全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 2期
番茄脂氧合酶基因的表达和酶活性分析
胡廷章 肖国生 陈再刚 石汝杰 吴应梅
(重庆三峡学院生物系,重庆 404100)
摘 要: 将番茄脂氧合酶基因 Tom loxD克隆至酵母表达载体 pP IC9K中,转化毕赤酵母 GS115菌株, 构建组成型表达
Tom loxD的酵母工程菌株。 SDS-PAGE和W estern blot分析表明,经甲醇诱导, T om loxD蛋白在酵母中得到表达 ,表达的融合蛋
白分子量约为 103. 56 kD, 与预测的分子量一致。酶活性分析表明, 酵母中表达的 Tom loxD蛋白具有脂氧合酶活性。半定量
RT-PCR分析表明, T om loxD基因在番茄中表达受机械损伤的诱导, 损伤处理的番茄叶片中脂氧合酶的活性明显增高。说明
Tom loxD基因在番茄防御信号中发挥作用。
关键词: 脂氧合酶 番茄 脂氧合酶活性 毕赤酵母 Tom loxD
Expression and Activity Analysis of L ipoxygenase
Gene in Tomato
Hu T ingzhang X iaoGuosheng Chen Za igang ShiRujie W uY ingm ei
(D epartm ent of Biology, Chongqing Three Gorges University, Chongqing 404100)
Abstrac:t The Tom loxD gene w as c loned into pP IC9K vector and w as transform ed into P ichia pastoris expression host strain
GS115. A transform ant strain w as se lected. The m o lecular w e ighs o f the express ion fusion prote in w ere about 103. 56 kD. SDS-PAGE
andW estern blot analysis of the concentrated supernatant confirm ed the exogenous Tom loxD gene was expressed e ffic iently in trans-
form ed yeast and a nove l pro tein band about 100 kD w as the fusion prote in. The analysis o f lipoxygenase activ ity show ed the Tom loxD
transgen ic yeast had h igh leve ls of lipoxygenase activ ities, wh ich demonstrate the Tom loxD prote in has lipoxygenase activ ity. The sem -i
quantitative RT-PCR ana lysis suggested that theTom loxD expression w as response tom echan ical injury, and the change of lipoxygenase
activ ities exh ib ited the same as that o f Tom loxD gene transcr ipt after m echan ica l injury. The find ings show ed Tom loxD m ay play a ro le
as a com ponent o f the octadecano id defense-signaling pa thway.
Key words: L ipoxygenase Tom a to L ipoxygenase ac tiv ity P ichia pastor is Tom loxD
收稿日期: 2010-09-02
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30771464) ,教育部 春晖计划 项目 ( Z2007-1-63006) ,重庆市教育委员会科学技术研究项目 ( K J101111 )
