全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员员袁圆缘渊远冤院员员员苑 耀 员员圆圆允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员员鄄园缘鄄员愿摇 接受日期院圆园员员鄄园远鄄圆圆
基金项目院野泰山学者冶建设工程专项经费袁国家高技术研究发展计划渊愿远猿 计划袁圆园员园粤粤员园在员园猿冤
作者简介院马连杰渊员怨愿圆鄄冤袁女袁河北保定人袁硕士研究生袁研究方向为分子植物病理遥 耘鄄皂葬蚤造院 酝葬造蚤葬灶躁蚤藻岳 赠葬澡燥燥援 糟灶
通讯作者院储昭辉渊员怨苑苑鄄冤袁男袁安徽岳西人袁博士后袁教授袁研究方向为微生物与植物互作遥 耘鄄皂葬蚤造院扎糟澡怎岳 泽凿葬怎援 藻凿怎援 糟灶
丁新华渊员怨愿园鄄冤袁男袁湖北武汉人袁博士袁教授袁研究方向为微生物与植物互作遥 耘鄄皂葬蚤造院曾澡凿蚤灶早岳 泽凿葬怎援 藻凿怎援 糟灶
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员员冤园远鄄员员员苑鄄园远
利用 悦则藻 辕 造燥曾特异位点重组系统获得无选择标记
转 粤贼酝再月员圆基因的马铃薯
马连杰摇 刘海峰摇 王志强摇 代丽丽摇 丁新华摇 储昭辉
渊山东农业大学植物保护学院 辕山东省农业微生物重点实验室袁山东 泰安摇 圆苑员园员愿冤
摘摇 要院类黄酮是植物产生的一类次级代谢产物的总称袁长期食用含类黄酮的果实和蔬菜有易于人体健
康袁目前广泛种植的马铃薯品种中仅含有痕量的类黄酮遥 粤贼酝再月员圆 是拟南芥中鉴定的调控类黄酮生物
合成的特异性转录因子袁并在烟草和番茄中得到了功能验证遥 为了增加马铃薯中类黄酮的含量袁本研究
构建 责载远鄄责葬贼葬贼蚤灶院院粤贼酝再月员圆 无选择标记载体袁利用农杆菌转化法将 粤贼酝再月员圆 基因转入马铃薯品种
阅藻泽蚤则藻藻袁并检测选择标记 晕孕栽 陨陨基因去除以及马铃薯块茎中类黄酮积累情况遥 结果显示袁共得到 圆愿 个
阳性转基因株系遥 随机选择其中的 圆 个株系进行雌二醇诱导袁晕孕栽 陨陨 去除效率达到 愿郾 愿豫 袁转基因马铃
薯块茎中芦丁的含量最高达到 猿郾 园怨员皂早 辕 早 阅宰袁山奈酚芸香苷含量达到 园郾 怨缘员皂早 辕 早 阅宰袁而对照马铃薯
品种 阅藻泽蚤则藻藻中芦丁和山奈酚芸香苷等类黄酮含量低于高效液相色谱检测限值遥 结果表明袁粤贼酝再月员圆 基
因也能在马铃薯中调控类黄酮的合成遥
关键词院马铃薯曰类黄酮曰粤贼酝再月员圆曰悦则藻 辕 造燥曾重组系统曰无选择标记
阅耘灾耘蕴韵孕酝耘晕栽 韵云 酝粤砸运耘砸鄄云砸耘耘 栽砸粤晕杂郧耘晕陨悦 孕韵栽粤栽韵 宰陨栽匀 粤贼酝再月员圆 郧耘晕耘
月再 悦则藻 辕 造燥曾 杂陨栽耘鄄杂孕耘悦陨云陨悦 砸耘悦韵酝月陨晕粤栽陨韵晕 杂再杂栽耘酝
酝粤 蕴蚤葬灶鄄躁蚤藻摇 蕴陨哉 匀葬蚤鄄枣藻灶早摇 宰粤晕郧 在澡蚤鄄择蚤葬灶早摇 阅粤陨 蕴蚤鄄造蚤 摇 阅陨晕郧 载蚤灶鄄澡怎葬摇 悦匀哉 在澡葬燥鄄澡怎蚤
