全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第1期
收稿日期:2007-09-12
基金项目:广东省重大专项“禽流感快速诊断技术的研究与应用”(2005A20901004)资助
作者简介:李大旭(1980-),男,蒙古族,博士研究生,研究方向为动物病毒分子生物学
通讯作者:曹永长,Tel:020-85280283,E-mail:yccao@scau.edu.cn
Cre-LoxP位点特异性重组系统属于定位重组
系统之一,是目前国内外研究合应用比较广泛的一
种位点特异性重组系统。该系统来源于噬菌体 P1,
包含有 2个重要的组成部分:一个是 LoxP位点,另
一个是识别 LoxP位点的 Cre重组酶。Cre重组酶是
一种无须辅助因子进行位点特异性重组的生物酶,
它的发现为基因靶位操作创造了有利条件。Cre酶
介导的遗传重组可进行定点、定时、定组织的特异
性控制。该系统于 1981年被首次发现[1],1993年被
Gu等研究人员正式作为一种基因操作手段应用以
来[2,3],已广泛地应用于基因克隆、人工抗体文库的
构建、抗体重排和类型转换等动物模型和嵌合基因
组等研究领域并体现出巨大优势。
1 Cre-LoxP重组系统的特点
Cre是来源于 P1噬菌体 Cre基因所编码的一
个 38ku蛋白,属于 Int家族。它可识别 P1基因组上
由 34bp核苷酸序列构成的称为 LoxP的特异靶位
点,并根据 LoxP的方向性,可在各种底物(超螺旋
环状型,松驰型和线型 DNA分子)上介导三种不同
的重组事件:a.基因序列的插入(图 1A);b.同向位
点之间序列的缺失 (图 1B);c.两个反向位点之间
序列颠倒(图 lC)。需指出的是,Cre重组酶所催化
的是一个可逆的重组事件。重组结果代表着正负反
应的平衡;重组的程度与重组酶的表达水平相关。
Cre催化重组的另外一个重要特点是在位点特异重
组反应的任何阶段上,不需要任何辅助因子的参
Cre-LoxP重组系统的特点及其在抗体研究中的应用
李大旭 马静云 曹永长
(1华南农业大学动物科学学院,广州 510642;2中山大学生命科学学院,广州 510275)
摘 要: Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重
组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除,这种
定位重组系统在大容量噬菌体抗体库,抗体重排,抗体的类型转换和抗体修饰等研究领域发挥了重要的作用。
关键词: Cre-LoxP 重组系统 抗体重排 类型转换
CharacteristicandApplicationinAntibodyResearchofCre-LoxP
RecombinationSystem
LiDaxu MaJingyun CaoYongchang
(1ColegeofAnimalScience,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642;2ColegeofLifeScience,SunYat-Sen
University,Guangzhou510275)
Abstract: TheCre-LoxPsystem from bacteriophageP1isonekindofDNArecombinationsystems,whichhas
received considerableatention forthemanipulation ofheterologousgenomesin vivo.Thissystem can strikingly
accomplishtheexcision,inversionandtargetedintegrationofthetransgenesinintraorinterchromosomalthroughCre-
mediatedsite-specificrecombinationevents.TheCre-LoxP system hasrecentlyexertedasignificantroleonmany
antibodyresearchfields,suchaslargephageantibodyrepertoires,V(D)Jrearangement,immunoglobulinclas-switchand
modifiedantibody.
