全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
圆弧青霉 PG37脂肪酶的生物信息学分析
李剑芳 1 张慧敏 1 邬敏辰2
( 1江南大学食品学院,无锡 214122; 2江南大学医药学院,无锡 214122)
摘 要: 利用生物信息学软件对 GenB ank上登录的圆弧青霉 PG37碱性脂肪酶 ( L ip )进行预测和分析。结果表明,
PG37 L ip 全肽含多个疏水区域,无明显跨膜结构域,定位于胞外, N末端 20个氨基酸为信号肽; PG37 L ip 成熟肽是等电点
为 6 16的疏水性稳定蛋白质, 包含一个 L ipase_3的结构域, 属于 /水解酶超家族, 含磷酸化位点等多种功能性位点, 具有
脂肪酸代谢的功能; 螺旋和不规则卷曲是其蛋白质二级结构的主要结构元件, 在三级结构中, Se r132 Asp188H is241 3个氨基酸
残基组成酶活性中心。
关键词: 生物信息学 圆弧青霉 PG37 碱性脂肪酶 氨基酸序列
B ioinformatics Analysis of the L ipase from
Penicillium cyclopium PG37
L i Jianfang
1
ZhangH umi in
1
WuM inchen
2
(
1
School of Food Science and T echno logy, Jiangnan University, W ux i 214122;
2
School of M edicine and Pharmaceutics, J iangnan University, W uxi 214122)
Abstrac:t The sequence of a lkaline lipase ( L ip ) from P enicillium cy clop ium PG37, reg istered in GenBank, w as ana lyzed by
b io info rm atics too ls. The results show ed that PG37 L ip I com plete peptide that locates in ectoce ll features many hydrophob ic reg ions
and a signal peptide, bu tw ithout transmembrane dom a in. PG37 L ip I is stab le, pI 6 16, w ith strong hydrophob icity, and conta in one L i
pase_3 dom ain and is c lassified into / hydro lase superfam ily. There arem any phosphory la tion sites and other functiona l sites in the
sequencew hich invo lved in fatty ac id m etabo lism. helix and random co il are them a in seconda ry structures. Ser132A sp188 H is241 com
pose the enzym e active reg ion in the te rtiary structure.
Key words: B io informa tics Pen icillium cy clop ium PG37 A lkaline lipase Am ino acid sequence
收稿日期: 20091112
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 20776061)
作者简介:李剑芳,女,博士,副教授,研究方向:食品生物技术; Em ai:l l ij@f 163 com
通讯作者:邬敏辰,男,教授,博士生导师, 研究方向:酶工程与基因工程; Em ai:l b ioch@ 163 com
三脂酰甘油酰基水解酶 ( T riacy lg lycero l acy l
hydro lase, EC 3113)俗称脂肪酶, 除了能催化三
脂酰甘油水解之外,还可催化酯交换以及脂肪、生物
表面活性剂、聚合物和药物等的合成,尤其是利用脂
肪酶的立体专一性催化旋光异构体的拆分和手性药
物的合成 [ 1]。 Crueger等 [ 2]总结了各种微生物脂肪
酶的最适作用 pH,认为细菌脂肪酶最适 pH为中性
和偏碱性,而真菌脂肪酶为酸性和中性。但也有文
献报道表明,许多真菌脂肪酶偏碱性或碱性。如圆
弧青霉、扩展青霉、亮青霉、解脂毛霉、米曲霉、解脂
假丝酵母和阿氏假囊酵母等脂肪酶的最适作用 pH
在 8- 10之间 [ 3 ] ,碱性脂肪酶主要应用于洗涤剂行
业 [ 4]。作者所在研究室长期致力于碱性脂肪酶的
研究,如圆弧青霉 PG37菌株的诱变育种、发酵条件
优化、酶的分离纯化、酶学性质、酶的应用以及酶基
因的克隆和表达等 [ 3, 5]。
为了全面深入地了解 Penicillium cy clop ium PG37
L ip 序列所蕴涵的生物学信息, 本研究以 PG37 L ip
的氨基酸序列为研究对象, 利用生物信息学的相
关软件和数据库, 预测或分析 PG37 Lip 的理化性
质与功能,模拟和分析 PG37 L ip 的二级、三级结构
及其特征, 为后续研究工作奠定理论基础。有关
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
P enicillium cyclop ium PG37 L ip 的生物信息学分