作者简介:胡廷章,男,教授,博士,研究方向:生物化学与分子生物学; E-m ai:l tzhu2002@ yahoo. com. cn
自 1932年首次发现脂氧合酶 ( lipoxygenases,
LOXs, EC 1. 13. 11. 12)后, 脂氧合酶的研究取得了
长足发展 [ 1]。在动物、植物和微生物中都发现有脂
氧合酶 [ 2, 3]。LOX在真核生物中参与不饱和脂肪酸
的代谢。
植物脂氧合酶是一类由单一的多肽链组成的含
有非血红素铁、不含硫的过氧化物酶, 它催化具有
顺,顺-1, 4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸的双加
氧反应, 如亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸。在植物不
同发育阶段存在着不同的类型。LOX参与植物的
伤害反应、病原攻击、种子萌芽、果实熟化、植物衰老
以及脱落酸和茉莉酸合成等生理生化反应 [ 4, 5 ]。
番茄中有 5个 LOX同工酶基因, 即 Tom loxA、
Tom loxB、Tom loxC、Tom loxD和 Tom loxE。 Tom loxA、
Tom loxB和 Tom loxE相互之间的氨基酸序列的一致
性是 72% - 77%, 而 Tom loxC和 Tom loxD与 Tom-
loxA蛋白的一致性分别是 42%和 47%, Tom loxC与
Tom loxD的蛋白的一致性是 46%。Tom loxA, Tom-
loxB, Tom loxE在果实中表达; Tom loxC在成熟果实
的转色期和红熟期可以检测到, 在叶片和花器中也
有表达;而 Tom loxD主要在番茄叶中表达,在果实的
成熟绿色期和熟化开始阶段, Tom loxD表达量很
2011年第 2期 胡廷章等:番茄脂氧合酶基因的表达和酶活性分析
低 [ 6]。Tom loxC和 Tom loxD具有叶绿体导向信号,
定位于叶绿体。这些结果表明,不同的 LOX异构体
受到不同的调节,在番茄的生长发育过程中有不同
的功能 [ 6]。
本研究以番茄 Actin基因为内参, 通过半定量
RT-PCR,研究 Tom loxD基因在番茄受到机械损伤后
的表达情况,并分析了脂氧合酶的活性变化;同时,
构建 Tom loxD毕赤酵母表达载体 pPIC9K-TomD,在
酵母中表达 Tom loxD,分析 Tom loxD的活性。
1 材料和方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 植物材料 野生型番茄 (Solanum lycopersi-
cum M il.l Cv. A ilsa C raig, AC
+ +
)由本实验室保存。
1. 1. 2 菌种、载体和引物 大肠杆菌 TOP10、毕赤
酵母 GS115菌株、酵母表达载体 pPIC9K由本实验
室保存。试验所用引物见表 1。
表 1 用于 PCR扩增引物的核苷酸序列
序列号 引物 序列 ( 5- 3)
1 TomDS f GACAAGCAATAGCAGGAGTG
2 TomDS r TAAGTGTGCCAACATCAGAC
3 Actin f TGAAATGTGACGTGGATATTAGG
4 Actin r TGAGGGAAGCCAAGATAGAGC
5 TomD J f
CACCGAATTCCATCACCATCACCATC-
ACGATGATGATGATAAGATGGCACTT-
GCTAAAGAAATT
6 TomD J r
GTCGGCGGCCGCTCATATCGATACAC-
TATTTGGAA
7 pP IC9K f TACTATTGCCAGCATTGCTGC
8 pP IC9K r GGCAAATGGCATTCTGACATC
1. 1. 3 试剂及仪器 RNA提取试剂盒、Taq DNA
聚合酶、限制性内切酶、T4连接酶、酶切产物纯化试
剂盒和 M-MuLV反转录酶等购自于 TaKaRa公司;
蛋白 M arker来自 Promega公司; DL-2000+ DNA标
准 Marker等购自北京鼎国生物技术有限公司; 一抗
(鼠抗人 6 H isT ag抗体 )和辣根过氧化物酶标记的
二抗 (羊抗鼠抗体 )购自 Invitrogen;引物的合成和样
