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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 12期
洋葱黄矮病毒检测试剂盒的研制
贾玉成 1, 2 韦传宝 2, 3
(1安徽大学生命科学学院 ,合肥 230032; 2安徽省植物生物技术实训中心 ,六安 237012;
3皖西学院化学与生命科学系 ,六安 237012)
　　摘 　要 : 　根据已报道的洋葱黄矮病毒 (OYDV)序列设计引物 ,扩增洋葱黄矮病毒 (OYDV )六安分离物外壳蛋白 (CP)基
因。序列同源性分析结果表明 ,与目前已报道的 OYDV不同分离物 CP基因核苷酸序列同源性为 8410% ～9518% ,相应推测
的氨基酸序列同源性为 8618% ～9716%。将 CP基因插入原核表达载体 pSBET后在大肠杆菌 BL21 (DE3) Plys S中诱导表达。
通过 12% SDS2PAGE和 5% ～20%梯度 SDS2PAGE两次制备电泳纯化诱导产物 ,免疫家兔获得抗 CP血清 ,W estern blot分析对
CP具有高度特异性。硫酸铵沉淀初步 IgG,然后用 Protein A2Red Sepharose亲和层析进一步纯化 IgG, IgG与甘油 1∶1混合获得
效价 1∶4 800的一抗。将一抗、羊抗兔二抗和 42硝基苯基磷酸二钠组成 OYDV检测试剂盒 ,可用于田间 OYDV病样检测。
关键词 : 　韭葱黄条病毒 CP基因 原核表达 抗血清制备
Prokaryotic Expression of OYDV CP Gene and Preparation
of the Antibody Aga inst CP
J ia Yucheng1, 2 W ei Chuanbao2, 3
(1 School of L ife Science, Anhui University, Hefei 230032; 2 Plant B iotechnology Training Centre of Anhui Province, L iuan 237012;
3 Chem istry and B iology Departm ent of W estern Anhui University, L iuan 237012)
　　Abs trac t: 　Specific p rimer was designed to amp lify onion yellow dwarf virus(OYDV) L iuan isolate CP genes. It shared 8410% ～
9518% nucleotide acids identities and 8618% ～9716% am ino acids identities with the sequences of CP genes isolates reported in the
world. The CP gene was then inserted into pSBET and exp ressed in Escherichia coli BL21 (DE3) p lys S strain. The object p rotein was
purified by 12% SDS2PAGE firstly and subsequently 5% ～20% gradient SDS2PAGE. The antiserum against the CP was raised in rabbit
and its specificity was confirmed by W estern blot analysis. IgG against OYDV2CP was purified first by ammonium sulfate sedimentation
and then by Protein A2Red Sepharose affinity chromatography. The purified IgG and glycerol were m ixed by the ratio of 1∶1 and IgG
m ixture with 1∶4 800 value was obtained. Test kit consists of IgG againstOYDV2CP, IgG raised in sheep ( conjugated with alkaline phos2
phatase) against rabbit IgG and p2N itrophenyl Phosphate. The test kit p repared in this study could be suitable for OYDV detection.
