全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第2期
收稿日期:2007-09-03
基金项目:国家科技基础条件平台建设项目(2005DKA21205-4)
作者简介:张建哲(1981-),男,山东滨州人,动物学专业硕士研究生
通讯作者:黄兵,男,研究员,Tel:021-54113251,E-mail:huangbing232@163.com
鸡球虫病是由艾美耳球虫所引起的一种危害极其严重的全球性寄生虫病,严重危害家禽的生长发育,
全世界每年因球虫病造成的经济损失约为 20亿美元[1]。目前,控制鸡球虫病仍然以药物为主,但由于耐药
虫株的普遍产生以及化学药物的残留等问题,使得抗球虫药的研制受到极大限制,因此,人们期望用更好
的手段来取代,免疫预防成为控制球虫病的理想方法。利用鸡球虫疫苗防治鸡球虫病不仅能彻底解决鸡球
虫的耐药性问题,而且对于生产绿色食品、提高肉蛋质量提供了保障。
目前应用的球虫活疫苗,对鸡有一定的潜在致病力,使用受到一定的限制。自上世纪 80年代末开始,
采用遗传工程技术获得重组疫苗逐渐受到人们的青睐。研究重组疫苗必须筛选出具有保护性的抗原基因,
而构建 cDNA文库是获得目的基因并进一步进行基因重组与基因克隆的重要方法。国内外已成功构建了
巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库的构建
张建哲 1,2 韩红玉 2 姜连连 2 董辉 2 赵其平 2 卞庆松 2 闫晓菲 2,3 黄兵 2
(1上海师范大学生命与环境科学学院,上海 200234;2中国农业科学院上海兽医研究所 /农业部动物寄生虫学重点开放实验室,上海
200232;3新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐 830052)
摘 要: 为构建巨型艾美耳球虫(Eimeriamaxima)孢子化卵囊 cDNA表达文库,从 E.maxima孢子化卵囊中提取
总RNA,以总RNA为模板、λTriplex2TM为载体,利用SMARTTM cDNA文库构建试剂盒构建全长cDNA表达文库。经
测定构建的E.maximacDNA表达文库的原始文库容量为1×106pfu/ml,扩增后的文库滴度为5×1010pfu/ml,重组率为
95%,插入片断主要集中在0.5～1kb之间。根据已知序列设计引物,能从文库中扩增出编码E.maxima免疫球蛋白重链结
合蛋白的基因序列片段。结果表明所构建的E.maximacDNA表达文库质量良好,为克隆、筛选E.maxima的功能性基因
奠定了基础。
关键词: 球虫 巨型艾美耳球虫 cDNA文库 SMART技术
ConstructionofthecDNALibraryofSporulatedOocysts
ofE.maxima
ZhangJianzhe1,2 HanHongyu2 JiangLianlian2 DongHui2 ZhaoQipin2
BianQingsong2 YanXiaofei2,3 HuangBing2
(1LifeandEnvironmentScienceColege,ShanghaiNormalUniversity,Shanghai200234;2ShanghaiVeterinaryResearch
Institute,CAAS/KeyLaboratoryforAnimalParasitologyofMinistryofAgriculture,Shanghai200232;3ColegeofAnimal
Medicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumchi830052)
Abstract: Toconstructaful-lengthcDNAlibraryofsporulatedoocystsofEimeriamaxima,withthetotalRNA
isolatedfrom thesporulatedoocystsofE.maximaastemplateandλTriplex2TM asvector,aful-lengthcDNAlibrarywas
constructedfolowingtheproceduresprovidedbytheSMARTTM cDNAlibraryconstructionkit.Thetiterofunamplified
libraryis1×106 pfu/mlandthetiterofamplifiedlibraryis5×1010 pfu/ml.Thepercentageofrecombinantclonesis
95%.E.maximageneforimmunoglobulinheavychainbindingproteincanbeamplifiedfrom theconstructedlibrary.
