全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第4期
收稿日期:2008-01-17
基金项目:重庆市自然基金(CSTC,2007BB5080),军队医药卫生科研基金课题(06G073)
作者简介:鲁卫平(1971-),男,博士在读,主要从事病原微生物检验诊断方面的研究
通讯作者:涂植光,教授,博导
近年来,致病性真菌引起的院内感染呈逐年上升趋势,特别是大量使用免疫抑制剂的患者、肿瘤患者、
烧伤患者以及 AIDS患者极易感染,另外,大量使用广谱抗菌药物以及留置导管的使用也大大增加了感染
的机会。目前侵袭性真菌感染已经成为免疫受损宿主致病率和死亡率增高的主要原因[1,2]。因此,建立一种
能快速、敏感、准确地检测与鉴定真菌,尽早确定是否真菌感染的方法显得十分重要。
目前临床诊断真菌病主要依靠常规直接镜检、培养和形态学以及生化鉴定方法,这些方法不同程度存
在操作繁琐、费时费力、阳性率很低等缺点。近年来分子生物学技术在真菌学研究中得到了广泛而深入地
应用。真菌核酸序列研究主要集中在 rRNA基因上,因为 rDNA存在着广泛的保守区域,可以用作引物的结
合位点,同时客观存在的不同区域进化水平不同,可以用于不同分类等级的研究[3]。因此,以 5.8SrRNA基
因和 28SrRNA基因的保守序列设计真菌通用引物,以位于 5.8S和 28SrDNA之间的内转录间隔区
通用PCR反向斑点杂交快速检测及鉴定致病性酵母菌
鲁卫平 1,2 涂植光 1
(1重庆医科大学检验医学系,重庆 400016;2第三军医大学大坪医院野战外科研究所分子生物学中心,重庆 400042)
摘 要: 建立PCR结合寡核苷酸探针反向斑点杂交技术,快速检测及鉴定致病性酵母菌。将待检酵母菌种特异性
寡核苷酸探针固定在尼龙膜上,然后用生物素标记的真菌通用引物扩增的各真菌 DNA片段,与固定在膜上的探针杂交。
结果表明所用的真菌通用引物可扩增临床常见的真菌DNA,9种特异性探针具有高度的特异性。该方法检测35例临床
分离菌株,结果与常规鉴定方法一致。该技术检测时间短、操作简单、不需要特殊设备,能部分满足临床检测的通量要求,
具有很好的临床应用前景。
关键词: 聚合酶链反应 反向斑点杂交 酵母菌 真菌
RapidDetectionandIdentificationofPathogenicYeastby
UniversalPCRCombinedReverseBlotHybridization
LuWeiping1,2 TuZhiguang1
(1FacultyofLaboratoryMedicine,ChongqingUniversityofMedicalSciences,Chongqing400016;2MolecularBiologyCenter
ofDapingHospitalofThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042)
Abstract: To develop auniversalPCR-reverseblothybridization asay,which aimeto detectand identify
pathogenicyeastrapidlyandexactly.Thespecies-specificoligonucleotideprobesoftargetpathogenicyeastwerefixedon
nylonmembrane.ThepathogenicyeastDNAgenefragmentswereamplifiedbyPCR withonepairofprimerslabeled
withbiotin,andtheamplifierswerehybridizedwithprobesonmembrane.UniversalprimerscanamplifytherRNAgene
from commonpathogenicfungi.Eachspecies-specificprobeonlyhybridizeswithitstargetmolecule,anditshowedthat
theseprobeswerehighspecific.Themethodwasusedtotest35cultureisolates.Theresultswereconsistentwiththose
oftraditionalmicrobiologicalcultureandbiochemicaltechniques.Thismethodisasimple,fast,sensitiveandspecific
technologythatmeetfluxdemandofclinicaldetectionandhasgoodprospectofclinicalapplication.
