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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 3 期
牦牛 OB基因的克隆及原核表达
唐懿挺1 姬秋梅2 张成福2 柴志欣1 赵上娟1 白雪1 信金伟2 钟金城1
(1西南民族大学 动物遗传育种学国家民委 －教育部共建重点实验室，成都 610041;2西藏自治区农业科学院畜牧兽医研究所，拉萨 850000)
摘 要: 肥胖基因(obese gene，OB gene)表达产物瘦蛋白(leption)具有调节体重、影响动物生长和繁殖率等一系列生物
学功能。通过牦牛脂肪组织总 RNA的提取，利用 RT-PCR克隆出牦牛 OB基因的成熟肽 cDNA，构建 OB基因的原核表达载体
OB-pET32a(+) ，在大肠杆菌表达系统使融合蛋白表达，通过 SDS-PAGE检测所表达的融合蛋白。结果表明，克隆的 OB基因成
熟肽片段为 456 bp包含 EcoR I和 BamH I两个酶切位点，与普通牛、瘤牛该基因的相似性达 98． 6%。原核表达产物为包涵体
形态，大小为 31 kD，符合预期结果，为 OB基因的高效表达系统的构建奠定基础。
关键词: 牦牛 OB基因 克隆 原核表达
Cloning of Yak Obese Gene and Its Prokaryotic Expression
Tang Yiting1 Ji Qiumei2 Zhang Chengfu2 Chai Zhixin1 Zhao Shangjuan1 Bai Xue1 Xin Jinwei2 Zhong Jincheng1
(1Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding，State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education，Southwest University
for Nationalities，Chengdu 610041;2 Institute of Animal Science and Veterinary，Academy of Agricultural
Sciences，Tibet Autonomous Region，Lhasa 850000)
Abstract: The leptin of obese gene expression can regulate body weight，affecting animal growth，reproductive rates and a series of
biological functions． We extracted total RNA of fat tissue of yak，cloned mature peptide cDNA of OB gene of yak by RT-PCR，construct
prokaryotic expression vector OB-pET32a (+)of OB gene，take it in E． coli expression system for fusion protein express，then detected
fusion protein expression by SDS-PAGE． The results showed OB gene mature peptide fragment have 456 bp，which contain EcoR I and
BamH I two restriction sites． The similar between yak and Bos Taurus，Bos indicus is 98． 6% ． The products of prokaryotic expression is
inclusion body shape，31 kD，consistent with expected results，established a basis of OB gene efficient expression system．