析,国内外尚未见报道。
1 材料和方法
11 材 料
P enicillium cyclop ium PG37 L ip 氨基酸序列的
数据资料来源于 NCB I数据库, 登录号为 AAF
82375。
12 方法
采用生物信息学相关软件及数据库对 PG37 Lip
的氨基酸序列进行预测、分析 (表 1 )。采用
ProtSca le、TMHMM分析 PG37 Lip 全肽的疏水区域
和跨膜结构域; W oLF PSORT预测亚细胞定位; S ig
nalP 30预测信号肽; P rotparam分析 PG37 L ip 成
熟肽的氨基酸组成、分子量及等电点等理化性质;
InterProScan、ScanProsite和 N etPhos20分析 Lip 功
能结构域和功能位点; P rotfun分析 L ip 功能; SOP
MA及 ESyPred3D预测 L ip 的二、三级结构。
表 1 生物信息学相关软件与数据库网址
名称 网址
ProtS cale ht tp: / / au expasy org / tools /protscalehtm l
TMHMM ht tp: / /www cbsdtudk /services /TMHMM - 20 /
W oLF PSORT ht tp: / /w olfpsort org /
S ign alP 30 ht tp: / /www cbsdtudk /services /S ignalP /
ProtParam ht tp: / / au expasy org / tools /protparamh tm l
In terProScan ht tp: / /www eb i acuk /Tools / In terProScan /
ScanPros ite ht tp: / / au expasy org / tools / scanp ros ite /
NetPhos20 ht tp: / / genom e cbsd tudk /serv ices /NetPh os /
Protfun ht tp: / /www cbsdtudk /services /ProtFun /
SOPMA
http: / /npsa - pb il ib cp fr / cgi - b in /npsa _ auto
matp?l page= npsa_sopmahtm l /
E SyPred3D
h ttp: / /www fundp acbe /scien ces /b io log ie /u rbm /
b io info/ esypred /
2 结果与讨论
21 PG37 L ip 疏水区域、跨膜结构域的分析
分别采用 ProtSca le、TMHMM 对 PG37 Lip 全
肽进行疏水区域和跨膜结构域进行分析。疏水区域
分析结果如图 1所示, 疏水性分值在 + 15与 + 25
之间的有 4处, 预示此处富含疏水性氨基酸, 其中
N末端和 C末端的氨基酸疏水性较强; 跨膜结构域
分析表明, L ip 全肽不存在跨膜结构域, 说明不是
跨膜蛋白。
22 PG37 L ip 亚细胞定位、信号肽的预测
采用WoLF PSORT预测 PG37 L ip 全肽的亚细
胞定位,结果显示该蛋白定位于细胞外的可能性为
667% ,定位于空泡、内质网、线粒体的可能性均为
111% ,据此可以推测该蛋白质可能定位于胞外, 此
与跨膜结构域分析结果相符。
图 1 PG37 L ip 疏水区域分析
采用 S ignalP 30神经网络方法 ( NN )或隐马氏
模型方法 (HMM ),对信号肽位置及切割位点进行预
测。只有 C值 (切割位点分值 )、Y值 (从 C与 Y值
衍生的切割位点预测分值 )、S值 (氨基酸的位置 )
的计算结论为 ! Yes∀的预测结果较理想 [ 6 ]。信号肽
分析结果如图 2所示。C值、Y值和 S值接近 1, 且
计算结论均为 ! Yes∀, S值在剪切位点之前 (第 1位
氨基酸到 20位氨基酸 )高而在剪切位点之后变低,
图 2中曲线的分值较典型, 可以判定 PG37 L ip 全
肽含信号肽, 切割位点在第 20位的丝氨酸和第 21
位的甘氨酸之间, 其疏水性较强, 与采用 Pro tScale
分析结果相符。邬敏辰等 [ 7]报道的 P enicillium cy
clop ium PG37 Lip 位于全肽序列中第 27- 285位,
共计 258个氨基酸, 已预测前 20个氨基酸为信号
肽, 则全肽序列中第 21- 27位的氨基酸序列定义为
前导肽。
23 PG37 L ip I理化性质的分析
Pro tparam分析结果表明, PG37 Lip 分子式
C1215H1887N 323O374S9,分子量约为 2729 kD, 等电点
192
2010年第 3期 李剑芳等:圆弧青霉 PG37脂肪酶的生物信息学分析
图 2 PG37 L ip 信号肽预测
pI 616。L ip 含丙氨酸 (A )最多,占 120% ; 碱性
氨基酸 ( K, R ) 19个, 酸性氨基酸 ( D, E ) 22个, 疏水
氨基酸 ( A, I, F, W, V ) 80个, 极性氨基酸 ( N, C, Q,
S, T, Y ) 75个。总的亲水性平均系数为 0057, 预测
L ip 属于疏水性蛋白。理论推导半衰期 44 h,不
稳定参数 1703,属于稳定蛋白。
用 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和 Sephadex G150
凝胶色谱法实测 PG37 L ip 的相对分子质量分别为
27500 kD和 29 kD;等电点为 54[ 8]。分子量预测值