Keywords: Polymerasechainreaction Reverseblothybridization YeastMedicalfungi
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
(internaltranscribedspace2,ITS2)序列设计种特异性探针,利用 PCR结合反向斑点杂交技术,可快速准确
地检测和鉴定 9种临床常见致病性酵母菌。
1 材料与方法
1.1 菌株
1.1.1 用于实验的标准真菌菌株 白色念珠菌ATCC90028,季也蒙念珠菌 ATCC6260,葡萄牙念珠菌 ATCC
34449,由第三军医大学大坪医院检验科细菌室提供。热带念珠菌(C2a),光滑念珠菌(Y10),近平滑念珠菌
(C4a),克柔念珠菌(C6a),乳酒念珠菌,新型隐球菌(D2b),购自于中国医学微生物保藏管理中心(CMCC)。
1.1.2 用于阴性对照的标准菌株 金黄色葡萄球菌 ATCC25923,大肠埃希菌 ATCC25923,铜绿假单胞菌
ATCC25923,由第三军医大学大坪医院检验科细菌室提供。
1.1.3 临床分离菌株 30株临床分离酵母菌菌株包括 10株白色念珠菌、6株热带念珠菌、5株光滑念珠
菌,3株近平滑念珠菌,3株新型隐球菌、1株克柔念珠菌、1株季也蒙念珠菌和 1株葡萄牙念珠菌。4株曲
霉菌,1株毛霉菌。40株临床分离细菌菌株包括大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯氏
菌、鲍曼不动杆菌、伤寒沙门氏菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎双球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、甲型链
球菌、乙型链球菌、肺炎双球菌和肠球菌等,均由第三军医大学大坪医院检验科细菌室提供。
1.2 主要试剂和仪器
ExTaqDNA多聚酶:大连宝生物;辣根过氧化物酶-链霉亲和素(HRP-SA):PIERCE;四甲基联苯胺
(TMB):Sigma;尼龙膜:Roche;扩增仪:eppendorf;杂交炉:RobbinsScientic。Vitek2全自动微生物鉴定仪:
biomerieux。
1.3 寡核苷酸引物和探针
本实验中的引物及探针均自行设计,由大连宝生物公司合成。上游引物选择待检真菌 5.8SrRNA基因
的保守序列,并在 5端生物素修饰;下游引
物选择待检真菌 28SrRNA基因的保守序列。
以位于 5.8S和 28SrDNA之间的内转录间隔
区 ITS2序列设计种特异性探针,为减少空间
位阻,使杂交更易进行,探针合成时 5端连
上长度为 15的 poly(dT)作为间隔臂[4]。
1.4 杂交膜的制备
将加尾的寡核苷酸探针配制成 20μmol/
L的点样液,点于尼龙膜相应的位点,每点
0.5μl。将膜放入紫外铰链仪进行交链,然后
80℃真空干烤 1h。此时的膜可直接用于杂
交,也可以用滤纸包好存于塑料袋或干燥缸
内。
1.5 DNA提取方法
细菌:Chelex-100裂解法[5];真菌:氯化苄提取法[6]。
1.6 PCR扩增反应
反应体系总体积为 50μl,优化后反应条件为 95℃5min→(95℃30sec→52℃30sec→72℃1min)×35个
循环→72℃10min。取 10μl进行 1.5%琼脂糖凝胶电泳。
1.7 杂交反应
将制备好的含 9种探针的杂交膜放入杂交管中,加入预杂交液 (6×SSC,0.01mol/LEDTA,5×Denhardt
表 1 PCR通用引物和寡核苷酸探针
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2008年第4期
液,100μg/ml鲑鱼精 DNA),42℃预杂交 30min。将 20μl已变性的生物素标记 PCR产物加到杂交管中,50℃
杂交 2h。然后用 2×SSC+0.1%SDS的漂洗液于室温漂洗 5min,2×SSC+0.1%SDS室温下洗涤 5min,0.1×SSC+
