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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 8 期
茶树 CsCOR1 基因的原核表达
李先文1 刘慧娟1 余海波2 袁红雨1
(1信阳师范学院生命科学学院，信阳 464000;2信阳市中心医院，信阳 464000)
摘 要: 将来自茶树的冷诱导基因 CsCOR1 与 pGEX-6p-1 质粒上的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合，构建为融合表达载
体，最终实现了在 0． 8 mmol /L IPTG诱导下的原核表达，获得了 36 kD的可溶性融合蛋白，为对 CsCOR1 基因功能的进一步研
究奠定基础。
关键词: 茶树 融合基因 原核表达
Prokaryotic Expression of CsCOR1 Gene from Camellia sinensis
Li Xianwen1 Liu Huijuan1 Yu Haibo2 Yuan Hongyu1
(1College of Life Science，Xinyang Normal University，Xinyang 464000;2The Central Hospital of Xinyang City，Xinyang 464000)
Abstract: In this paper，CsCOR1 gene as a cold-induced gene from Camellia sinensis，was fused behind the GST gene in pGEX-
6p-1，forming a fusion expression vector． Finally，GST-CsCOR1 was induced by 0． 8 mmol /L IPTG and a 36 kD fusion protein was syn-
thesized． The present study could provide the fundament for the further functional characterization of CsCOR1．
Key words: Camellia sinensis Fusion gene Prokaryotic expression
收稿日期:2011-01-27
基金项目:河南省重点科技攻关项目(082102150009) ，信阳师范学院博士启动基金
作者简介:李先文，男，博士，副教授，研究方向:植物分子生物学;E-mail:xianwenli01@ sina． com
低温是许多植物生命周期中要应对的主要的环
境胁迫之一，而许多温带植物在经历了一段时间的
非伤害低温后会增强其抗冻性，此即植物的冷驯化
现象［1］。植物的冷驯化过程涉及到许多细胞和生
理生化过程，包括提高细胞膜结构的稳定性，增强细
胞抗氧化机能，合成和积累抗冻保护性溶质等［2］。
近年来，有关植物冷驯化的研究主要聚焦在冷诱导
基因的克隆及其作用机制方面，在被子植物中，现已
分离到数百个冷调节基因，并对它们的表达调节方
式和生理功能进行了一定程度的探索［3］。这些冷
调节基因的编码蛋白按其功能可分为转录因子、分
子伴侣、抗冻蛋白和多种参与初级和次级代谢的酶
类等［4，5］。
本研究组已从茶叶的冷诱导 cDNA文库中克隆
了一个新的细胞壁蛋白基因———CsCOR1，与其类似
的基因以前多发现于禾本科植物的水稻和大麦中。
这类蛋白的特点是分子量较小，甘氨酸和脯氨酸含
量较高，且分子中往往存在重复序列。在预测的
CsCOR1 蛋白分子中，有两个 13 肽段重复，其中的 8
肽片段发现于多种不同蛋白中，但对这种 8 肽片段
的作用未见任何报道。我们的研究表明，CsCOR1
基因可赋予转基因烟草以明显的抗盐和抗脱水作
用［6］。本研究中构建了 CsCOR1 基因的原核表达载
体，并对其进行原核表达以及表达产物的分离分析，
以便深入研究该基因编码蛋白的结构、性质及其发
挥作用的机制。
1 材料与方法
1. 1 材料
茶叶的冷诱导 cDNA 文库为本实验室所构
建［7］。菌株 DH5α、BL21(DE3)、载体 pGEX-6p-1 为
本实验室保存。BamH I和 EcoR I 内切酶、连接酶、
Taq DNA 聚合酶和 DNA 片段回收试剂盒等为
TaKaRa(大连)有限公司产品。
1. 2 方法
1. 2. 1 融合蛋白表达载体的构建 依据 CsCOR1
基因(GenBank No． EU563236)的 ORF 序列设计引
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 8 期
物(上游引入 BamH I 限制性位点;下游引物引入了
EcoR I限制性位点。引物序列为:5-GGGGATCCAT-
GTTGAGCAAAGCCTCTTC-3;5-GGGAATTCGTCCA-
CATTCAATGCCTCTA-3) ，用茶叶的冷诱导 cDNA 文
库为模板，采用高保真 Taq DNA聚合酶进行 PCR扩
增，经凝胶回收获得目的基因片段。将所获得的
CsCOR1 基因的 PCR产物用 BamH I和 EcoR I 双酶
切后，插入 pGEX-6p-1中，获得表达载体 pGEX-6p-1 /
CsCOR1。随后，将所构建的载体转入 BL21(DE3)感
受态细胞中。
1. 2. 2 融合基因的诱导表达 挑取携带有 pGEX-
6p-1 /CsCOR1 表达载体的 BL21(DE3)单菌落培养
于 3 mL LB 培养基(含 Kan 25 μg /mL)中，37℃，
220 r /min 振荡培养过夜。用含 pGEX-6p-1 质粒的
BL21(DE3)菌株作为对照。