Keywords: Cre-LoxP Recombinationsystem AntibodyrearangementClasswitch
2008年第1期
与。该特点使 Cre/LoxP位点特异重组酶系统成为可
在各类种属上进行意向 DNA操作的有用工具[3,4]。
LoxP位点是 Cre酶的特异识别位点,DNA序
列长度为 34bp,由两个 13bp的反向重复序列和一
个 8bp的不对称间隔区组成。其中 13bp及邻近的
1个碱基形成 Cre酶结合位点(RecombinaseBinding
Elements,RBE)(图 2),在 LoxP位点中有两个 Cre
酶结合位点,而 2~7位的 6个碱基则是重组发生的
交换区[5]。这个交换区不仅决定重组的方向,而且
决定重组的效率.从功能上可将 8bp的间隔区划分
为 3部分:6,7位是第一次链的交换和连接所必需
的;2至 5位的 4个碱基是第二链的交换和连接所
必需的;1,8位的碱基改变后不影响与野生型 LoxP
位点的发生重组(图 2),但会大大的降低两个突变
LoxP位点的重组效率。重组反应进行时,Cre重组
酶先在7,8位间切割下面的 DNA链,形成“Holiday”
结构,然后在 1,2位间切割上面的 DNA链,从而形
成最终的重组产物。
2 Cre-LoxP重组系统的重组机制
在重组反应过程中,4个 Cre重组酶分子同 2
个 LoxP位点结合形成一个复合体,其中有 2个 Cre
重组酶分子是有重组活性的,另外 2个没有重组活
性[6]。通过对 Cre重组酶的突变分析证明,Cre重组
酶的 N-末端结构域主要起结合位点的识别作用,
而 C末端结构域在重组反应中完成链的切割作用
及链的交换过程,是该酶的重要活性中心。
发生重组时,Cre重组酶先和 DNA结合,但开
始结合力较弱,只有遇到 LoxP位点时结合力才大
大增强。Cre-LoxP复合物结构中一个 LoxP位点与
两个 Cre重组酶分子结合。重组反应过程中,则是
4个 Cre重组酶分子同 2个 LoxP位点结合形成复
合体 (图 3)。发生重组的 2个 LoxP位点中间间隔
区的 2、5、7位的碱基相同或不相同对发生或不发
生重组非常重要。这些位点的碱基不一样时,两个
LoxP位点基本上不会发生重组。其中两个 Cre分子
切割间隔去的第 2位核苷酸,然后 Cre重组酶 C末
端保守的酪氨酸(Tyr324)与 DNA分子的 3-PO4共
价结合形成 3-磷酸酪氨酸,切割后产生的 5-OH
既可与同一断裂部位的 3-PO4结合恢复为原来的
构型,也可与另一切割部位的 3-PO4结合,发生链
的交换,形成一个“Holiday结构”的中间产物,继而
产生结构的异构化,这时第一次切割的 2个 Cre酶
分子不再起切割作用,而是由另外 2个 Cre酶分子
进行第 2次链的切割和交换,在间隔去的第 7位切
开,与第一链的交换一样,去掉或加上中间产物发
生重组,这样便完成了基因的插入或删除[7]。
3 Cre-LoxP重组系统在抗体中的应用
3.1 Cre-LoxP系统在大容量噬菌体抗体库中的
应用
噬菌体抗体库是 20世纪 90年代抗体工程领
域的重大进展,它己成为人源化单克隆抗体研制的
一种重要的途径。一个好的抗体库需具备较大的容
量和良好的多样性,但由于载体系统、克隆过程和
转化效率的限制,长期以来构建大容量抗体库一直
是一个大难题。英国剑桥大学的 GreyWinter实验
图 1 Cre介导的三种重组事件
图 2 LoxP位点的结构图
图 3 Cre-LoxP重组系统的作用机制
李大旭等:Cre-LoxP重组系统的特点及其在抗体研究中的应用 57
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
室一直致力于构建大容量抗体库方面的研究,并于
1994年在该实验室建立了一种基于 Cre-LoxP位点
特异重组原理的克隆系统。