Key wo rds: 　Leek yellow stripe virus CP gene Prokaryotic exp ression Antiserum p reparation
收稿日期 : 2009208211
基金项目 :安徽省植物生物技术实训中心项目
作者简介 :贾玉成 (19802) ,男 ,硕士研究生 ,研究方向 :病毒分子生物学
通讯作者 :韦传宝 (19612) ,男 ,副教授 ,博士 ,硕士生导师 ; E2mail: weichuanbao@ sina. com　　洋葱黄矮病毒 (onion yellow dwarf virus, OYDV )是一种世界上广泛分布的、危害葱属作物的最主要的病毒之一 ,属于马铃薯 Y病毒属病毒 [ 1 ]。感染OYDV的植株第一年表现为矮化 ,叶片伴随着局部不规则的发黄 ,后期整个叶片发黄 ,同时叶片出现向下卷曲 ,起皱 ,萎缩等症状。它也能引起储存和发芽的洋葱球茎退化变坏 [ 2 ]。OYDV还能引起繁殖期间 的洋葱花茎成条纹状卷曲一致扭曲变形 ,导致花和种子的数量大量减少 ,并影响种子的品质 [ 3～5 ]。葱受 OYDV感染后出现的症状比较相似 ,但叶片卷曲和植株矮化更加严重。OYDV对大蒜的危害已成为我国大蒜出口创汇的主要瓶颈。OYDV粒子呈弯曲线状 ,无包膜 ,长度 775 nm,直径 11～13 nm ,螺旋对称结构 ,螺距约为 314 nm。
2009年第 12期 贾玉成等 :洋葱黄矮病毒检测试剂盒的研制
OYDV粒子一般通过蚜虫以非持久方式传播 ,也可
以汁液的摩擦接种传播。试验表明葱属植物易感染
OYDV ,它们的根、叶、花和花粉都能带毒 ,而生长了
10～20 d的新鲜叶片是机械摩擦接种的最理想材
料 [ 6 ]。OYDV的核酸分子为单链正义 RNA,基因组
的 5′端序列结合有 VPg, 3′端有 Ploy(A)尾 [ 7～9 ]。报
道了 OYDV六安分离物 CP基因的克隆与表达 ,制
备特异性抗 CP血清和研制 OYDV 检测试剂盒的
方法。
1　材料和方法
1. 1 材料
OYDV感染的大蒜叶片采自安徽省六安市郊
区 ,置 - 80℃冰箱保存。大肠杆菌 ( Escherich ia coli)
TG1菌株和表达用菌株 BL21 (DE3) pLys S为 Phar2
macia产品 ; pGEM 2T、pSBET载体购自 Promega公
司 ; T4 DNA L igase、Ex Taq DNA 聚合酶、N de I、B am
H I、R ibonuclease H ( RNase H )、R ibonuclease Inhibi2
tor、AMV Reverse Transcrip tase、DNA L igation Kit ver.
2购自 TaKaRa公司 ; GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder
购自 MB I公司 ; Protein A2Red Sepharose ( H igh Ca2
pacity)购自 B ioword公司 ; SDS2PAGE M iddle Range
Protein MolecularW eight Standards购自 Gibco公司 ;
羊抗兔 IgG (碱性磷酸酶共价结合 )、52溴 24氯 23吲
哚磷酸 (BC IP)和氮蓝四唑 (NBT)购自 Sigama公
司 ;其它化学试剂均为分析纯以上进口产品分装。
引物合成与序列测定由上海生工完成。
1. 2　方法
1. 2. 1　病叶总 RNA提取与 cDNA合成 按照 RNeasy
Plant m ini (Q IAGEN )试剂盒提供的方法提取 RNA,
置 280℃保存。逆转录采用禽源逆转录酶体系 ,以其
为模板 , M42T [ 5′2GTTTTCCCAGTCACGAC ( T) 152
3′]为起始引物 , 20μl反应体系包括 : 1015μl模板
RNA (含 RNA 10 ng～112 μg)、210 μl起始引物
(100μmol/L) ; 410μl 10 ×逆转录反应缓冲液、210
μl 10 mmol/L dNTPs; 015μl Rnasin (40 U /μl) ; 1μl