Thislibraryhashighqualityandcanbequalifiedfornewgeneselected.
Keywords: Coccidia E.maxima cDNAlibrary SMARTtechnique
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
多种球虫的 cDNA文库[2~4],巨型艾美耳球虫(Eimeriamaxima)是集约化养鸡场常见球虫之一,其免疫原性
在艾美耳球虫中最强,构建该种球虫的 cDNA文库,对于寻找球虫的抗原活性分子和研究其基因工程疫苗
具有重要作用。
1 材料与方法
1.1 虫株及试剂
E.maxima,为单卵囊分离株,由中国农业科学院上海兽医研究所第二研究室保存提供,编号为 CAAS
2111130303。RNA提取试剂盒 (TRIZOL试剂盒,Invitrogen公司产品);SMARTTM cDNAConstructionkit
(CLONTECH公司);包装蛋白(GigapackIIGoldpackagingExtract,Strategene公司产品)。
1.2 孢子化卵囊
用 14d龄无球虫 ISA公鸡(购自上海市郊某大型鸡场)口服感染 E.maxima孢子化卵囊,感染量为 4.4×
103个/羽。感染 8d后,分别从粪便和肠道中收取卵囊,用 2.5%重铬酸钾培养至孢子化率达到 90%以上,收
集纯化的孢子化卵囊迅速冻存于液氮中,以备提取总 RNA。
1.3 总 RNA提取
用 TRIZOL试剂盒提取孢子化卵囊总 RNA,操作过程按试剂盒说明书进行。琼脂糖凝胶电泳检测总
RNA的完整性,紫外分光光度计测定总 RNA的纯度和浓度。
1.4 cDNA文库的构建
严格按照 SMARTTMcDNAConstructionkit说明书进行,主要操作步骤如下。
1.4.1 cDNA第一条链的合成 取 3μl总 RNA加入 1μlCDSII3,引物和 1μlSMARTIVTMOligonuleotide引
物,72℃水浴 2min,加入 5×First-StrandBufer,DTT,dNTPMix,PowerScript反转录酶,在 42℃水浴条件下反
应 1h,进行 cDNA第一条链的合成。
1.4.2 LD-PCR扩增体系及循环参数 反应在 100μl体系中进行。 cDNA第一链模板 2μl,10×Advantage2
PCRbufer10μl,50×dNTPMix2μl,5,PCRprimer2μl,CDSII3,primer2μl,50×Advantage2polymeraseMix
2μl,灭菌去离子水 80μl。PCR循环参数为 95℃预变性 1min,95℃15s,65℃6min,18个循环。取 5μlPCR产
物进行 1%琼脂糖凝胶电泳,鉴定片段大小,经 CHROMASPIN-400柱纯化后回收 400bp以上的 cDNA片
段。
1.4.3 双链 cDNA与载体的连接及包装 在 5μl连接体系中加入 1.5μl经过 CHROMASPIN-400柱纯化的
cDNA和 1μlλTriplex2TM载体,16℃连接过夜。取 4μl连接产物,用 GigapackII包装蛋白水浴条件下 22℃包
装 2h。
1.5 文库质量评价
1.5.1 原始文库容量与扩增文库滴度的测定 取 1μl原始文库,用 1×lambdadilutionbufer分别以 10×,
100×,1000×进行稀释,测定原始文库的容量。按每个 150mm平板 1×106个独立克隆扩增原始文库。单独收
集每个平板的裂解物(溶解于 1×lambdadilutionbufer),加入 10ml氯仿,混匀后 7000r/min离心 10min,取
上清为扩增文库。取 1μl扩增后文库,用 1×lambdadilutionbufer分别以 100×,10000×,1000000×进行稀
释,测定原始文库的滴度。加入 7%的 DMSO,分装保存于-70℃。
1.5.2 文库插入片段大小及重组率测定 随机挑取扩增后文库的 50个重组噬菌斑,加入 50μl1×lambda
dilutionbufer和 2μl氯仿,振荡洗脱,于 4℃冰箱中过夜,取 5μl洗脱物进行 PCR检测。PCR检测的引物为
上游引物:5′-TCCGAGATCTGGACGAGC-3′,下游引物:5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′。PCR反应体系为
