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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 9 期
一株产耐热普鲁兰酶菌株 Anoxybacillus sp． LM14-2
分离鉴定及酶学性质研究
孙劭靖1，2 路福平1 姜楠2 李丽2 徐健勇2 曹慕琛1，2 宋诙2
(1天津科技大学生物工程学院 工业微生物教育部重点实验室，天津 300457;
2中科院天津生物技术研究所 基因工程与微生物应用技术实验室，天津 300308)
摘 要: 从云南轮马热泉下游淤泥中筛选得到了一株产耐热普鲁兰酶菌株 LM14-2。根据形态特征及 16S rRNA序列同
源性分析，初步判定为 Anoxybacillus sp． LM14-2。该菌株发酵上清液中有耐热普鲁兰酶积累，其反应最适 pH值为 6. 0，最适温
度为 70℃。利用染色体步移技术获得了完整的普鲁兰酶编码基因(HQ660582) ，经序列相似性进一步分析，确定该蛋白与 I型
普鲁兰酶保守区 b相吻合。通常的普鲁兰酶在高温下很快失活，难以满足淀粉加工，洗涤剂等相关工业的需求，而该新型的耐
热普鲁兰酶的作用温度广泛，热稳定性较好，65℃保温 55 h后达到其半衰期，具有广阔的开发应用前景。
关键词: 普鲁兰酶 筛选 16S rRNA 基因步移 Anoxybacillus sp．
Study of a Novel Thermostable Pullulanase Producing
Strain Anoxybacillus sp． LM14-2
Sun Shaojing1，2 Lu Fuping1 Jiang Nan2 Li Li2 Xu Jianyong2 Cao Muchen1，2 Song Hui2
(1Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of
Science ＆ Technology，Tianjin 300457;2Application of Genetic Engineering and Microbial Technology Laboratory，
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308)
Abstract: A novel strain LM14-2 producing thermostable pullulanase was recovered from Lunma hot spring of Yunnan Province of
China． According to colony morphology and 16S rRNA blasting，this strain was named Anoxybacillus sp． LM14-2． The thermostable pul-
lulanase with optimum pH6. 0 and optimum temperature 70℃ was accumulated in zymotic fluid of the Anoxybacillus sp． LM14-2． The
corresponding pullulanase gene(GenBank No． HQ660582)were obtained through gene walking． The structural domain of the pullulanase
dovetailed well with that of pullulanaseⅠaccording to the analysis of sequence similarities． The pullulanase previously discovered inacti-
vates under high temperature，which was difficult to satisfy with biotechnological applications such as sugar making，detergent，etc．
However，the thermostable pullulanase produced by the novel Anoxybacillus sp． LM14-2 which features wide temperature，excellent