AMV (5 U /μl)。42℃水浴合成 115 h后加 40μl灭
菌水 ,振匀后存入 - 30℃备用。根据陈剑平等 [ 10 ]报
道的 OYDV2CP序列设计 OYDV表达引物对 : OYDV
CPe ( + ) : 5′2CCTATTggCAggggAAggAgAAgA23′和
OYDV2CPe ( 2) : 5′2gggATCC2TCTACATTTTAATA
CCgAgCAAC23′。为了便于 CP基因的克隆和基因
表达 ,在 5′2端引物中引入了起始密码子 ATG和
N de I位点。
1. 2. 2　原核表达载体的构建 　以病样第一链 cDNA
为模板 , PCR扩增分离物全长 OYDV2CP基因 , PCR
扩增采用 LA Taq DNA聚合酶 ( TaKaRa公司 ) ,反应
体系参照厂家说明。扩增产物经 1% (w / v)琼脂糖
凝胶电泳分离后 ,预期的目的片段长度为 850 bp左
右 ,用 Q IAquick Gel Extraction试剂盒回收 ,方法参
照厂家说明。纯化产物导入 pGEM2T载体 ,转化 TG1
菌 ,蓝白斑筛选 ,提取阳性克隆质粒 , PCR 检测后
测序。
1. 2. 3　外源基因的诱导表达 　将含 OYDV2CP基
因的质粒用 N de I和 B am H I双酶切后插入到同样双
酶切的原核表达载体 pSBET中 ,并转化到大肠杆菌
BL21 (DE3) pLys S菌株中 ,用 IPTG诱导 2～3 h,离
心收集菌体 ,菌体悬浮于 200μl 1 ×SDS上样缓冲
液 ,沸水浴 10 m in,进行 SDS2PAGE后用考马斯亮蓝
G2250染色检测蛋白表达情况。
1. 2. 4　抗血清的制备和抗血清特异性检测 　将能
正确表达外源基因的大肠杆菌经裂解后与 2 ×SDS
上样缓冲液按 1∶1 ( v / v)混合 ,煮沸变性后进行 12%
的 SDS2PAGE分离。电泳完毕后用 0125 mol/L KCl
溶液染色 ,切下的目的蛋白条带用适量 1 ×SDS上
样缓冲液匀浆后离心 ,上清液进行 5% ～20%梯度
SDS2PAGE分离 ,电泳完毕后用 0125 mol/L KCl溶
液染色并切下目的蛋白条带。将含目的蛋白的凝胶
磨细后免疫家兔 ,共免疫 4次 ,前 3次间隔 7 d,第 4
次免疫 3 d 后颈动脉取血。用超离心法提取的
OYDV病毒粒子直接免疫家兔制备抗天然 OYDV
病毒颗粒抗血清 ,方法类似。W estern blot法检测
抗 CP血清的特异性 ,一抗为制备的抗血清 ,二抗
为羊抗兔 IgG (碱性磷酸酶共价结合 ) , BC IP /NBT
显色 [ 11 ] 。
1. 2. 5　 IgG纯化、效价测定与检测试剂盒的制备
先用 (NH4 ) 2 SO4沉淀法初步提取抗血清中的 IgG,然
后使用 Protein A2Red Sepharose ( high capacity)进一
步提取 IgG,具体操作按照说明书进行。亲和层析
洗脱后的 IgG经过浓缩、对 PBS透析、再浓缩后与甘
油按照 1 ∶1混合 (一抗 )。间接 EL ISA 法测定抗
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
OYDV2CP IgG的效价 [ 12 ]。将制备的一抗、购买的二
抗 ( Sigma公司生产的羊抗兔二抗 , IgG与碱性磷酸
酶共价结合 )和 42硝基苯基磷酸二钠盐 (p2NPP)组
成 OYDV检测试剂盒。
1. 2. 6　田间样品的间接 EL ISA法检测 　分别用原
核表达产物制备的抗 OYDV2CP血清和天然 OYDV
粒子制备的抗血清进行大蒜病叶 EL ISA 检测 [ 13 ] ,
P /N (被测样品孔吸光度值 /阴性样品孔吸光度
值 ) ≥211判断为阳性 ,比较两种抗血清检测结果
的异同。
2　结果
2. 1　OYDV2CP基因的克隆
用引物对 OYDV2CPe ( + ) /OYDV2CPe ( 2)从病
样 cDNA中扩增到 850 bp大小的预期片段 (图 1)。
纯化产物导入 pGEM 2T载体 ,转化 TG1菌 ,测序并