Winter和 Grifiths等[8]首先将 Cre-LoxP定位重
组系统应用于构建大容量抗体库,他们应用一个受
体载体,一个为供体载体的双载体系统,将多样性
大于 108克隆重链库和多样性大于 105的轻链库组
合在一起,经过该载体系统和 P1噬菌体的感染,两
个库之间发生了高效的重组,得到了多样性为 6.5×
1010的抗体库。Sheets等[9]成功构建了人类单链抗体
的噬菌体表面展示文库,并且从该库中筛选到的抗
体可以成功地作为免疫检测试剂,该文库适合于快
速产生针对多种抗原蛋白的高亲和性单链抗体板。
2000年 Sblatero等[10]成功地构建了一个包含有两
非同源的 LoxP位点的噬菌体载体,通过单载体细
胞内重组的方法成功地构建了容量为 3×1011单链
抗体库且有效率很高。目前,国内外已有大量将
Cre-LoxP系统应用噬菌体抗体库和单链抗体库方
面的研究,并在不同程度上极大地提高了抗体库的
多样性[11~13]。
3.2 Cre-LoxP系统在抗体基因重排研究中的应用
B细胞要经过严密调控的重组过程才能产生
抗体。重排过程的第一步是染色体上 VJ和 VDJ的
DNA重排,从而产生编码抗体重链和轻链可变区
的外显子。V(D)J的重排过程受到位于重链 J区段
和 Cμ外显子之间的重链内部增强元件(Intronic
IgHenhancerelement,iEμ)的调控。重链可变区基因
首先与恒定区的 μ基因(Cμ)连接共同表达,产生
表面带有 IgM的 B细胞[14]。为了改变抗体的效应功
能 ,同 时 又 保 持 可 变 区 的 抗 原 结 合 特 异 性 ,
Stavnezer[15]于 2000年在已激活的 B淋巴细胞中,利
用位于 Cμ下游的 Cγ基因代替 Cμ基因,成功在
实现了抗体基因重排的第 2个过程——抗体的类
型转换重排(IgHClassSwitchRecombination,CSR)。
CSR过程不仅受到 iEμ的调控[2,16],而且更主要的
是受到重链恒定区下游 3端基因的调控。
自 Petersson发现 IgH3端下游调控区以后,
已有大量的研究表明在抗体 Cα基因的下游 30kb
的区域内存在着四个相互隔离的增强元件,分别为
HS3a,HS1,2,HS3b和 HS4[17,18]。这些重链恒定区下
游 3端基因的调控元件在人类和其他物种中也是
很保守的[19,20]。Manis等人利用两侧带有 LoxP位点
的 pgk-neo基因盒来替代 HS1,2增强子元件,并通
过 Cre酶介导的基因敲除彻底地切除了 HS1,2增
强子元件,结果发现在 HS1,2之间 17kb的区域内
插入 pgk-neo会影响到体细胞的转录和 CSR过程,
而在 HS1,2的上下游之间的不同位点插入 pgk-neo
基因盒都不影响抗体的 CSR过程。接着又将 pgk-
neo基因盒插入到 HS3和 HS4之间和下游,结果发
现 pgk-neo基因盒插入到 HS4下游的 2kb区域内
明显地抑制了 CSR过程。以上结果说明 IgH3端
下游调控区可能存在于 HS1,2之间 17kb的区域
和 HS4下游的 2kb区域内[21]。Sun等人[22]将 pgk-neo
基因盒插入到 Jλ1的上游,极大的提高了 Vλ1-Jλ1
的重排.在抗体轻链的调控区中,有研究表明 3Ek
增强字可提高或抑制可变区基因的俄重排,为了验
证 3Ek对 kappa链可变区基因重排的影响,Stoep[23]
利用 Cre-LoxP系统将 3Ek特异性地敲除,结果发
现在线性 T细胞和祖 B细胞中,3Ek的缺失并没
有影响到 kappa链可变区基因重排。
也有研究表明,V(D)J的重排可能是由于抗体
基因组中一些特定的位点的改变所引起的,例如特
定位点的甲基化修饰[24]。因此 Chery等人[25]建立了
一个用来验证甲基化修饰对 kappa链重组的影响
的 Abelson细胞系系统.该细胞系的甲基化转移酶