品的测序是由上海英骏生物技术公司负责完成。
PCR扩增仪、全自动凝胶成像系统、水平垂直多
用电泳仪、电穿孔仪、垂直凝胶电泳系统、半干转膜仪
购自 B io-Rad公司; 低温高速离心机为 Eppendorf产
品、521紫外分光光度仪购自 Beckman公司;超滤浓
缩离心管 (规格: 5 kD 15 mL)购自 Sartorius公司。
1. 1. 4 培养基 YPD培养基、BMGY培养基等参
考 Inv itrogen公司的毕赤酵母表达手册。
1. 2 方法
1. 2. 1 番茄的培养和处理 将番茄种子浸泡在水
中 4 h,播种在盛土壤的钵中培养, 放置在光照培养
箱内等待发芽, 培养温度为 26 /19 , 光 /暗周期为
16 h /8 h。待番茄幼苗大约 5 cm 高, 转到温室中
培养。
取番茄植株叶片,用剪刀沿叶缘剪至主脉 5- 6
刀, 且不损伤主脉, 放入铺有浸湿滤纸的密闭玻璃瓶
内, 分别于 0、2、6、12和 24 h收集番茄叶, 立即投入
液氮中,于 - 80 冷藏备用。
1. 2. 2 Tom loxD基因在损伤番茄叶中的表达分析
总 RNA的提取和反转录按照试剂盒说明书进行。
半定量 RT-PCR检测伤害处理番茄的 Tom loxD
基因表达。参照 G enB ank中番茄 Tom loxD基因序列
( U37840. 1) , 设计引物 TomDS f和 TomDS r引物
(表 1), 扩增 Tom loxD基因片段的长度为 294 bp。
将番茄持家基因 Act in作为内源参照,参照 GenBank
中番茄的 A ctin序列 ( U60480) , 设计引物 A ctin f和
Act in r(表 1), 扩增的 ACTIN1基因片段长度应为
201 bp。分别以未经处理的番茄叶和经伤害处理的
番茄叶总 RNA的反转录产物为模板, 用 TomDS -f
TomDS r和 A ctin -f Act in r引物分别进行 PCR。
1. 2. 3 伤害处理番茄叶的脂氧合酶活性分析 脂氧
合酶粗提液的提取:取 1. 0 g番茄叶片置于研钵中,于
液氮充分研磨后,加 10mL冰上预冷的 pH7. 0磷酸缓
冲液 0. 2mol /L,于 4 11 000 r/m in离心30m in,取
上清液用于脂氧合酶活性测定。
采用 Bradford检测法测定样品蛋白的含量 [ 7]。
分光光度法分析脂氧合酶活性 [ 8] , 根据公式 A =
4 [ OD( 30 s) - OD ( 15 s) ] /0. 01计算出酶活性。
酶的活性单位定义:在 25 下,每分钟增加 0. 01吸
光度所需的活性作为番茄脂氧酶的一个活性单位。
1. 2. 4 Tom lox D基因毕赤酵母表达载体构建 参
照 GenBank中 Tom loxD基因的序列 ( U37840. 1)序
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
列,设计 Tom loxD基因全长序列引物 TomD J f和
TomD J r(表 1) ,前引物添加 E coR I酶切位点与 H is-
Tag序列标签, 后引物添加 No t I酶切位点, 通过
PCR扩增 Tom loxD基因全长序列并引入酶切位点,
将纯化的 PCR产物与 pPIC9K载体分别用 E coR I
和 N ot I酶切,然后连接,转化大肠杆菌 Top 10感受
态细胞,用载体 pPIC9K上的特异性引物 pPIC9K f
和 pPIC9K r进行 PCR检测筛选阳性克隆 (表 1)。
碱法抽提质粒, BamH I酶切鉴定、测序分析,得到重
组的表达载体 pPIC9K-TomD。
1. 2. 5 转 Tom loxD基因酵母工程菌的获得和诱导
表达 用 Sal将构建好的 pPIC9k-TomD载体酶切
线性化后,电转化 GS115, PCR检测鉴定阳性克隆。
步骤详见参考文献 [ 9]。
毕赤酵母的诱导表达方法参照 Inv itrogenP ichia
pastoris Expression K it试剂盒说明书。1. 0%的甲醇
诱导培养 72 h后收集菌液, 4 离心 5 m in,收集上
清液; 将上清液加入到截流分子量为 5 kD的 15mL
超滤离心管中,超滤离心浓缩。
1. 2. 6 SDS-PAGE和 Western B lot检测 Tom loxD基