Key words: Yak OB gene Cloning Prokaryotic expression
收稿日期:2010-11-22
基金项目:西南民族大学研究生创新型科研项目
作者简介:唐懿挺，男，硕士研究生，研究方向:分子遗传学与基因工程;E-mail:yaobo12@ sina． com
通讯作者:钟金城，男，博士，教授，研究方向:动物遗传学;E-mail:zhongjincheng518@ 126． com
肥胖基因(obese gene，OB gene)又称为 Leptin
基因。该基因的表达产物瘦蛋白对家畜脂肪组织
和神经内分泌有显著的调控作用，可通过对采食
量和家畜能量平衡的调节，促进家畜的生长、繁殖
和泌乳性能，提高其免疫功能，其中较重要的作用
是对家畜体重和能量平衡的调节。OB 基因可作
为动物生长和脂肪蓄积等性状的候选基因。研究
人员对该基因在普通牛、鼠、猪等动物中均作了大
量的研究［1 － 5］。但对牦牛而言，目前在国内外除
本试验室外尚未见 OB 基因的研究报道［6］。本研
究对牦牛 OB 基因编码的成熟肽克隆并进行原核
表达构建，旨在构建牦牛 OB 基因原核表达系统，
为日后构建 Leptin 高效表达系统，实现该蛋白在
生产性能方面的应用，进而为分析、改善牦牛肉
质、泌乳力性状打下基础。
1 材料与方法
1． 1 试验动物及总 RNA提取
试验用麦洼牦牛的脂肪组织取自成都青白江屠
宰场，所取组织置于液氮内带回实验室，－ 80℃保存
备用。
麦洼牦牛脂肪组织中总 RNA 的提取按英骏公
司 Trizol 说明书的方法提取，溶于 RNase FREE 水
2011 年第 3 期 唐懿挺等:牦牛 OB基因的克隆及原核表达
中，－ 80℃保存。用琼脂糖凝胶电泳检测 mRNA 的
纯度后，分装备用。取 3 － 5 μL，总 mRNA根据 Fer-
mentas反转录试剂盒操作说明 RT-PCR反转录生成
cDNA，保存于 － 20℃备用。
1． 2 PCR扩增、克隆及测序
根据普通牛 OB基因全序列(GenBank 登录号:
NM_173928) ，通过 SignalP软件和 DNAMAN软件分
析信号肽和扩增片段内部所含酶切位点，综合使用
Primer Premier 6． 0 和 oligo 6． 0 软件设计一对特异
引物对 OB 基因编码的成熟肽序列进行扩增，上下
游引物分别加入 BamH I 和 EcoR I 酶切位点，并将
编码成熟肽的第二位密码子 CCC 转变成大肠杆菌
常用密码子 CCG，其中:上游引物(obF) :5-CGG-
GATCCGTGCCGATCAGCAAGGTCCAGG-3;下游引
物(obR) :5-GGAATTCTCAGCACCCAGGACTGAG-
GTCC-3，预期扩增目的片段长度为 456 bp 左右，由
上海英潍捷基贸易有限公司(InvitrogenTM)合成。
PCR扩增体系(25 μL) :premix Ex Taq 12． 5
μL，上、下游引物分别为(20 μmol /L)1 μL，模板
DNA (25 － 50 ng /μL)1 μL，超纯水 9． 5 μL 。
PCR反应程序:95℃预变性 2 min;95℃变性
30 s，64℃退火 60 s，72℃延伸 75 s，35 个循环;最后
72℃延伸 5 min 后冷却至 4℃保存。PCR 产物经
1%琼脂糖凝胶(含 GoldView 核酸染料)电泳，凝胶
成像系统分析检测结果。
根据检测结果，对 OB 基因 PCR 产物用胶回收
试剂盒(OMEGA生物技术有限公司)进行胶回收分
离纯化，纯化的目的片段与 pMDTM19-T载体于 16℃
连接过夜，后转化到 JM109 感受态宿主菌中培养;
再将菌液涂布在含有 X-Gal 底物、IPTG 诱导物和氨
苄青霉素(Ampr)抗生素的 LB 平板上，利用蓝白斑
筛选法筛选;用接种环挑取白色单一菌落，在含氨苄
青霉素(Ampr)的 LB 液体培养基中培养过夜，利用
质粒提取试剂盒提取菌液质粒，最后用提取的质粒
进行 PCR反映分析以确保克隆成功［7］;检测克隆成
功的质粒送上海英潍捷基贸易有限公司进行测序。
1． 3 原核表达重组子的构建