基因 Dnmt1两侧带有 LoxP位点,当 Cre酶存在时
便可有效地将 Dnmt1基因切除掉.Chery等利用这
个系统有效地对 kappa链进行了甲基化但结果发
现并没有激活 V(D)J的重排,去甲基化之后只有
一个细胞系中 kappa链的转录和重组被激活了,说
明甲基化并不能有效地的激活 V(D)J的重排。
3.3 Cre-LoxP系统在抗体基因敲除中的应用
B淋巴细胞的发育起始于 DNA的重排和表面
免疫球蛋白重链的表达。在 B细胞分化的前期,μ
重链与代理轻链结合形成前 B细胞受体。随后,代
理轻链被正式的轻链所代替形成在不成熟的 B细
胞时期表达的 B细胞受体。接着细胞表面表达 IgM
和 IgD并意味着成熟 B细胞的形成。成熟的 B细胞
进一步发育为产生抗体的浆细胞,抗体重链的恒定
区基因由 μ基因逐渐地转为 γ、ε、α,而保持最初
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2008年第1期
重排了的可变区基因不变从而实现抗体的类型转
换。
已有许多基因打靶的研究工作集中到单个抗
体基因的缺失对抗体产生的影响,但研究表明通过
Cre-LoxP及其他突变系统造成 Cμ、Cδ、Cε的缺失
并没有很明显的影响到 B细胞的发育过程[26],原因
是保留下来的 C基因能够弥补缺失基因的功能。以
下有两种方法可以使抗体重链恒定区基因合成受
阻从而影响到 B细胞的发育。一种是抗体 J区基因
的敲除,Gu等人研究发现通过 Cre酶介导的位点
特异性重组系统将 J区基因敲除之后,大大降低了
(D)-J重排的多样性,而且小鼠产生抗体的 Ig+B细
胞大大减少,发育为 B220+B细胞;另一种方法是扰
乱 Cμ跨膜区外显子,Kitamura等[27]通过基因打靶
技术将 Cμ跨膜区外显子突变产生了抗体生成缺
陷的小鼠,并且证实了 B细胞的发育依赖于前 B
细胞表面表达 μ型重链。Ren等[28]利用 Cre-LoxP系
统将整个重链恒定区,包括 Cμ-Cδ-Cγ3-Cγ1-Cγ2b-
Cγ2a-Cε-Cα,长为 200kb的区段全部删除掉,完全
阻碍了 B细胞的发育,终止了抗体的产生,但也意
外的发现 200kb区段全部删除并没有影响到抗体
基因组 DNA的重排。
3.4 Cre-LoxP系统在抗体类型转换研究中的应用
抗原刺激 B细胞之后,发生重链 DNA重排,由
此产生的 VH-DH-JH可与任何一个 CH基因片段
联合。但在 B细胞发生过程中,膜上最先表达的是
IgM,以后共表达 IgM和 IgD,在抗原激活 B细胞
后,膜上表达和分泌的 Ig类型会转换成 IgG、IgA、
IgE等其他类型或亚类,这种现象称为抗体的类型
转换(classswitchrecombination,CSR)这种现象只与
重链恒定区有关,因此不影响抗体的特异性,但抗
体的类型不同,其生物效应也不同[29]。类型转换过
程中,在编码 C基因的 5端的内含子中,除了 Cδ
基因外,都有一段重复性 DNA序列称为转换区(S
区).在类型转换时,例如,从 Cδ转换为 Cγ1时,Sδ
和 Sγ1发生重组,位于期间的 Cμ、Cδ基因形成环
状物后被切除,从 Cγ转换成 Cε时,Cγ1到 Cε基
因形成环状物被切除[30]。B细胞中这种类型转换可
以不止一次,从而表达另一种 Ig类型。
抗体恒定区基因的转录起始于 CH上游外显
子中的第一个非编码的 exon1,接着是转换区的转
录,最后是下游 CH基因 Cμ-Cδ-Cγ3-Cγ1-Cγ2b-
Cγ2a-Cε-Cα的转录。为了研究 Cγ2b的 exon1及其
剪切位点对 CSR的影响,Seidl等人[31]首先在小鼠
的 ES细胞中利用两侧带有 LoxP位点的 PGK-neor
基因盒来替代 exon1及其剪切位点,接着用 Cre酶
特异性的切除掉整个 exon1及其剪切位点,研究表
明,完全的切除 exon1及其剪切位点序列抑制了