因在酵母中的表达 采用 5%的浓缩胶及 12%的分
离胶, SDS-PAGE检测转化子的蛋白表达。
将 SDS-PAGE电泳后的凝胶用半干转印法转印
PVDF膜,恒流 200mA、60m in电转后, 5%脱脂奶粉
封闭 2 h, PBST溶液洗膜 3次, 每次 10 m in, 再与一
抗 (鼠抗人 6 H is Tag抗体 )在室温下作用 3 h,
PBST溶液浸洗膜 3次后与二抗 (辣根过氧化物酶标
记的羊抗鼠抗体 )作用 1 h, PBST溶液洗膜 3次,使
用 DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒进行显色。
1. 2. 7 酵母表达产物 Tom loxD的酶活性分析 分
光光度法分析 Tom loxD的脂氧合酶活性 [ 8 ]。
2 结果
2. 1 Tom loxD基因在损伤番茄叶中的表达
用有内源参照的半定量 RT-PCR 方法分析
Tom loxD基因在番茄中的表达, 表明在损伤处理番
茄叶片后, Tom loxD在番茄叶片中表达量增加, 处理
2 h后, Tom loxD的表达量达到最大 (图 1 ), 说明
Tom loxD的表达受到损伤的诱导。推测 Tom loxD基
因在番茄损伤、抗逆等方面发挥作用。
1- 5.损伤处理时间分别为 0、2、6、12和 24 h
图 1 半定量 RT-PCR分析损伤番茄
叶片的 Tom lox D的表达
2. 2 受伤害处理番茄的脂氧合酶活性升高
取机械损伤的番茄叶片, 以未处理的叶片为对
照, 提取脂氧合酶粗提液, 测定叶片总脂氧合酶活
性, 结果 (图 2)表明,损伤处理番茄叶片中脂氧合酶
的活性升高,并且在处理 2 h后达到最大, 是未处理
叶片酶活性的 1. 84倍。由此可以看出, Tom loxD
mRNA表达受损伤的诱导, 随着 Tom loxD mRNA表
达水平的提高,叶片组织中的总脂氧合酶的活性也
升高,说明 Tom loxD蛋白是一种脂氧合酶,参与了损
伤胁迫反应。
数据是 3次独立试验测得的平均值 SD
图 2 损伤处理番茄叶片的脂氧合酶活性
2. 3 pPIC9K-TomD重组表达载体的鉴定
利用 RT-PCR技术, 用引物 TomDJ f和TomDJ r
扩增 Tom loxD基因编码序列, 将纯化的 PCR产物与
pPIC9K载体分别用 E coR I和 N ot I酶切、回收、连
接, 得到重组表达载体 pPIC9K-TomD, 转化大肠杆
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菌 TOP10感受态细胞。用载体 pPIC9K上的特异性
引物 pPIC9K1和 pPIC9K2进行 PCR检测筛选阳性
克隆, 有与预测大小相符的 2 800 bp左右条带的克
隆为阳性转化子 (图 3 )。碱法抽提质粒, 进一步
BamH I酶切验证, 得到与预测相符 500 bp左右条
带 (图 4)。进一步测序分析,得到正确的重组表达
载体 pPIC9K-TomD。
M. DNA M arker; 1 - 6.分别为筛选的克隆
图 3 菌落 PCR鉴定 pPIC9K-TomD转化的
大肠杆菌阳性克隆
M. DNA M arker; 1. pPIC9K-D质粒; 2. pPIC9K-TomD
质粒的 B amH I酶切产物
图 4 酶切鉴定 pP IC9K-TomD转化的大肠杆菌阳性克隆
2. 4 重组酵母的获得与鉴定
限制性内切酶 Sal I线性化处理的重组质粒用
于电激转化毕赤酵母 GS115,利用引物 TomDS f和
pPIC9K r进行 PCR扩增, 有与预测大小相符的
1 600 bp左右条带的克隆为阳性转化子,重组表达
载体 pPIC9K-TomD成功整合入酵母基因组 DNA中
(图 5)。
M. DNA m arker; 1- 4.分别为筛选的克隆
图 5 菌落 PCR鉴定 pP IC9K-TomD转化的
毕赤酵母阳性克隆
2. 5 Tom loxD基因 cDNA在酵母中的表达及酶活
性分析
2. 5. 1 Tom loxD基因 cDNA在酵母中的表达和鉴
定 用 BMGY培养基摇瓶培养, 1. 0%的甲醇诱导培
养 72 h后, 离心收集上清液, 将上清液超滤离心浓
缩。SDS-PAGE分析,获得的 Tom loxD蛋白带与预测
的 Tom loxD融合蛋白大小一致,约为 103. 56 kD(图