渊杂澡葬灶凿燥灶早 孕则燥增蚤灶糟藻 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 酝蚤糟则燥遭蚤燥造燥早赠援 悦燥造造藻早藻 燥枣 孕造葬灶贼 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶袁
杂澡葬灶凿燥灶早 粤早则蚤糟怎造贼怎则藻 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 栽葬蚤爷葬灶袁 杂澡葬灶凿燥灶早摇 圆苑员园员愿冤
粤遭泽贼则葬糟贼院粤泽 葬 糟造葬泽泽 燥枣 泽藻糟燥灶凿葬则赠 皂藻贼葬遭燥造蚤贼藻泽 蚤灶 责造葬灶贼泽袁 枣造葬增燥灶燥蚤凿泽 蚤泽 早燥燥凿 枣燥则 澡怎皂葬灶 澡藻葬造贼澡 憎澡藻灶 贼澡藻 枣则怎蚤贼泽 葬灶凿
增藻早藻贼葬遭造藻泽 糟燥灶贼葬蚤灶蚤灶早 贼澡蚤泽 噪蚤灶凿 燥枣 泽怎遭泽贼葬灶糟藻泽 葬则藻 燥枣贼藻灶 糟燥灶泽怎皂藻凿援 匀燥憎藻增藻则 燥灶造赠 贼则葬糟藻 葬皂燥怎灶贼泽 燥枣 枣造葬增燥灶燥蚤凿泽 糟葬灶 遭藻
凿藻贼藻糟贼藻凿 燥灶 糟怎则则藻灶贼 憎蚤凿藻造赠 责造葬灶贼藻凿 责燥贼葬贼燥 增葬则蚤藻贼蚤藻泽援 粤贼酝再月员圆 憎葬泽 燥则蚤早蚤灶葬造造赠 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤藻凿 葬泽 葬 枣造葬增燥灶燥蚤凿泽鄄泽责藻糟蚤枣造糟
贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 枣葬糟贼燥则 蚤灶 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 贼澡葬造蚤葬灶葬袁 憎澡蚤糟澡 澡葬泽 遭藻藻灶 糟燥灶枣蚤则皂藻凿 贼燥 葬糟贼蚤增葬贼藻 贼澡藻 枣造葬增燥灶燥蚤凿泽 泽赠灶贼澡藻泽蚤泽 蚤灶 贼燥遭葬糟糟燥 葬灶凿
贼燥皂葬贼燥援 陨灶 燥则凿藻则 贼燥 蚤灶糟则藻葬泽藻 贼澡藻 糟燥灶贼藻灶贼 燥枣 枣造葬增燥灶燥蚤凿泽 蚤灶 责燥贼葬贼燥袁 憎藻 糟燥灶泽贼则怎糟贼藻凿 贼澡藻 皂葬则噪藻则鄄枣则藻藻 增藻糟贼燥则 责载远鄄责葬贼葬贼蚤灶院院
粤贼酝再月员圆袁 贼澡藻灶 蚤灶贼则燥凿怎糟藻凿 蚤贼 蚤灶贼燥 贼澡藻 泽怎泽糟藻责贼蚤遭造藻 糟怎造贼蚤增葬则 阅藻泽蚤则藻藻 增蚤葬 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂鄄皂藻凿蚤葬贼藻凿 泽贼藻皂 泽藻早皂藻灶贼
贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 圆愿 责燥泽蚤贼蚤增藻 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责燥贼葬贼燥 造蚤灶藻泽 憎藻则藻 葬糟择怎蚤则藻凿袁 葬灶凿 贼澡藻 凿藻造藻贼蚤燥灶 藻枣枣蚤糟蚤藻灶糟赠 燥枣