按 1%(V /V)接种量转接于 20 mL LB培养基中
(含 Kan 25 μg /mL) ，振荡培养至 OD600达 0． 6 左右，
加 IPTG 至终浓度为 0． 8 mmol /L，37℃，220 r /min
下培养。并于加 IPTG 后的 0、1、2、3、4 和 5 h，分别
从转化组和对照组的培养液中取 1 mL 菌液，
12 000 r /min 离心 1 min，收集沉淀，加 100 μL 1%
SDS凝胶加样缓冲液(40 mmol /L Tris-HCl，pH6． 8，
10%甘油，2% SDS，5%巯基乙醇，0． 1%溴酚蓝) ，剧
烈振荡悬浮，混匀后，98℃加热 5 min。冷却至室温
后，12 000 r /min离心 1 min，取上清作为样品，用于
SDS-PAGE分析。
1. 2. 3 表达蛋白的电泳分离 蛋白质分离采用垂
直板电泳系统，试验操作依据梁宋平方案［8］，分离
胶 10%，浓缩胶 4%;浓缩胶电压 50 V，分离胶电压
80 V。电泳结束后经考马斯亮兰染色，再脱色和
拍照。
1. 2. 4 表达蛋白的可溶性分析 将加 IPTG诱导的
按照 1. 2. 2 方法培养 4 h后的含重组质粒的菌体离
心收集，用适当体积的 PBS 重悬，冰浴下超声破菌
(10 s × 5 次)。于 4℃、12 000 r /min 离心 15 min
后，分别收集上清和沉淀。沉淀可再用适量 PBS 重
悬。取 10 "L上清及沉淀重悬液分别与等体积的凝
胶加样缓冲液混合，98℃加热 5 min 后，进行 SDS-
PAGE。比较携带空载体与重组体质粒载体的菌株
被诱导表达的结果，分析融合蛋白在表达菌细胞中
的存在形式。
2 结果
2. 1 目的基因片段克隆结果
以先前构建的 cDNA 文库为模板，利用 Cs-
COR1-ORF序列设计的引物进行 PCR 扩增，将所得
产物进行琼脂糖凝胶电泳，成像时，在约 270 bp 的
位置有一明显条带，与预期的基因片段大小一致
(图 1)。经切胶回收目的 DNA 片段用于表达载
体的构建。
M． Marker;1． CsCOR1 ORF PCR产物
图 1 CsCOR1 基因 ORF序列 PCR扩增结果
2. 2 融合表达载体 pGST-CsCOR1 的构建与鉴定
采用 pGEX-6P-1 为融合蛋白表达载体，利用其
多克隆位点及 CsCOR1 基因 PCR 产物序列中引入
的 BamH I和 EcoR I 酶切位点，将两者双酶切并纯
化后，定向连接成重组质粒 pGEX-6p-1 /CsCOR1(或
记作 pGST-CsCOR1) ，再转入大肠杆菌 BL21(DE3)
中，挑出阳性克隆进行测序。经测序证明 CsCOR1
接在 GST 基因之后，并与 GST 基因共用同一读
码框。
2. 3 融合蛋白在原核细胞中的诱导表达
携带非重组质粒 pGEX-6p-1 的 BL21(DE3)菌
株中经 IPTG 诱导后，SDS-PAGE 电泳分析表明，在
Mr 26 kD 处出现一阳性反应条带。而含重组质粒
pGST-CsCOR1 的 BL21(DE3)经 IPTG 诱导表达后，
在 26 kD位置无诱导带出现，而出现一新的诱导蛋
白条带，大小与推定的融合蛋白 Mr 36 kD 基本相
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2011 年第 8 期 李先文等:茶树 CsCOR1 基因的原核表达
符，表明融合基因在此系统中得到了表达(图 2)。
图上方的数字表示加 IPTG 后的取样时间，M 为蛋白质
分子量 Marker(低)
图 2 GST-CsCOR1 融合基因诱导表达的产物电泳图谱
2. 4 目的蛋白表达形式的分析
将含重组质粒的菌体培养液离心、超声破菌后，
将上清组和沉淀组样品进行 10% SDS-PAGE 电泳
检测，显示 BL21(DE3)细胞中 pGST-CsCOR1 的表
达产物主要在上清液中(图 3) ，说明融合蛋白主要
以可溶性形式存在。
M．蛋白分子量 Marker;1．破碎细胞上清液;
2．沉淀重悬液
图 3 目的蛋白存在形式的电泳分析结果
3 讨论
茶叶中多种含量丰富的次生代谢物都是重要的
药用和保健成分，使其成为最受欢迎的饮品。茶叶
也是生产天然咖啡因、儿茶素和茶氨酸等药物的最
佳原料。随着研究的深入，人们发现茶叶在抗氧化、
抗辐射、抗衰老、防癌、保护神经细胞、提高记忆力、
预防和治疗糖尿病及心血管疾病、增强免疫功能、改
善经期综合症和减肥等多方面都有良好的功效［9］。
因此，茶叶已成为开发价值最高的植物材料之一。
许多国家(包括中国在内)都将茶树作为一种重要
的木本经济作物。有些研究机构甚至在尝试进行茶
叶细胞的悬浮培养或将茶树基因转移到工程菌中表
达，用以生产所需的茶树次生代谢物来满足日益增
大的市场需求。然而，茶树的很多次生代谢物合成
途径中的酶和一些胁迫诱导蛋白基因在工程菌中往
往不能有效的表达，原因是有的抑制菌体的生长，有
的可能属遗传密码偏好。刘敬卫等［10］研究茶叶多
酚氧化酶的原核表达时发现，转移肽的存在可能对
其在细菌细胞中的翻译表达有抑制作用，随后通过
去掉转运肽后而实现其原核表达，但表达出来的蛋
白是以包涵体形式存在的。本试验是在利用 pET-
28a载体多次表达 CsCOR1 基因无果的情况下，改
用 pGEX-6P-1 载体进行尝试，才成功实现其原核表
达，并且得到了以可溶性形式存在的蛋白，为随后的
进一步研究奠定了基础。pGEX-6P-1 是一种融合蛋
白表达载体，由于它表达的融合蛋白 N 端带有
GST，既有助于表达蛋白正确立体构象的形成，也有
助于随后用 GST Pull-down法分离和纯化目的蛋白。
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