thermal stability and a half-life as long as 55 h at 65℃，and performances widely industrial application prospect．
Key words: Pullulanase Isolation 16S rRNA Gene walking Anoxybacillus sp．
收稿日期:2011-02-22
基金项目:中国科学院知识创新工程重要方向项目(KSCXZ-YW-G-075-21)
作者简介:孙劭靖，女，硕士研究生，研究方向:微生物与分子生物学;E-mail:shaojing690@ 163． com
通讯作者:宋诙，研究员，研究方向:工业酶的应用;E-mail:hui． song@ live． com
普鲁兰酶能将淀粉中最小单位的支链分解，最
大限度利用原料，因此在淀粉深加工和啤酒酿造等
多种工业中广泛应用［1］。然而，淀粉水解及发酵的
工业过程常常发生在高温环境下(＞ 60℃)。不耐
热的普鲁兰酶不仅会降低淀粉在高温环境下降解的
效率，还会因为需要降低初处理淀粉的温度以适于
常温酶作用而浪费能量。筛选产生耐高温的普鲁兰
酶的菌株成为该领域的研究热点。
嗜热菌主要存在于极端环境，如火山口及其周
围环境区域、温泉、工厂高温废水排放区等，最适生
2011 年第 9 期 孙劭靖等:一株产耐热普鲁兰酶菌株 Anoxybacillus sp． LM14-2分离鉴定及酶学性质研究
长温度为 60 － 80℃。与普通普鲁兰酶产生菌株相
比，嗜热菌具有其独特的优势，如提高转化率、改善
底物溶解性、降低黏度和减少微生物污染等［2，3］。
近年来，已经在淀粉加工工业、废水处理、饲料加工、
造纸及采矿等各个领域表现出巨大的应用价值［4］。
淀粉水解及发酵的工业过程常常发生在高温环境下
(＞ 60℃) ，不耐热的普鲁兰酶不仅会降低淀粉在高
温环境下降解的效率，而且还会因为需要降低初处
理淀粉的温度便于常温酶作用而浪费能量。因此，
筛选耐高温的普鲁兰酶生产菌株就成为其应用的一
个关键。
本研究从云南轮马热泉下游淤泥中筛选获得一
株普鲁兰酶初始酶活力较高且酶热稳定性强的菌株
Anoxybacillus sp． LM14-2。对发酵液中普鲁兰酶生
物学性质等进行分析，并获得了完整的普鲁兰酶编
码基因，为我国自主研发高效耐高温的普鲁兰酶奠
定了良好的基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 样品来源 云南轮马热泉下游的淤泥，两个
采样 点 LM14 和 LM18。 LM14 经 纬 度 为 25°
25. 357N /98°16. 442E，温度 63℃，pH7. 66;LM18 经
纬度 2 5°25. 357N/9 8°16. 442E，温度 60℃，pH8. 03。
1． 1． 2 培养基筛选培养基［5］:0. 5%(W/V)蛋白
胨，0. 07%(W/V)硝酸钠，0. 01%(W/V)磷酸氢二
钠。0. 02%(W/V)硫酸镁，0. 01%(W/V)氯化钙，
0. 5%(W/V)糯米粉，2%(W/V)琼脂，121℃灭菌，
20 min。
产酶培养基:0. 5%(W/V)蛋白胨，0. 07%(W/
V)硝酸钠，0. 01%(W/V)磷酸氢二钠。0. 02%(W/
V)硫酸镁，0. 01%(W/V)氯化钙，0. 25%(W/V)普
鲁兰糖，2%(W/V)固体培养基加琼脂，121℃灭菌
20 min。
1． 2 方法
1． 2． 1 菌株富集与筛选 称取样品土壤 5 g，加入
50 mL 无菌水，220 r /min振荡培养 2 h;静止 30 min
后取上清液 10 mL接种到装有 90 mL 液体筛选培养
基中，于 50℃的恒温摇床中培养 2 d，取适当稀释度
的菌悬液于筛选培养基上涂布分离，50℃培养 24 h，
用 0. 1%稀碘液显色，将菌落周围有透明圈且与菌
落直径比较大的菌株挑至斜面上，对菌株进行纯化
分离。
1． 2． 2 菌种鉴定 对分离筛选到的产普鲁兰酶菌
株进行形态学和部分生理生化试验分析［12］，采用
16S rDNA的方法鉴定菌株，将获得的 16S rDNA 序
列在 NCBI GenBank数据库采用 blast 程序比对，用
MAGE 4. 0［7］软件构建系统发育树，分析菌株的系统
发育地位。
1． 2． 3 普鲁兰酶酶活的测定 参考 DNS 法［8］:将
发酵上清液为粗酶液，取粗酶液 250 μL，0. 5%的普
鲁兰糖溶液 250 μL，60℃保温 20 min;冷水降温，加