将转化有 pET32a(+)质粒的菌液和带有 OB 成
熟肽基因的 OB-pMDTM19-T质粒菌液，采用碱裂解
法提取质粒，经 EcoR I和 BamH I双酶切 2 － 4 h，用
DNA凝胶回收试剂盒回收约 5． 9 kb 的载体片段和
约 450 bp的目的片段。接着将胶回收的 OB成熟肽
基因和表达载体 pET32a(+)质粒在 T4 DNA 聚合酶
作用下定向连接，构建重组质粒 OB-pET32a(+)。
1． 4 重组子的转化和鉴定
将重组质粒 OB-pET32a (+)转化到 E． coli
JM109 受体菌中，挑选阳性克隆。从阳性克隆中提
取质粒，转化到 BL21(DE3)受体菌。将转化后的受
体菌涂布到含 50 μg /mL Ampr的 LB平板上，37℃培
养过夜。从转化平板上挑取数个菌落，接种 2 mL于
含 50 μg /mL Ampr的 LB液体培养基中，37℃恒温振
荡过夜。提取质粒。
以提取的质粒作模板，进行 PCR 鉴定，用未经
转化的 BL21(DE3)作为阴性对照，将 PCR 鉴定过
的重组子 OB-pET32a(+)进行序列测定。
1． 5 重组菌的培养
取构建的阳性表达克隆 OB-pET32a(+)-BL21
(DE3)接种于 5 mL LB 液体培养基(含 Ampr)中，
37℃培养过夜。次日，用此种子培养液按 10%的量
接种于 250 mL LB液体培养基(含 Ampr)中，37℃培
养 3 h，此时培养液的 OD600约为 0． 5 左右，加入 100
mmol /L的 IPTG，使其终浓度达 1 mmol /L。继续培
养 7 h，每隔 1 h取 1 mL菌液，－ 20℃保存备用。
1． 6 表达产物的 SDS-PAGE电泳
将保存的菌液离心收集菌体，沉淀中加入 100
μL 的 SDS-PAGE 电泳上样缓冲液，煮沸 5 min，
12 000 r /min 离心 10 min，取 10 μL菌体裂解液上清
进行点样电泳，同时用含 pET32a(+)空白质粒的
BL21(DE3)菌和未经诱导的含 OB-pET32a(+)质粒的
BL21(DE3)菌作空白对照，以蛋白分子量标准作为分
子量对照。
2 结果与分析
2． 1 PCR扩增产物
参照普通牛 OB 基因序列(GenBank 登录号:
NM_173928) ，预测克隆的牦牛 OB 基因成熟肽 PCR
产物大小 456 bp。从图 1 可见，OB 基因的成熟肽
PCR产物在 500 bp下面有两条带，与预期结果大致
相当的条带做胶回收试验进行验证。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
M． DNA Marker 2000;1，2． PCR产物
图 1 PCR产物的电泳结果
2． 2 重组质粒的鉴定
将转化后的菌液提取质粒，用 PCR方法鉴定阳
性重组质粒，经琼脂糖凝胶电泳，筛选到含有插入目
的片段的阳性重组质粒，表明连接成功 (图 2)。
M． DNA Marker 2000;1，2．阳性质粒中的 OB基因
图 2 重组质粒的 PCR鉴定
2． 3 牦牛 OB基因的核苷酸序列
测序结果利用 ClustalX和 MEGA软件进行序列
比对分析，与普通牛(NM_173928、BT020625)和瘤
牛(EU313203)的相应基因相似性为 98． 6%(图 3，
图 4)。结果证明，已经成功克隆出牦牛 OB 基因成
熟肽片段。
［ 334］
［ 144363］
［ 008632］
YAK AGGCTT
Cattle_A TAATCC
Cattle_B TAATCC
Indicus CAATCC
图 3 牦牛 OB基因碱基序列变异
将测序结果进行变异分析，发现牦牛 OB 基因
成熟肽部分与普通牛和瘤牛的相应基因序列比较，
共有 6 个位点生突变，5 个为替换，1 个为颠换，前 3
个突变发生在第二外显子处，后 3 个突变发生在第
三外显子，其中第二外显子的 2 个突变引起了氨基
酸的改变(图 4)。
［ 1］
［ 44］
YAK SV
Cattle_A CI
Cattle_B CI
Indicus RI
图 4 牦牛 OB基因成熟肽氨基酸变异