20μl体系:ddH2O10.5μl,10×taqbufer2μl,10mmol/LdNTP0.5μl,5′primer0.5μl,3′primer0.5μl,cDNA模
板 5μl,Taqenzyme1μl。PCR循环参数:94℃预变性 5min,94℃30s,55℃30s,72℃2min,35个循环,72℃延
伸 10min。完成后,取 PCR产物 5μl1%琼脂糖凝胶电泳鉴定插入片段的大小和计算文库的重组率。
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1.5.3文库检测 根据 Genebank上获得的编码 E. maxima免疫球蛋白重链结合蛋白的基因序列 (登录号
为:Z66491),设计特异性引物 J1和 J2,预计扩增片段为 600bp。J1:5′-CTACGATCTTGGTGGTGGTACCT-3′,
J2:5′-CTCGCTCTTTCCTGTTCCTT-3′。PCR反应体系与循环参数同 1.5.2。PCR完成后,取产物 5μl 1%琼脂
糖凝胶电泳分析。
2 结果
2.1孢子化卵囊总 RNA提取
取液氮冻存的 E. maxima孢子化卵囊提取总 RNA,经紫外分光光度计检测 OD260/OD280为 1.9,表明 E.
maxima孢子化卵囊总 RNA纯度较高。经琼脂
糖凝胶电泳,显示 28S和 18S条带清晰(图 1),
说明提取的总 RNA质量好,可用于 cDNA文
库的构建。
2.2 LD-PCR扩增后的双链 cDNA
LD-PCR结束后,取 PCR产物在 1%琼脂
糖凝胶上进行电泳,结果显示获得的 cDNA片
段大小分布合适(图 2),主要集中在 0.1～4kb
之间,可用于后续实验。
2.3原始文库容量与扩增文库滴度测定
经计算所构建的 E. maxima孢子化卵囊
cDNA文库的容量为 1×106pfu/ml,扩增后的文库滴度为 5×1010pfu/ml,文库重组率为 95%,插入片段集中
在 0.5～1kb之间(图 3)。
2.4文库检测
根据设计引物进行 PCR扩增,获得的基因片段约为 600 bp,与预期大小一致(图 4)。
图 1 总 RNA电泳分析
图 2 双链 cDNA电泳分析
M:DL 2000 DNA Marker 1:双链 cDNA
图 3 文库中随机挑选的克隆 cDNA插入片段的 PCR产物电泳结果
M:DL 2000 DNA Marker 1～8:插入片段的 PCR产物
图 4 文库中扩增片断电泳结果
M:DL 2000 DNA Marker 1~2:扩增出的片段
3 讨论
从 20世纪 70年代开始,由于限制性内切酶的发现以及质粒等载体的应用,推动了 DNA体外重组的进
展。Hofstetter(1976)[5]用杂交质粒成功构建了第一个 cDNA文库,开启了文库构建的先河,为克隆、筛选生物
的功能性基因提供了条件。
球虫是危害养禽业的重要寄生虫,为探索球虫的入侵机制与防治球虫病的新方法,国内外相继构建了
相关球虫的 cDNA文库。Jenkin等(1989)[2]构建了堆型艾美耳球虫(E. acervulina)孢子化卵囊 cDNA文库,
Herbert等(1992)[3]构建了柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)未孢子化卵囊 cDNA文库,韩红玉等(2001)[4]构建了
E. tenella孢子化卵囊的 ZAP表达性文库,蒋建林等(2002)[6]构建了 E. tenella cDNA文库,李建华等(2005)[7]
张建哲等:巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库的构建 197
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其具有特异性免疫学反应性,但须进一步建立临床检测诊断禽流感感染禽和免疫禽的诊断方法,以期达到
实际应用效果。
参考 文献
1 EricaWeir.CMAJ(Canada,sleadingsmedicaljournal),2005,173(8):869.
2 卡尔尼克等著,高福,等译.禽病学(第 10版).北京:中国农业出版社,1999,742～771.