CSR,不能产生 Cγ2b类型的抗体。但是也同时发现
exon1及其剪切位点序列对 CSR并不是非常重要
的,因为用两侧带有 LoxP位点的 PGK-neor基因盒
来代替 exon1及其剪切位点的 ES细胞的 CSR过
程并没有受到抑制。MRN(Mre11-Rad50-Nbs1)功能
复合体是 DNA损伤的感应因子[32],Reina等人[33]利
用 Cre-LoxP系统特异性地在 B淋巴细胞中将 Nbs1
敲除,结果发现在 Nbs1缺失型的 B淋巴细胞中抗体
的类型转换受到了严重的抑制[34]。Jakobovits等人[35]
利用 Cre-LoxP的整合系统在小鼠杂交瘤细胞系中
成功地实现了 Cμ到 Cγ的类型转换。
总之,Cre/LoxP系统的应用使人们定向定点地
对抗体基因组或染色体进行操作成为可能。由此发
展起来的定点整合与选择标记基因的去除技术在
抗体中的应用是基因工程中的两项颇有发展前途
的新策略。但是这两项技术的应用也有其自身的缺
陷。比如必须在杂交瘤或 ES细胞中内首先引入
LoxP位点,才能实现下一步的定点整合等。此外在
完善该系统应用的同时,可以探讨重组酶家族中其
它成员的开发与应用,以期能够更简单更有效地对
抗体基因组进行遗传修饰。
参考 文献
1 DeshmukhN,FengG,GregoryD,etal.EMBUJ,1998,17:4175~
4187.
2 GuH,ZouYR,RajeuskyK.IndependentCel,1993,73:1155~
1164.
3 GuoF,GopaulDN,VanDuyneGD.Nature,1997,389(6646):40~
46.
4 SauerB.Methods,1998,14(4):381~392.
5 VanDuyneGD.AnnuRevBiophysBiomolStruct,2001,30:87~
104.
6 KilbyNJ,SnaithMR,MurayJA.TreadsGenetic,1993,9(12):413~
421.
李大旭等:Cre-LoxP重组系统的特点及其在抗体研究中的应用 59
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
10 蒋建林,蒋金书.动物医学进展,2002,23(5):64～65.
11 韩红玉,黄兵,等.生物工程学报,2001,17(6):669～672.
12 李建华,张西臣,陈丽凤,等.寄生虫与医学昆虫学报,2005,
12(3):143～145.
13 JenkinsMC,DanforthHD,LilehojetalHS.MolBiochemParasitol,
1989,32(2~3):153～162.
14 BingerMH,etal.MolBiochemParasitol,1993,61(2):179～187.
15 BrothersV,etal.MolBiochemParasitol,1988,28(3):235～247.
16 LaurentF,BourdieuC,YvoreP,etal.MolBiochemParasitol,1994,
66(2):349～352.
17 LaurentF,BourdieuC,KagaM,eta1.MolBiochemParasitol,1993,
62(2):303～312.
18 OssorioPN,etal.MolBiochemParasitol,1992,50(1):1～15.
19 BohneW,etal.MolMicrobiol,1995,16(6):12～21.
20 WanKL,BlackwelJM,AjiokaJW,etal.MolBiocalemParasitol,
1996,75(2):179～186.
21 杨秋林,等.中国人兽共患病杂志,2000,16(5):25～27.
22 杨秋林,等.寄生虫与医学昆虫学报,2001,8(2):82～86.