晕孕栽陨陨 蚤灶 圆 皂葬则噪藻则鄄枣则藻藻 造蚤灶藻泽 憎葬泽 怎责 贼燥 愿郾 愿豫 援 栽澡藻 糟燥灶贼藻灶贼 燥枣 则怎贼蚤灶 葬灶凿 噪葬藻皂责枣藻则燥造 则怎贼蚤灶燥泽蚤凿藻 憎葬泽 怎责 贼燥 猿郾 园怨员 葬灶凿
园郾 怨缘员皂早 辕 早 阅宰 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责燥贼葬贼燥 贼怎遭藻则泽袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援 陨贼 蚤泽 泽怎早早藻泽贼藻凿 贼澡葬贼 粤贼酝再月员圆 糟葬灶 葬造泽燥 则藻早怎造葬贼藻 贼澡藻 枣造葬增燥灶燥蚤凿泽
泽赠灶贼澡藻泽蚤泽 蚤灶 责燥贼葬贼燥援
运藻赠 憎燥则凿泽院责燥贼葬贼燥曰 枣造葬增燥灶燥蚤凿泽曰 粤贼酝再月员圆曰 悦则藻 辕 造燥曾 则藻糟燥皂遭蚤灶葬贼蚤燥灶 泽赠泽贼藻皂曰 皂葬则噪藻则鄄枣则藻藻
苑员员员
核摇 农摇 学摇 报 圆缘 卷
摇 摇 类黄酮渊 枣造葬增燥灶燥蚤凿泽冤袁又称黄酮类化合物袁是最主
要的植物酚类代谢物袁广泛存在于植物中遥 类黄酮的
分子结构通常由 圆 个羟基化芳香环和 员 个氧杂环组
成袁按照氧杂环的结构不同可分为黄酮尧异黄酮尧黄酮
醇尧异黄酮醇尧黄烷酮尧异黄烷酮袁花色素等类型咱员暂 遥
植物类黄酮具有强抗氧化性袁被人体摄入后能够清除
自由基引起的组织氧化损伤遥 另外袁植物类黄酮还具
有抗癌尧抗心血管病尧抗炎症等作用咱圆 耀 缘暂 遥 拟南芥
砸圆砸猿鄄酝再月类转录因子 粤贼酝再月员圆 为类黄酮生物合成
的特异激活子袁在拟南芥中可以增加类黄酮含量的积
累咱远暂 遥 蕴怎燥 等咱苑暂将该基因转化到番茄中袁发现芦丁和
山奈酚芸香糖苷含量比对照增加了 远缘 倍袁总的黄酮醇
积累量达到了 苑圆皂早 辕 早 阅宰遥
转基因育种技术是常规育种的有益补充袁转基因
植物中筛选标记的存在是转基因安全上争论的焦点之
一袁标记基因的去除已经成为近年来转基因研究的热
点遥 目前筛选标记的去除方法主要有转座子系
统咱愿袁怨暂 尧 共转化系统咱员园暂 尧同源重组以及 悦则藻 辕 造燥曾尧 云蕴孕 辕
枣则贼和 砸 辕 砸泽系统等位点特异性重组系统咱员员 耀 员猿暂 遥 位点
特异性重组系统因具有操作简便袁转化周期短等特点袁
已逐渐成为筛选标记去除的首选工具遥 其中 悦则藻 辕 造燥曾
系统是应用最广泛尧研究最深入的位点特异性重组系
统遥 此系统于 员怨愿员 年在 孕员 噬菌体中被发现咱员源暂 袁最早
应用于动物转基因研究中遥 员怨怨园 年袁阅葬造藻 等首次将
悦则藻 辕 造燥曾系统应用于转基因烟草中袁实现了分子内特
异性重组咱员缘暂 遥 在怎燥 等成功地开发了一个化学诱导型
的 悦则藻 辕 造燥曾 系统袁此系统中袁编码重组酶的 糟则藻 基因在
雌二醇的诱导下表达袁将 圆 个 造燥曾责 位点之间的区间包