与实测值差距较小; pI预测值与实测值存在误差, 主
要是因为该预测分析未考虑蛋白质高级结构对其 pI
的影响,不同的蛋白质分子具有不同的构象和构型,
这样就使得可解离的带电基团包在空间结构内核,以
致使 pI的预测值与实测值产生一定偏差,偏差大小
也在一定程度上反应了肽链的折叠程度 [ 9]。
24 PG37 L ip 功能结构域的分析
InterProScan分析结果显示, PG37 Lip 含有一
个 L ipase_3保守结构域,故 PG37 L ip 属于脂肪酶
家族, 并归属于 /水解酶超家族。 ScanProsite分
析结果表明, PG37 L ip 氨基酸序列的第 35、53、217
位置有 3个蛋白激酶 C磷酸化位点 TRK、TEK、
TVK;第 67、211位置有 2个酪蛋白激酶#磷酸化位
点 TITD、SGTE;第 134、135、173、212位置有 4个豆蔻
酰化位点 GGALTS、GALTSI、GTAQAG和 GTEAST。
用 N etPhos 20进行磷酸化位点分析,结果显示
PG37 L ip 具有 13个蛋白激酶磷酸化位点,丝氨酸
位点 ( 65、211、227、229) 4个, 苏氨酸位点 ( 35、53、
67、112、217) 5个, 酪氨酸位点 ( 124、208、209、235) 4
个, 这些位点与酶活性密切相关。
25 PG37 L ip 功能的分析
采用 Protfun分析的结果如表 2所示。 PG37
L ip 具有脂肪酸代谢和氨基酸生物合成等功能的
可能性最大,预示此蛋白可能与脂肪酸的代谢过程
相关。
表 2 PG37 L ip 功能分类
功能分类 Prob Odd s
氨基酸生物合成 0120 5462
生物合成辅因子 0136 1888
细胞外被组分 0031 0507
细胞加工 0070 0959
中央中间代谢 0061 0968
能量代谢 0328 3649
脂肪酸代谢 0072 5504
嘌呤和嘧啶 0248 1021
调节功能 0017 0106
复制和转录 0099 0369
翻译 0131 2983
转运和结合 0079 0193
26 PG37 L ip 二级结构的预测
用 SOPMA预测 PG37 Lip 的二级结构 (图 3),
h代表 螺旋,占蛋白质的 3178% ,分别在 1- 23、
68- 75、99- 118等区域; e代表伸展链,占蛋白质的
1977%,分布在 31- 34、57 - 62等区域; t代表
转角,占蛋白质的 581% , 分布在 119 - 123等区
域; c代表无规则卷曲, 占蛋白质的 4264%, 分布在
25- 30、183 - 206、221 - 238等区域。 螺旋和不
193
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
规则卷曲是构成 PG37 L ip 蛋白质二级结构的主要
结构元件, 转角和伸展链分散在其中,无规则卷曲
受侧链相互作用的影响很大,经常构成酶活性部位
和其它蛋白质特异的功能部位如许多钙结合蛋白中
结合钙离子的 EF手结构 ( EF hand structure)的中
央环 [ 6]
图 3 PG37 L ip I二级结构预测
27 PG37 L ip 三级结构的预测
用 ESyPred3D预测蛋白质三级结构, 以在 PDB
晶体库中与 PG37 Lip 同源性最高 ( 30% )的 P eni
cillium camembertii脂肪酶晶体结构 ( PDB登录号:
1TIA )作为模板, 运用 ESyPred3D预测 PG37 L ip
的三级结构如图 4所示。折叠位于脂肪酶分子的
中央, 螺旋包围在 折叠的外面, 形成近似球形
的蛋白质分子, 该结构符合 /水解酶的结构特
点 [ 10]。根据来源于人胰腺组织 [ 11 ]和丝状真菌 Rhi
zomucorm iehei的脂肪酶空间结构的研究 [ 12] ,脂肪酶
中同样存在丝氨酸蛋白酶类的 H is、Ser和 A sp /G lu3
组合活性催化中心。 PG37 L ip I中 Ser132 A sp188
H is
241
3个氨基酸残基组成酶活性中心 [ 7] , 在空间结
构上充分集中, 构成酶的催化活性中心。丝氨酸残
基通过氢键与组氨酸相连, 天冬氨酸也通过羧基形
成的氢键与组氨酸相连,在反应过程中,三者通过与
底物形成四面体中间体复合物完成催化过程。Thr66
至 Val72之间的氨基酸残基形成的 螺旋 (盖子结构 )
覆盖在活性中心的上方。这种结构有利于催化过程
图 4 PG37 L ip 三级结构预测模型
中底物对活性中心亲和力的提高以及活性中间体的
稳定。而且界面激活现象通常与 ! 螺旋盖 ∀的重
新定向排列 (构象改变 )有关 [ 1 ]。
3 结论
预测了 PG37 L ip 全肽含多个疏水区域, 无明
显跨膜结构域,定位于胞外, N末端的 20个氨基酸
为信号肽,由此推断此蛋白属于分泌型蛋白。分析
了 PG37 L ip 成熟肽是等电点为 616、分子量约为
2729 kD的疏水性稳定蛋白, 带 3个负电荷; 包含
一个 L ipase_3的结构域, 属于 /水解酶超家族;
含多个蛋白激酶 C磷酸化位点、酪蛋白激酶#磷酸
化位点、豆蔻酰化位点等功能结构域, 并含有 13个
磷酸化位点;具有脂肪酸代谢的功能。
螺旋和不规则卷曲是 PG37 L ip 蛋白二级结
构的主要结构元件, 转角和伸展链分散在其中;
Ser
132 A sp188H is241 3个氨基酸残基组成酶活性中
心, 螺旋 (盖子结构 )覆盖在活性中心的上方, 界
面激活现象通常与盖子的构象改变有关。
参 考 文 献
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