0.1%×SDS于 50℃漂洗 10min,最后室温下用 0.1×SSC稍稍漂洗,取出膜用滤纸吸去多余水分。
1.8 显色反应
将 1ml稀释好的 SP溶液加到杂交管中,室温振摇 30min;取出膜用 0.1×SSC漂洗 2min;ddH2O漂洗
2min;将膜浸入 2mlTMB显色液(用柠檬酸盐缓冲液稀释 TMB至 0.1mg/ml,与 0.05%H2O2等量混合)中,室
温下避光保持 15min;杂交斑点呈深蓝色,本底未显色时,ddH2O轻轻漂洗 2min终止反应,滤纸上吸干水分。
2 结果
2.1 PCR反应
对 9种临床常见酵母菌,包括白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、葡萄
牙念珠菌、季也蒙念珠菌、乳酒念珠菌和新型
隐球菌。用真菌特异引物 PCR扩增,均扩增出
1条 DNA带,扩增片段大小在 259～436bp之
间,用该引物对临床常见的 14种细菌扩增结
果均为阴性。
2.2 特异性试验结果
用 9种酵母菌标准菌株扩增产物分别与
膜杂交,所选用的探针均能检测出相应的靶序
列,每张膜上只有与靶序列对应的探针点有显影结果,其他探针点均无显影,背景清晰,结果可靠。9种真
菌的 PCR产物与膜 9杂交,在特异性探针位点上均出现杂交斑点,表明此方法可检测几种菌的混合感染。
2.3 敏感性试验结果
用不同量的白色念珠菌 DNA为模板进行扩增,扩增产物分别用反向斑点杂交和琼脂糖凝胶电泳法检
测,结果斑点杂交法敏感性为 100fg,是琼脂糖凝胶电泳法检测灵敏度的 10倍。
2.4 临床分离菌株检测
该方法对 30例临床分离酵母菌菌株鉴定结果与 Vitek鉴定结果一致,4株曲霉菌和一株毛霉菌 PCR
扩增结果为阳性,杂交结果为阴性。14种临床常见细菌检测结果均为阴性。
3 讨论
近年来,临床上酵母菌引起粘膜和系统感染的发生率上升很快,特别是念珠菌已成为医源性感染的常
见病原菌之一[7]。虽然白色念珠菌仍是酵母菌中最多见的病原菌,但大量研究表明,从临床标本中分离出
的包括光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、乳酒念珠菌、季也蒙念珠菌、近平滑念珠菌、葡萄牙念珠菌以
及新型隐球菌越来越多,且不同菌种对抗真菌药物的敏感性不同[8],其耐药性也在不断增加。目前,利用形
态学和生物化学等方法将致病性酵母菌鉴定到种的技术已非常成熟,但通常耗时 3～5d,若在此期间患者
不进行有效的抗真菌治疗,导致体内真菌大量繁殖,后果往往较为严重。因此,实验室及时、准确的病原学
诊断对酵母菌感染的治疗有着重要的作用。
随着分子生物学研究和生物技术的进展,通过核酸序列的分析即基因型的鉴定进行分类被认为是当
前进行种系发生关系及种间、种内分类、分型最可靠的方法之一。rRNA基因序列由于其在进化过程中保守
性强而且其序列中又不乏有可变区和高变区,因此一直是生物学家研究的热点。真菌的 rRNA基因是一种
串联重复基因,即 18SrRNA-ITS1-5.8SrRNA-ITS2-28SrRNA转录单位,分隔 18S,5.8S,28SrRNA基因亚单
位的序列称为内转录间隔区(internaltranscribedspace,ITS),为非编码区。由于 ITS区不加入成熟核糖体,
所以受到的选择压力较小,进化速率较快,在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性。同
图 1 PCR扩增产物电泳结果
1:白色念珠菌 2:热带念珠菌 3:光滑念珠菌 4:克柔念珠菌
5:近平滑念珠菌 6:季也蒙念珠菌 7:葡萄牙念珠菌 8:乳酒念
珠菌 9:新型隐球菌 10:DNAmarkerDL2000
鲁卫平等:通用PCR反向斑点杂交快速检测及鉴定致病性酵母菌 183
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
(上接第174页)
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4 ColinsT,GerdayC,FelerG.FEMSMicrobiologyReviews,2005,29(1):3~23.