括筛选标记的部分成功剪切掉袁从而达到去除 晕孕栽 陨陨
基因的目的咱员员暂 遥 目前此系统已经成功应用于烟草尧拟
南芥尧番茄等多种植物的无选择标记品种培育中遥
马铃薯是重要的粮食作物之一袁属于茄科袁同源四
倍体袁应用杂交育种的方法改良品种比较困难袁同时马
铃薯块茎中多酚类化合物含量非常低咱员远袁员苑暂 遥 为了进
一步研究 粤贼酝再月员圆 基因的功能以及雌二醇诱导的
悦则藻 辕 蕴燥曾系统在马铃薯中的应用情况袁本试验利用转
基因技术将构建的无选择标记载体 责载远鄄责葬贼葬贼蚤灶院院
粤贼酝再月员圆 转入到马铃薯中袁检测 晕孕栽 陨陨 基因剔除效
率袁同时利用高压液相色谱渊匀孕蕴悦冤测定 栽园 代马铃薯
块茎中类黄酮的含量袁与番茄中 粤贼酝再月员圆 表达所引起
的类黄酮含量变化进行比较袁以确定该基因在调控马
铃薯中类黄酮合成的作用袁为利用转录因子改良作物
中类黄酮含量提供进一步的理论依据遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 材料
农杆菌菌株 粤郧蕴员 和大肠杆菌 阅匀缘琢 由本实验室
保存遥 无选择标记系统双元表达载体 责载远鄄郧云孕袁由华
中农业大学张余洋博士惠赠遥 转化受体植物马铃薯
阅藻泽蚤则藻藻脱毒试管苗由山东农业科学院高新技术中心
李广存博士惠赠遥
马铃薯转化用培养基院 酝园院 员 伊 酝杂袁 园郾 圆皂早 辕 蕴
晕粤粤袁 园郾 园圆皂早 辕 蕴 郧粤猿袁 圆郾 缘皂早 辕 蕴 扎藻葬贼蚤灶 则蚤遭燥泽蚤凿藻袁 圆园早 辕 蕴
蔗糖袁愿早 辕 蕴 琼脂粉袁责匀缘郾 苑 耀 缘郾 愿曰酝员院 酝园 垣 缘园园皂早 辕 蕴
糟藻枣燥贼葬曾蚤皂藻袁责匀缘郾 苑 耀 缘郾 愿曰酝圆院 员 伊 酝杂袁 园郾 园圆皂早 辕 蕴 晕粤粤袁
园郾 园圆皂早 辕 蕴 郧粤猿袁 圆皂早 辕 蕴 扎藻葬贼蚤灶 则蚤遭燥泽蚤凿藻袁 缘园园皂早 辕 蕴糟藻枣燥贼葬曾蚤皂藻袁 缘园皂早 辕 蕴 噪葬灶葬皂赠糟蚤灶袁圆园早 辕 蕴 蔗糖袁愿早 辕 蕴 琼脂
粉袁责匀缘郾 苑 耀 缘郾 愿曰酝砸院 员 伊 酝杂袁 缘园园皂早 辕 蕴 糟藻枣燥贼葬曾蚤皂藻袁
缘园皂早 辕 蕴 噪葬灶葬皂赠糟蚤灶袁 圆园早 辕 蕴 蔗糖袁愿早 辕 蕴 琼脂粉袁责匀 缘郾 苑
耀 缘郾 愿遥
员郾 圆摇 植物 阅晕粤尧砸晕粤的提取
马铃薯中薯 源 号叶片 阅晕粤 提取采用 悦栽粤月
法咱员愿暂 袁取 园郾 缘早左右幼嫩的植物叶片袁以 猿园园滋造 阅晕粤提
取缓冲液 渊 缘园皂皂燥造 辕 蕴 栽则蚤泽鄄匀悦蕴袁 圆缘皂皂燥造 辕 蕴 耘阅栽粤袁
猿园园皂皂燥造 辕 蕴 晕葬悦造袁员豫 杂阅杂冤研磨袁加入等体积氯仿混匀
离心后采用乙醇沉淀袁最终溶解于 缘园滋造 栽耘 溶液用于
后续 孕悦砸或 原 圆园益暂时保存遥
植物组织 砸晕粤 的提取采用 栽砸陨 则藻葬早藻灶贼 渊 杂蚤早皂葬袁
美国冤法袁按照试剂盒说明书操作遥 起始材料为 员园园皂早