3 TerenceMTumpey,ReneAlvarez,DavidESwayne,etal.JClinMicrobiol,2005,43(2):676～683.
4 SambrookJ,FritschF,ManiatisT.ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989,888～897.
5 Garcia-SastreA,EgorovA,MatassovD,etal.Virology,1998,252:324～330.
6 郭广君,吕素芳,王荣富.科学技术与工程,2006,6(5):582～587.
7 张玲,洪岸,陈小佳,等.中国公共卫生,2004,20(3):367～369.
8 AilorE,BetenbaughMJ.CurOpinBiotechnol,1999,10(2):142～145.
9 DaiX,HajosJP,JoostenNN,etal.JGenVirol,2000,81(10):2545~2554.
10 SandovalC,CurtisH,CongoteLF.ProteinEng,2002,15(5):413~418.
构建了 E.tenela杂交虫株 F2的 cDNA表达文库。并且利用构建的文库用抗体或核酸探针进行了新基因的
筛选工作,获得了一些虫体表面抗原基因及阶段性虫体抗原基因。Brothers等(1988)[8]利用 E.tenelaTA4
基因片段克隆出了该基因的全长 cDNA,Binger等 (1993)[9]用兔抗 E.tenela裂殖子表面抗原的抗体从
cDNA文库中筛选出了一个片段(KMZ527),为从构建的 cDNA文库中筛选功能基因奠定了基础,也为构建
完文库后进行后续的工作提供了思路和方法。
SMART技术是构建 cDNA表达文库的常用方法[10],所建文库可用于全长基因的筛选,该方法构建文库
的特点是:1)起始材料少,只要 1μg总 RNA就可满足建库要求,这对于获取生物材料较难的文库构建尤其
适用;2)所建文库具有全长性,应用 5′末端转换机制,在新生的 cDNA第一链末端加寡聚 C,再用含寡聚 G
的 5′引物及 3′端 CDS引物扩增出全长基因,可从全长文库中筛选感兴趣的目的基因,而不必再花时间扩
增全长。应用 SMART方法成功构建 E.maxima孢子化卵囊 cDNA表达文库,经检测文库质量良好,达到所
构建文库的容量应不小于 1.7×105pfu/ml、插入片段的大小应在 500bp以上的要求[11,12],为筛选抗原基因和
功能性基因奠定了基础。
参考 文献
1 BhogalBS,MilerGA,AndersonAC,etal.ImmunologyandImmunopathology,1992,31:323~325.
2 JenkinsCD,AnforthHD,LilehojHS,etal.MolecularandBiochemicalParasitology,1989,32:153~162.
3 HerbertRG,PasternakJJ,FernandoMA.TheJournalofParasitology,1992,78(6):1011~1018.
4 韩红玉,黄兵,赵其平.生物工程学报,2001,17(6):669~672.
5 HofsteterH,SchambockA,VanDenBergJ,etal.BiochimicaetBiophysicaActa,1976,454:587~591.
6 蒋建林,蒋金书.动物医学进展,2002,23(5):64~65.
7 李建华,张西臣,陈丽凤.寄生虫与医学昆虫学报,2005,(3):143~145.
8 BrothersV,KuhnI,PauletalS.MolecularandBiochemicalParasitology,1988,28(3):235~247.
9 BingerM,HugD,WeberG,etal.MolecularandBiochemicalParasitology,1993,61(2):179~187.
10 许若丹,钟理,李继刚,等.河北农业大学学报,2006,29(3):79~82.
11 SambrookJ,RusselDW.Molecularcloning:alaboratorymanual.NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,2002,880~888.
12 ZhuYY,MachlederEM,ChenchikA,etal.BioTechniques,2001,30:892~897.
198