2． 4 原核表达载体的构建
将构建好的 OB-pMDTM19-T 质粒和空白 pET32a
(+)质粒同时进行双酶切(图 5)。
M． DNA Marker 2000;1． pET32a(+)质粒;
2． OB-pMDTM19-T质粒
图 5 空白 pET32a(+)质粒和 OB-pMDTM19-T
质粒双酶切图
通过双酶切再次验证扩增片段被成功的扩增，接
着将经过双酶切获得的成熟肽片段和同时经过双酶
切的 pET32a(+)质粒通过 T4DNA 聚合酶连接，再转
入 BL21(DE3)受体菌过夜培养。为了验证OB-p
ET32a(+)是否连接成功，将过夜培养的菌液提取质
粒进行测序，同时进行 PCR和双酶切验证(图 6) ，结
果表明成功构建了 OB-pET32a(+)质粒。
2． 5 重组 OB-pET32a(+)融合蛋白的诱导表达及
SDS-PAGE分析
含重组质粒的大肠杆菌接种 LB 液体培养基，
经 IPTG诱导培养 7 h，每 1 h取 1 mL菌液抽提融合
蛋白，用 pET32a(+)空载体的菌液和无 IPTG诱导的
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2011 年第 3 期 唐懿挺等:牦牛 OB基因的克隆及原核表达
M． DNA Marker 2000;1．OB-pET32a(+)质粒双酶切;
2. OB-pET32a(+)PCR产物
图 6 OB-pET32a(+)质粒双酶切图及该质粒 PCR产物
OB-pET32a(+)菌液作为对照，经 SDS-PAGE 分析，
结果在 31 kD处出现较浓的蛋白条带(图 7)。由于
pET32a(+)载体表达的蛋白分子量为 15 kD，而 OB
基因表达的成熟肽蛋白分子量为 16 kD，根据 SDS-
PAGE 分析，融合蛋白分子量正好是二者之和，在
3 h 后表达量达到峰值，说明 OB与 pET32a(+)实现
了融合表达。
M．蛋白质 Marker III 18 － 94 kD;1－ 7． 1－ 7 h OB-pET32a
(+)融合蛋白表达产物;X.空载体菌液;Y.无 IPTG 诱导
OB-pET32a(+)融合蛋白表达产物
图 7 OB-pET32a(+)融合表达结果
3 讨论
本研究中，在牦牛 OB 基因成熟肽基因扩增时
加入了常用的 EcoR I 和 BamH I 两个酶切位点，在
不改变氨基酸组成的情况下，将第二位密码子 CCC
改变成大肠杆菌常用密码子 CCG。目的是为了提
高酶切效率和 OB-pET32a(+)融合蛋白的表达
效率。
经比对分析，牦牛 OB 基因成熟肽序列与普通
牛、瘤牛之间的相应基因序列相似性达到 98． 6%，
6 个突变位点中只有 2 个引起了氨基酸序列的改
变，这说明扩增的序列是牦牛 OB 基因，同时表明
在进化过程中 OB 基因作为功能基因是比较保
守的。
经 SDS-PAGE分析发现，在空载体的 BL21 和无
IPTG诱导的菌液中融合蛋白没有表达或者表达量
很少，经 IPTG 诱导的 OB-pET32a(+)融合蛋白以包
涵体形式存在，在 3 h后达到表达峰值。结果表明，
本研究成功在大肠杆菌中实现了牦牛 OB 基因的表
达，为将来建立 OB 基因的高效表达提供了试验
依据。
牦牛作为青藏高原主要产肉、产奶家畜，提高牦
牛的泌乳量、产肉率具有重要的经济意义。目前利
用传统的育种技术改良牦牛的泌乳和产肉性能进展
缓慢，尽管分子生物学技术、标记辅助选择研究有可
能提高牦牛的产肉、产乳性能，但相关的基础研究十
分有限［8 － 13］。人、鼠和猪的肥胖与肥胖受体基因的
克隆与分析表明，牦牛 OB 基因的克隆和原核表达
研究对改良牦牛的产肉性能、提高泌乳量具有重要
意义［14］。目前国内有关牦牛 OB 基因的研究仅见
本实验室的报道，牦牛 OB 基因原核表达的成功在
国内尚属首次，这为将来 Leption蛋白在生产性能方
面的研究应用提供了理论基础。
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(责任编辑 狄艳红
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