5 怀文辉,何秀萍,郭文洁,等.微生物学通报,2000,27(2):137~139.
6 EkaQV,FogartyWM.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,1975,1(1):13~23.
7 BairdSD,JohnsonDA,SeligyVL.JournalofBacteriology,1990,172(3):1576~1586.
8 PriestFG.BacteriologicalReviews,1977,41(3):711~753.
9 GosalbesMJ,Perez-GonzalezJA,GonzalezR,etal.JournalofBacteriology,1991,173(23):7705~7710.
10 姚乌兰,王云山,韩继刚,等.遗传学报,2004,31(9):878~887.
11 ItoY,TomitaT,RoyN,etal.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2003,69(12):6969~6978.
12 萨姆布鲁克 J,拉塞尔 DW.分子克隆实验指南(第 3版).北京:科学出版社,2002.
13 CantwelBA,McConnelDJ.Gene,1983,23(2):211~219.
14 奥斯伯 F,布伦特 R,金斯顿 RE,等.精编分子生物学实验指南.北京:科学出版社,1998:39.
15 LiuYG,WhitierRF.Genomics,1995,25:674~681.
时 ITS序列长度适中,序列中有足够的信息,可广泛用于属内种间或种内群体的系统学研究[9]。
以 5.8SrRNA基因和 28SrRNA基因的保守序列设计真菌通用引物,可扩增真菌 5.8SrDNA部分序列、
ITS2全序列、28SrDNA的部分序列。结果表明,本实验设计的引物以及建立的真菌 rRNA基因通用扩增方
法,具有较好的真菌通用性和特异性,对 9种酵母菌以及曲霉菌、毛霉菌进行扩增,一步扩增出各种真菌的
相应基因片断,而临床常见致病性细菌的扩增结果均为阴性。以位于 5.8S和 28SrDNA之间的内转录间隔
区(ITS2)序列设计种特异性探针,制备杂交膜对产物进行杂交验证,用于真菌的鉴别。试验结果显示,所选
用的探针均能检测出相应的靶序列,每张膜上只有与靶序列对应的探针点有阳性结果,其他探针点均为阴
性。9种真菌的 PCR产物与膜 9杂交,在特异性探针位点上均出现杂交斑点,表明此方法可检测几种菌的
混合感染。对 30例临床分离酵母菌菌株鉴定结果与临床常规鉴定结果一致,由于尚未设计霉菌检测探针,
因此,4株曲霉菌和 1株毛霉菌 PCR扩增结果为阳性,杂交结果均为为阴性。另外,40株临床常见细菌检
测结果均为阴性。结果表明,试验中设计使用的探针未有非特异性的交叉反应,可以对真菌进行种间分型
检测,显示了较好的特异性和敏感性。
因此,采用的方法灵敏度高,特异性强,操作简单,且杂交膜可以预先制备待用,可大大缩短检测时间,
从模板制备到完成杂交检测,整个过程当日可完成。不需要特殊仪器设备,适合临床开展。而且还可以根据
检测需要继续添加特异性探针,在通用 PCR扩增的条件下对更多的病原性真菌进行分型诊断。
参考 文献
1 GiamarelouH,AntoniadouA.InfectControlHospEpidemiol,1996,17(8):558~64.
2 Beck-SagueC,JarvisWR.JInfectDis,1993,167(6):1247~1251.
3 李民,王家俊.国外医学:微生物学分册,2002,25(5):34~36.
4 潘继红,韩金祥.生物技术通讯,2003,14(l):12~15.
5 胡晓红,刘昕,黄正根,等.第三军医大学学报,2006,28(7):734~735.
6 ZhuH,QuF,ZhuLH.NecleicAcidsRes,1993,21(22):5279~5284.
7 PfalhrM,DiekemaDJ,JonesRN,etal.JClinMicrobiol,2001,39(9):3254~3259.
8 VazquezJA,SanchezV,DmuchowskiC,etal.JInfectDis,1993,168(1):195~198.
9 IwenPC,HinrichsSH,RuppME.MedMycol,2002,40(1):87~109.
184