拟南芥新鲜幼苗袁提取的 砸晕粤 溶解在 缘园滋造 无 砸晕葬泽藻
去离子水中袁 原 愿园益保存备用遥
员郾 猿摇 孕悦砸扩增和 砸栽鄄孕悦砸扩增
载体构建中涉及 孕葬贼葬贼蚤灶 启动子尧粤贼酝再月员圆 基因的
扩增采用高保真 孕悦砸袁按照 孕澡怎泽蚤燥灶 超保真 阅晕粤 聚合
酶渊云陨晕晕在再酝耘杂袁 芬兰冤操作指导进行遥 缘园滋造 孕悦砸 反
应体系渊终浓度包含 员 伊 孕澡怎泽蚤燥灶 匀云 遭怎枣枣藻则袁圆园园滋皂燥造 辕 蕴
凿晕栽孕袁 园郾 缘滋皂燥造 辕 蕴 孕则蚤皂藻则 藻葬糟澡袁 园郾 园圆哉 辕 滋造 孕澡怎泽蚤燥灶
阅晕粤 孕燥造赠皂藻则葬泽藻袁 圆灶早 辕 滋造 阅晕粤冤在 粤月陨怨苑园园 型 孕悦砸 仪
上反应条件为院怨愿益预变性 员皂蚤灶曰 怨愿益变性 员园泽袁缘愿益
退火 员园泽袁 苑圆益 延伸 员皂蚤灶袁 猿缘 个循环曰 苑圆益 终延伸
员园皂蚤灶遥 载体构建过程中涉及的细菌阳性检测和转基
因植株阳性检测均采用常规 孕悦砸袁试剂采用 栽葬运葬砸葬
则栽葬择 阅晕粤 孕燥造赠皂藻则葬泽藻袁圆园滋造 孕悦砸 反应体系渊终浓度包
含 员 伊 孕悦砸 遭怎枣枣藻则袁缘园滋皂燥造 辕 蕴 凿晕栽孕袁 园郾 圆滋皂燥造 辕 蕴 孕则蚤皂藻则
藻葬糟澡袁 园郾 园缘哉 辕 滋造 则栽葬择 阅晕粤 孕燥造赠皂藻则葬泽藻袁 圆灶早 辕 滋造 阅晕粤冤
反应条件为院怨源益预变性 猿皂蚤灶曰怨源益变性 猿园泽袁缘愿益退
愿员员员
摇 远 期 利用 悦则藻 辕 造燥曾特异位点重组系统获得无选择标记转 粤贼酝再月员圆 基因的马铃薯
火 猿园泽袁苑圆益延伸 员皂蚤灶袁 猿缘 个循环曰苑圆益终延伸 员园皂蚤灶遥
试验中用到的引物序列及说明见表 员遥
拟南芥 粤贼酝再月员圆 基因的扩增采用两步法 砸栽鄄
孕悦砸袁第 员 链 糟阅晕粤的合成采用 孕则蚤皂藻 杂糟则蚤责贼 砸栽 则藻葬早藻灶贼
运蚤贼 憎蚤贼澡 早阅晕粤 耘则葬泽藻则 试剂盒渊栽葬运葬砸葬袁大连冤袁按说明
书操作遥 以上述第一链合成的 糟阅晕粤作为第二步 孕悦砸
扩增的模板袁利用引物 粤贼酝再月员圆云员 和 粤贼酝再月员圆砸员 对
第一链 糟阅晕粤进行高保真 孕悦砸 扩增袁反应体系和条件
如上所述遥
表 员摇 试验使用的引物
栽葬遭造藻 员摇 孕则蚤皂藻则泽 怎泽藻凿 蚤灶 贼澡蚤泽 泽贼怎凿赠
引物
责则蚤皂藻则
基因
早藻灶藻
序列
泽藻择怎藻灶糟藻
携带的酶切位点
藻灶扎赠皂藻 凿蚤早藻泽贼蚤燥灶 泽蚤贼藻
粤贼酝再月员圆云圆 粤贼酝再月员圆 缘爷鄄粤栽郧郧粤粤栽栽悦粤悦栽栽栽栽郧栽郧郧栽悦粤郧栽郧郧粤粤栽粤鄄猿爷 耘糟燥 砸陨
粤贼酝再月员圆砸圆 粤贼酝再月员圆 缘爷鄄粤栽郧悦栽悦郧粤郧粤粤悦郧郧粤栽悦粤粤栽悦粤粤栽粤栽悦粤栽鄄猿爷 载澡燥 陨
粤贼酝再月员圆云员 粤贼酝再月员圆 缘爷鄄粤悦栽栽栽栽郧栽郧郧栽悦粤郧栽郧郧粤粤栽粤鄄猿爷 要
粤贼酝再月员圆砸员 粤贼酝再月员圆 缘爷鄄粤粤悦郧郧粤栽悦粤粤栽悦粤粤栽粤栽悦粤栽鄄猿爷 要