对序列进行 BLAST分析表明克隆的基因为 OYDV2
CP基因。
M. DNA 标准 (分子量标在左侧 ) ; 1. OYDV2CP基因扩增产物
图 1　OYD V2CP基因 RT2PCR扩增
产物琼脂糖凝胶电泳分析
212　OYDV外壳蛋白基因的原核表达
OYDV2CP经 B am H I和 N de I双酶切后插入到
pSBET原核表达载体 ,转化的大肠杆菌 BL21 (DE3)
LysS菌经 IPTG诱导表达。SDS2PAGE检测表明 ,诱
导产生 1个大小约为 30 kD的特异性表达条带 ,与
计算机推测的 OYDV2CP 分子量大小基本一致
(图 2)。
2. 3 抗血清的 W estern B lot检测
W estern B lot分析表明 ,原核表达制备的抗血清
1. 蛋白质标准 ; 2. BL21 (DE3) pLys S菌体蛋白 ; 3. OYDV2CP基因转
化 BL21 (DE3) pLys S菌未经过 IPTG诱导菌体蛋白 ; 4, 5. 分别是
OYDV2CP基因转化 BL21 (DE3) pLys S菌经过 IPTG诱导 2 h和 4 h
菌体蛋白
图 2　OYD V2CP转化的 BL21( D E3) pL ys S菌经
IPTG诱导表达后 SD S2PAGE检测
能与诱导产物特异结合 ,与菌体自身蛋白几乎无反
应 (图 3)。
2. 4 OYDV检测试剂盒的制备
每只家兔抗血清经过纯化制备约 7 m l一抗 ,与
甘油按照 1∶1混合获得效价 1∶4 800的一抗。将
015 m l一抗、20μl二抗和 500 mg 42硝基苯基磷酸二
钠盐 ( p2NPP)组成 OYDV 检测试剂盒 ,可以检测
100个样品。
M. 蛋白质标准 ; 1. BL21 (DE3) pLys S菌体蛋白 ( CK) ; 2. OYDV2CP
基因转化 BL21 (DE3) pLys S菌经过 IPTG诱导菌体蛋白
图 3　OYD V外壳蛋白抗血清的
2. 5 间接 EL ISA检测
间接 EL ISA检测结果表明 , 130个大蒜叶样品
中有 73份样品同时与 2种方法制备的抗血清都呈
阳性反应 ,有 2份样品仅与提纯病毒法制备的抗血
清呈阳性反应 ,用 RT2PCR复查确定为阴性 ,阳性检
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2009年第 12期 贾玉成等 :洋葱黄矮病毒检测试剂盒的研制
出率为 5612%。130个大蒜叶样品中有 82份样品
同时与 2种方法制备的抗血清都呈阳性反应 ,没有
出现与一种方法制备的抗血清有反应而与另一种方
法制备的抗血清没有反应的情况 ,阳性检出率
为 6311%。
3　讨论
病毒特异性抗血清制备最直接的方法是分离纯
化病毒 ,加佐剂后直接免疫动物。但侵染一种植物
的病毒往往有几种 ,且形态相似 ,导致分离的病毒往
往是几种病毒的混合物 ,制备的抗血清特异性较差。
通过纯化原核表达的外壳蛋白制备抗血清简便 ,而
且特异性强 ,但 SDS2PAGE制备电泳纯化外壳蛋白 ,
CP的空间结构被破坏 ,制备的抗体与抗原的结合是
序列特异性的结合 ,有时用此方法制备的抗体与病
毒粒子不能结合 ,导致不能用于间接 EL ISA检测。
本研究制备的抗血清检测病叶结果验证了能够与天
然病毒结合。
洋葱黄矮病毒是一种世界性大蒜病害 ,在亚洲
发生较重 ,严重影响大蒜的产量和品质。选育大蒜
无毒种子或者低感染率种子对提高大蒜产量有现实
意义。因为从很多样本中才能筛选出个别无毒苗 ,
如果用 RT2PCR的方法检测人力和物力的消耗都很
大 ,有了 OYDV检测试剂盒可以方便、经济地对大
量样本进行筛选。
参 考 文 献
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(上接第 67页 )
又因其为晚期基因 ,缺失时可能并不影响 DNA 复
制 ,而只是影响核衣壳的组装 [ 14 ] ,进而影响病毒在
自然界的中的传播 ,这为目前杆状病毒作为无污染
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