23 OmaraAL,etal.MolBiochemParasitol,1997,90(1):247～267.
24 CamposNA,etal.ExpMed,1995,182(5):1423～1433.
25 敬保迁,胡孝素,陈建平,等.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,
1997,15(6):370～372.
26 章家新,等.汕头大学医学院学报,2003,16(4):198～200.
27 章家新,等.医学研究生学报,2004,17(8):680～684.
28 张可浩,等.汕头大学医学院学报,2004,17(3):132～135.
29 傅作申,程远国,等.热带医学杂志,2002,2(3):225～229.
30 乔中东,HansP,ScImitW,等.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,
1996,14(3):205～211.
31 PetryF,etal.MolBiochemParasitol,1998,95(1):21～31.
32 徐卫东,张西臣,孔庆昌,等.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,
2002,20(5):281～284.
33 NarasihanS,ArmstrongMY,RheeK,etal.ProcNatlAcadSci
USA,1994,91(16):7440～7444.
34 刘全,等.中国病原生物学杂志,2006,1(5):366～368.
7 GopaulDN,VanD.CurentOpinioninStructuralBiology,1999,9:
14~20.
8 WinterG,GrifithsAD,HawkinsRE,etal.AnnRevImmunol,1994,
12:433~455.
9 SheetsMD,AmersdorferP,FinnerR,etal.ProcNatlAcadSci,
1998,95:6157~6162.
10 SblateroD,BradburyA.NatBiotechnol,2000,18:74~80.
11 TsurushitaN,FuH,WarenC.Gene,1996,172(1):59~63.
12 SblateroD,LouJ,MarzariR,etal.RevMoleBiotechnol,2001,
74:303~315.
13 CenX,BiQ,ZhuS.ApplMicrobiolBiotechnol,2006,71(5):767~
772.
14 LansfordR,etal.MolImmunol,1996,10:248~282.
15 StavnezerJ.CurTopMicrobiolImmunol,2000,245:127~168.
16 BotaroA,YoungF,etal.IntImmunol,1998,10:799~806.
17 LiebersonR,OngJ,ShiX,EckhardtLA.EMBOJ,1995,14:6229~
6238.
18 MichaelsonJS,GianniniSL,BirshteinBK.NucleicAcidsRes,1995,
23:975~981.
19 ChenC,BirshteinBK.JImmunol,1997,159:1310~1318.
20 MilsFC,HarindranathN,MitchelM,MaxEE.JExpMed,1997,
186:845~858.
21 ManisJP,MichaelsonJS,BirshteinBK,AltFW.MolImmunol,2003,
39:753~760.
22 SunT,StorbU.JExpMed,2001,193:699~712.
23 StoepN,GormanJR,AltFW.Immunity,1998,8:743~750.
24 CherySR,BaltimoreD.ProcNatlAcadSciUSA,1999,96:10788~
10793.
25 CherySR,BeardC,JaenischR,etal.ProcNatlAcadSciUSA,
2000,97:8467~8472.
26 LutzC,LedermannB,etal.Nature,1998,393:797~801.
27 KitamuraD,RoesJ,KuhnR,etal.Nature,1991,350:423~426.
28 RenL,ZouX,SmithJA,BruggemannM.Genomics,2004,84:
686~695.
29 LorenzM,JungS,RadbruchA.Science,1995,267:1825~1838.
30 JungS,RajewskyK,RadbruchA.Science,1993,259:984~987.
31 SeidlKJ,BotaroA,etal.IntImmunol,1998,10:1683~1692.
32 StrackerTH,TheunissenJW,MoralesM,etal.DNARepair,2004,
3:845~854.
33 Reina-San-MartinB,NussenzweigMC,NussenzweigA,etal.Proc
NatlAcadSciUSA,2005,102:1590~1595.
34 StrackerTH,HusseinH,etal.Nature,2007,447:218~221.
35 JakobovitsA,ZseboKM.Productiouofantibodiesusingcre-mediated
site-specificreconbination.USPatent6458592,2000,1~18.
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
(上接第55页)
60