孕葬贼葬贼蚤灶 孕砸韵 云源 责葬贼葬贼蚤灶 缘爷鄄粤栽郧粤悦栽粤郧栽郧栽栽悦粤郧栽粤粤栽栽郧粤悦悦郧郧粤郧粤悦鄄猿爷 杂责藻 陨
孕葬贼葬贼蚤灶 孕砸韵 砸源 责葬贼葬贼蚤灶 缘爷鄄粤栽郧郧粤粤栽栽悦粤粤栽栽栽栽郧栽栽郧郧栽郧悦栽栽栽郧粤郧鄄猿爷 耘糟燥 砸陨
晕孕栽 陨陨 云 晕孕栽 陨陨 缘爷鄄粤郧悦悦粤粤悦粤粤悦郧悦栽粤栽郧栽悦悦栽郧粤栽鄄猿爷 要
晕孕栽 陨陨 砸 晕孕栽 陨陨 缘爷鄄栽郧粤粤栽郧粤粤悦栽郧悦粤郧郧粤悦郧粤郧鄄猿爷 要
图 员摇 载体构建示意图和重组质粒酶切鉴定
云蚤早援 员摇 杂糟澡藻皂葬贼蚤糟 凿蚤葬早则葬皂 燥枣 贼澡藻 增藻糟贼燥则 糟燥灶泽贼则怎糟贼蚤燥灶 葬灶凿 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 则藻糟燥皂遭蚤灶葬贼蚤燥灶 责造葬泽皂蚤凿
粤院 植物表达载体 责载远鄄责葬贼葬贼蚤灶院院粤贼酝再月员圆 栽鄄阅晕粤部分示意图和 茁鄄耘泽贼则葬凿蚤燥造诱导 阅晕粤重组后的产物曰月院 重组质粒 责载远鄄责葬贼葬贼蚤灶院
粤贼酝再月员圆 载澡燥 陨 辕 杂责藻 陨双酶切曰酝院 栽则葬灶泽圆运栽酝孕造怎泽 陨陨 阅晕粤 标准曰 员 耀 猿院 经 载澡燥 陨 辕 杂责藻 陨酶切的重组质粒
粤院 泽糟澡藻皂葬贼蚤糟 凿蚤葬早则葬皂 燥枣 贼澡藻 栽鄄阅晕粤 则藻早蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 增藻糟贼燥则 责载远鄄责葬贼葬贼蚤灶院院粤贼酝再月员圆 葬灶凿 责怎贼葬贼蚤增藻 责则燥凿怎糟贼泽 燥枣 贼澡藻 茁鄄藻泽贼则葬凿蚤燥造鄄蚤灶凿怎糟藻凿 阅晕粤
则藻糟燥皂遭蚤灶葬贼蚤燥灶曰月院 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 则藻糟燥皂遭蚤灶葬贼蚤燥灶 责造葬泽皂蚤凿 责载远鄄责葬贼葬贼蚤灶院院粤贼酝再月员圆 凿蚤早藻泽贼藻凿 遭赠 载澡燥 陨 辕 杂责藻 陨曰
酝院 栽则葬灶泽圆运栽酝孕造怎泽 陨陨 阅晕粤 皂葬则噪藻则曰 员 耀 猿院 则藻糟燥皂遭蚤灶葬贼蚤燥灶 责造葬泽皂蚤凿 凿蚤早藻泽贼藻凿 遭赠 载澡燥 陨 辕 杂责藻 陨
员郾 源摇 表达载体构建
采用 砸栽鄄孕悦砸 技 术 利 用 引 物 粤贼酝再月员圆云员 辕
粤贼酝再月员圆砸员 从拟南芥 悦燥造鄄园 中扩增出 粤贼酝再月员圆 基因袁
将其克隆进 孕悦砸产物克隆载体并经测序验证与 悦燥造鄄园
基因组序列对比无任何突变袁用于后续载体构建基因
粤贼酝再月员圆 的供体遥 以此克隆为模板袁 粤贼酝再月员圆云圆 辕
粤贼酝再月员圆砸圆 引物组合 孕悦砸 扩增后产物经 载澡燥陨 和
耘糟燥砸陨 双酶切袁连接到 责月造怎藻杂糟则蚤责贼 杂运 陨陨 渊 垣 冤鄄载澡燥陨鄄
耘糟燥砸陨鄄糟怎贼载体上袁形成过渡载体 责月杂鄄粤贼酝再月员圆遥 以马
铃薯中薯 源 号 阅晕粤 为模板袁利用 责葬贼葬贼蚤灶孕砸韵云源 辕
