术
所使用的引物和退火温度较 RAPD 的长和高，在重
复性和稳定性上也均强于 RAPD。因此，利用 ITS
和 ISSR标记技术对蒙古口蘑进行鉴定和亲缘分析
上有一定的适用性，这与关雪娟等提出的 ISSR在高
等真菌品种鉴别上具有较好的适用性的结论一致。
综上，利用 ITS和 ISSR分子标记手段对蒙古口
蘑鉴定有一定的可行性，可以在蒙古口蘑鉴定方面
进行进一步的研究。
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