入 250 μL 的 DNS 溶液沸水浴煮 10 min;迅速冷却
后在 540 nm波长下测定溶液的吸光值。对照为在
加 DNS后，沸水浴前加入酶液。酶活单位定义:在相
应条件下，每分钟分解普鲁兰所释放的还原糖，其还
原力相当于 1 mmol 葡萄糖所需的酶量，以 1 U/mL
表示。
1． 2． 4 酶学性质的研究［9，10］ 底物特异性检测:配
制 0. 5%的可溶性淀粉、普鲁兰糖、支链淀粉、玉米
淀粉、马铃薯淀粉、糖原，加入适量的酶液，60℃反应
20 min。DNS法测还原糖的含量。
温度对普鲁兰酶活性的影响:根据 DNS 法在不
同温度下(45 － 90℃)进行酶促反应，然后测定酶的
活力，以酶活力最高者为 100%。
pH对普鲁兰酶活性的影响:采用 pH5. 0 － 8. 5
的磷酸氢二钠 －磷酸二氢钾缓冲液配制不同 pH 的
0. 5%的普鲁兰糖溶液，用 DNS 法测定酶活力，以酶
活力最高者为 100%。
普鲁兰酶热稳定性分析:将粗酶液在 65℃保
温，每隔 1 h 取出测其残余酶活力，以初始酶活力
为 100%。
1． 2． 5 Anoxybacillus sp． LM14-2 普鲁兰酶基因的获
得 从 NCBI GenBank数据库中获得的Ⅰ型普鲁兰
酶序列，利用 DNAMAN 的多序列比对程序，分析出
Ⅰ型普鲁兰酶的保守区，根据保守序列设计引物:
S:5-AGAAGCGGTGGATCCTTAT-3 /A:5-CAT-
TTCCAACTCCTGTTCC-3，扩增的 PCR 产物纯化后
送去测序。
根据已获得的保守区间序列，利用 Tail-PCR 技
术［11］以基因组 DNA作为模板，来扩增特异片段，直
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至获得完整的普鲁兰酶基因。特异性引物设计
如下。
保守区间序列上游特异性引物:S1:5-GCAT-
TTCATAAATGATCGCGTCTG-3;S2:5-TCTGTCAT-
AGAAATAAACGGAGGCA-3;S3:5-GGTTTCGGGGA-
TATTTGTTTTCGTC-3。
保守区间序列下游特异性引物:A1:5-GAT-
CATTGAGTTAAAACAGGCGATT-3;A2:5-AAGAAG-
GTATTCGCGTCATTTTAGAC-3;A3:5-AACATCTTTT-
GTTCCGGGCTATTATTC-3。
2 结果
2． 1 菌种的分离筛选
从采集到的土样中，通过平板分离初步筛选，得
到 12 株产普鲁兰酶的耐热菌，这 12 株菌再经摇瓶
培养及酶活测定比较，LM14-2 菌株的产酶活力高，
酶活力为 0. 4806 U /mL，选择该菌株作为进一步研
究的试验用菌。
2． 2 LM14-2 菌株的特性
对 LM14-2 菌株进行产酶种类分析，发现该菌
株不仅具有较高的普鲁兰酶活性，还具有蛋白酶和
α-淀粉酶活性。生长 pH 值范围为 5. 5 － 8. 0，生长
温度范围为 30 － 60℃。平板菌落呈圆形，边缘整
齐，乳白色，半透明。菌体呈杆状，大小为 0. 6 － 0. 8
μm × 1. 5 － 3 μm，革兰氏染色阳性，形成内生孢子，
芽孢圆形中生，接触酶反应阳性，V． P 试验结果阳
性，参考《伯杰士细菌鉴定手册》(第 8 版) ，初步判
定 LM14-2 为芽孢杆菌。
2． 3 LM14-2 菌株的 16S rRNA鉴定
16S进化树结果分析如图 1 所示，表明 LM14-2
与 Anoxybacillus 属的菌在同一个系统进化类群上，
相似性达到 97%以上，将其初步命名为 Anoxybacil-
lus sp． LM14-2。
图 1 产普鲁兰酶菌株的 16S rRNA的系统进化树
2． 4 菌株 LM14-2 产生耐热普鲁兰酶性质分析
2． 4． 1 底物特异性 DNS 法测定粗酶液与不同底
物反应后还原糖的含量，结果如图 2 所示。以普鲁
兰糖为底物时，反应后还原糖含量最高，是其他多糖
的 1 － 2 倍，从而确定 Anoxybacillus sp． LM14-2 产生
的普鲁兰酶的最佳底物为普鲁兰糖。
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2011 年第 9 期 孙劭靖等:一株产耐热普鲁兰酶菌株 Anoxybacillus sp． LM14-2分离鉴定及酶学性质研究
1．可溶性淀粉;2．支链淀粉;3．普鲁兰糖;4．玉米淀粉;
5．马铃薯淀粉;6．糖原
图 2 底物特异性检测