6)。Western b lot分析表明,重组载体 pPIC9K-TomD
转化的酵母上清液中有约 103. 56 kD左右的蛋白条
带,而空载体转化的酵母无相应条带 (图 7)。以上结
果说明,目标蛋白在毕赤酵母中得到了表达。
M. M arker; 1. pPIC9K (对照 ) ; 2. pP IC9K-TomD
图 6 SDS-PAGE电泳分析超滤浓缩的 Tom loxD
转基因酵母上清液
M. M arker; 1. pPIC9K-T omD; 2. pPIC9K (对照 )
图 7 W estern b lot分析超滤浓缩的 Tom loxD
转基因酵母上清液
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
2. 5. 2 Tom loxD蛋白的酶活性分析 收集甲醇诱
导 72 h的 pPIC9K-TomD酵菌和 pPIC9K酵母菌液,
离心后取上清进行超滤, 超滤浓缩的上清用于脂氧
合酶活性分析。从图 8中可以看出, 在超滤浓缩的
上清液中,转 Tom loxD基因酵母的脂氧合酶活性较
高,而转空载体的对照菌株几乎没有脂氧合酶活性,
说明 Tom loxD蛋白具有脂氧合酶活性, Tom loxD基
因编码的是脂氧合酶蛋白。
数据是 3次独立试验测得的平均值 SD
图 8 转基因酵母表达外源 Tom loxD酶的活性测定
3 讨论
在毕赤酵母 GS115中表达番茄 Tom loxD蛋白,
SDS-PAGE电泳和W estern blot分析表明,发酵的上
清液中分泌有 Tom loxD融合蛋白, 脂氧合酶活性分
析证明 Tom loxD融合蛋白具有脂氧合酶活性,说明
Tom loxD基因编码的是一种脂氧合酶。由于试验采
用的毕赤酵母表达系统所表达的是分泌蛋白, 表达
的蛋白产物分泌到培养液中,离心后获得的上清液
中杂蛋白很少,又由于采用超滤离心进行浓缩,进一
步除去了小分子杂蛋白。因此, SDS-PAGE电泳分
析只发现少量的杂蛋白带。由于 Tom loxD的分子量
较大 (预测的融合蛋白为 103. 56 kD) ,转移到 PVDF
膜上较困难, 因此, W estern b lo t分析只得到一条较
弱的特异带。
已有的研究表明, Tom loxA、Tom loxE和 Tom lox B
与马铃薯的 Lox1是高度同源的,氨基酸的一致性分
别是 92%、75%和 69%。Tom loxB、Tom loxE和 Tom-
loxA很可能催化产生 9-过氧化氢物 [ 6, 10, 11]。Tom loxC
定位在叶绿体, Tom loxC能以亚油酸和亚麻酸为底物
产生 13-过氧化氢物。在番茄中共抑制和反义抑制
Tom loxC的表达,使脂肪酸衍生的短链挥发物醛和醇
的含量大大降低,导致在果实和叶中风味挥发物的大
幅度下降 [ 6 ]。
Tom loxD主要在番茄叶中表达, Tom loxD也有叶
绿体导向信号 [ 6]。 Tom loxD与马铃薯 Lox3在氨基
酸水平有 92%的一致性, Lox3在马铃薯的叶和根中
表达, 产生 13-过氧化氢物 [ 12]。Lox3基因沉默的马
铃薯的蛋白酶抑制剂大大降低,表明在 Lox3基因防
御信号中起作用 [ 13]。本研究表明, Tom loxD的表达
受到损伤的诱导, 损伤处理的番茄叶片中脂氧合酶
的活性明显增高。说明损伤叶片中的总脂氧合酶的
活性的升高是由于 Tom loxD表达的提高引起的。由
于 Tom loxD与马铃薯 Lox3的蛋白高度同源, 有理由
推测 Tom loxD也催化产生 13-过氧化氢物,并且在番
茄损伤、抗逆等防御信号中发挥作用。
本研究在毕赤酵母 GS115中的组成型表达
Tom loxD, 并证明 Tom loxD基因编码的是一种脂氧合
酶蛋白, Tom loxD的表达受到损伤诱导, 说明 Tom-
loxD在番茄损伤、抗逆等方面发挥作用。这为进一
步研究 Tom loxD基因在番茄中的功能及番茄的防御
机制奠定基础。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫 )
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(责任编辑 马鑫 )
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