责葬贼葬贼蚤灶孕砸韵砸源 组合扩增出马铃薯 孕葬贼葬贼蚤灶 基因启动子
序列并进行 杂责藻 陨和 耘糟燥 砸陨双酶切处理袁并连接入 杂责藻
陨和 耘糟燥 砸陨 双酶切处理的过渡载体 责月杂鄄粤贼酝再月员圆袁生
成新的过渡载体 责月杂鄄责葬贼葬贼蚤灶院院粤贼酝再月员圆袁完成全序列
分析和验证遥 进一步采用双酶切和连接策略袁通过
载澡燥 陨和 杂责藻 陨 双酶切将上述过渡载体中组装完成的
孕葬贼葬贼蚤灶院院粤贼酝再月员圆 片段置换植物表达载体 责载远鄄郧云孕中
载澡燥 陨 耀 杂责藻 陨 区间的片段袁完成载体构建并命名为
责载远鄄责葬贼葬贼蚤灶院院粤贼酝再月员圆渊图 员鄄粤冤袁载体经双酶切验证如
图 员鄄月所示遥 构建好的载体质粒通过电转化转入农杆
菌菌株 粤郧蕴员袁用于马铃薯的遗传转化遥
员郾 缘摇 马铃薯的遗传转化
马铃薯的遗传转化采用马铃薯茎段转基因体系袁
参考 杂贼藻增藻 酝蚤造造葬皂的方法咱员怨暂 遥 选择生长 圆员 耀 圆愿凿健壮
怨员员员
核摇 农摇 学摇 报 圆缘 卷
的马铃薯 阅藻泽蚤则藻藻 无菌苗袁剪取无腋芽茎段 渊长约
园郾 缘糟皂冤曰在 韵阅远园园值为 园郾 愿 的农杆菌悬浮液中浸没侵
染 圆园皂蚤灶 后袁放到干燥灭菌的滤纸上袁吸干表面的菌
液袁转入共培养培养基 酝园 中袁于 员愿益暗处共培养 猿凿曰
共培养茎段全部转到 酝员 培养基后置于人工气候箱
圆员益 依 员益尧员远澡 辕 凿尧光照强度 圆园园园造曾 条件下进行愈伤
组织分化袁员圆凿后选择愈伤发育良好的茎段袁转入 酝圆
分化培养基进行选择性培养袁以后每 员源凿转接 员 次曰约
转接到第 猿 次时愈伤组织开始长出再生芽袁待再生苗
长到约 圆糟皂 高时袁转移到含卡那霉素和头孢霉素
渊悦藻枣冤的生根培养基 酝砸上进行生根筛选曰根系健壮后
移至温室灭菌土中生长遥 待转基因植株生长至 圆员 耀
圆愿凿袁 切 取 园郾 缘 耀 员郾 园糟皂 的 茎 段 直 接 放 在 酝员
渊含 猿滋皂燥造 辕 蕴 茁鄄藻泽贼则葬凿蚤燥造冤愈伤诱导培养基上培养袁员圆凿
后转到酝圆渊含 猿滋皂燥造 辕 蕴 茁鄄藻泽贼则葬凿蚤燥造袁不加 噪葬灶葬皂赠糟蚤灶冤选
择性培养基培养袁每 员源凿更换 员 次培养基袁直到分化出
芽袁待芽长到 圆糟皂 长时袁切下转到生根培养基生根并
进行温室培养遥
图 圆摇 转基因植株中目的基因 粤贼酝再月员圆 的 孕悦砸检测
云蚤早援 圆摇 孕悦砸 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡藻 粤贼酝再月员圆 早藻灶藻 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽
酝院 阅晕粤 皂葬则噪藻则渊姿鄄耘糟燥砸栽员源 陨 凿蚤早藻泽贼冤曰员 耀 员源院转 粤贼酝再月员圆 基因植株曰晕院阴性对照曰 孕院阳性对照渊质粒 责载远鄄责葬贼葬贼蚤灶院院 粤贼酝再月员圆冤