2． 4． 2 酶反应最适温度及 pH 的测定 pH 和温
度对普鲁兰酶活性的影响(图 3)研究表明，在以
普鲁兰糖为底物，pH6. 5 时粗酶液的最适反应温
度为 70℃，在 65 － 70℃范围内有较强的酶活力，
粗酶液的最适反应 pH 为 6. 0，在 pH5. 5 － 7. 0 的
范围内，酶活保持在 80%以上，当 pH大于 7. 0 时，
酶活力迅速下降。
2． 4． 3 酶的热稳定 普鲁兰粗酶液的热稳定性结
果如图 4 所示，粗酶液在 65℃保温 36 h 内，酶活保
持不变，36 h之后，酶活开始下降，保温 56 h 酶活下
降至 50%，而杰能科公司生产的普鲁兰酶在 65℃时
的半衰期为 55 h［13］，由此可见，Anoxybacillus sp．
LM14-2 普鲁兰酶的热稳定性好，具有较广阔的应用
潜能。
图 3 温度(a)和 pH(b)对 Anoxybacillus sp． LM14-2 产生普鲁兰酶的活性的影响
图 4 Anoxybacillus sp． LM14-2 产生普鲁
兰酶时热稳定性的测定
2． 5 菌株 LM14-2 普鲁兰酶编码基因的获得
从 NCBI 的 GenBank 中选择 Anoxybacillus 属、
Bacillus属、Geobacillus 属总共 6 株菌的普鲁兰酶基
因，进行同源序列的比对，选取Ⅰ型普鲁兰酶的两个
保守区 EAVDPYA 和 NGTGVGND，PCR 扩增得到
600 bp的基因序列。利用基因步移的技术以及两
轮 Tail-PCR 反应，得到Ⅰ型普鲁兰酶的完整的
ORF 区域。Anoxybacillus sp． LM14-2 pul 2 基因
(HQ660582)2 112 bp(图 5) ，注明为 pulA2，编码
704 个氨基酸。
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图 5 普鲁兰酶 DNA片段电泳图
3 讨论
在制糖工业和发酵工业上，淀粉是最常用的原
材料，然而自然界中的淀粉大多含有 80%支链淀
粉。支链淀粉由若干 α-1. 4 葡萄糖链通过 α-1. 6 糖
苷键结合而成的高度分支的多糖，它每隔 20 － 25 个
葡萄糖单位就有一个分支点，所以支链淀粉含有
4% －5%的 α-1. 6 糖苷键，为改善淀粉酶对淀粉的
作用效果，提高淀粉利用率，世界各国为了降低生产
成本，提高效益，纷纷投入大量的人力、财力研究开
发普鲁兰酶。近年来，普鲁兰酶的研究主要集中在
耐热、耐酸或耐碱性高产菌株的筛选及基因的克隆
与表达［15 － 18］。
本研究从轮马热泉土样中筛选获得耐热普鲁
兰酶高产嗜热菌 Anoxybacillus sp． LM14-2，发酵液
中普鲁兰酶活力为 0. 4806 U /mL。文献中 Anoxy-
bacillus属菌株常生活在嗜热环境中且种类繁多，
但仅有 Anoxybacillus flavithermus WK1［14］是唯一一
株经报道 Anoxybacillus 属中含有普鲁兰酶基因的
菌株，而对其酶学性质没有太多的研究。Anoxyba-
cillus sp． LM14-2 的普鲁兰酶与 Anoxybacillus fla-
vithermus WK1 氨基酸序列同源性为 88. 51%;基因
序列同源性为 71. 79%。因此，这篇文章是对 An-
oxybacillus属菌株产普鲁兰酶酶学性质的首次研
究，Anoxybacillus sp． LM14-2 不仅具有普鲁兰酶的
活性，还具有木聚糖酶活性［19］和淀粉酶活性。An-
oxybacillus sp． LM14-2 产生的普鲁兰酶反应的最适
温度为 70℃，最适 pH为 6. 0。该普鲁兰酶不但有
较高的热稳定性，还具有较广的 pH 范围，无论在
淀粉工业还是洗涤剂行业都具有一定的指导意义
与工业应用潜力。
然而，仅以分离筛选天然菌株的手段来获得耐
高温的普鲁兰酶是不够的，野生型菌株受到自身多
种因素的调控，产酶量往往难以达到很高的水平。
从目前普鲁兰酶的应用和研究现状来看，今后研究
和发展的方向主要有两个方向，其一是通过基因工
程手段构建基因工程菌［20，21］，进一步提高酶的产量
和活性，降低生产成本，真正实现该酶产业化;其二
是利用定点突变技术进一步提高最适 pH 值。本研
究获得的耐热耐酸普鲁兰酶高产菌株及其基因具有
一定的可塑性，能够更好地满足工业化生产的多项
要求。
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