酝院 阅晕粤 皂葬则噪藻则渊姿鄄耘糟燥砸栽员源 陨 凿蚤早藻泽贼冤曰 造葬灶藻员 耀 员源院 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责燥贼葬贼燥 责造葬灶贼泽 憎蚤贼澡 粤贼酝再月员圆曰 晕院 灶藻早贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造曰
孕院 责燥泽蚤贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造 渊责载远鄄责葬贼葬贼蚤灶院 粤贼酝再月员圆冤
员郾 远摇 类黄酮提取和 匀孕蕴悦法测定
将收获的马铃薯切成长尧宽尧高各约 员糟皂 的小块袁
用 冷 冻 干 燥 机 渊 耘再耘蕴粤 云阅哉鄄员员园园袁 栽韵运韵再韵
砸陨运粤运陨粤陨 悦韵援 蕴栽阅冤冷冻干燥后研成粉末遥 以每 皂早
冻干粉末溶于 猿园滋造 苑园豫 甲醇的比例溶解后袁置于鄄
圆园益 猿澡 进行类黄酮提取袁提取液经 员远园园早 离心后用
园郾 源缘滋皂滤膜过滤上清液袁取 圆园滋造 过滤液用于 匀孕蕴悦
分析袁按照 蕴怎燥等咱苑暂设置 匀孕蕴悦条件袁标准品为芦丁和
山奈酚芸香苷 渊分别购自 杂蚤早皂葬 和 耘曾贼则葬泽赠灶贼澡藻泽藻 公
司冤遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 转基因植株阳性检测与标记基因的剔除
利用农杆菌介导转化马铃薯 阅藻泽蚤则藻藻遥 被侵染的
茎段在愈伤组织诱导培养基上生长 苑凿 左右长出白色
致密的愈伤组织袁员圆凿后转入选择性培养基上培养袁愈
伤开始由白色渐变为绿色遥 部分愈伤组织生长 圆愿 耀
猿缘凿后即形成芽点并分化出小芽遥 待小芽长到 圆糟皂 左
右时袁将其切下转到生根培养基上进行培养袁当根长好
后袁取生长状态与非转基因植株无明显差异的再生植
株的顶端茎段袁重新转到选择性生根培养基上筛选确
认遥 共获得转 责载远鄄责葬贼葬贼蚤灶院院粤贼酝再月员圆 基因的再生植株
渊栽园 代冤猿缘 株遥 将 猿缘 株植株叶片提取 阅晕粤袁进行 孕悦砸
检测遥 结果共有 圆愿 株扩增出了长度大约 员员苑愿遭责 的
粤贼酝再月员圆 基因特异性片段袁证明目的基因已成功转入
到马铃薯 阅藻泽蚤则藻藻中渊图 圆冤袁阳性率达到 苑园豫 渊阳性植
株 辕接种茎段为 圆愿 辕 源员冤遥
在 孕悦砸检测阳性的植株中随机选择 栽园 代 圆 个株
系渊编号为 员员苑 和 圆怨冤进行 茁鄄雌二醇诱导袁每株系分化
出约 缘园 株苗进行单独 孕悦砸袁检测抗生素筛选标记 晕孕栽
陨陨基因袁在总共 员园圆 株的 圆 次分化植株中袁未扩增出
晕孕栽 陨陨基因条带的 酝葬则噪藻则鄄枣则藻藻 苗数量为 怨 株遥 表明
经 茁鄄雌二醇诱导后袁转基因株系发生重组的效率达到
了 愿郾 愿豫 左右渊图 猿冤遥 结果说明雌二醇诱导型启动子
的 糟则藻 辕 造燥曾重组系统在马铃薯中得到了很好的应用遥
圆郾 圆摇 转基因马铃薯块茎的类黄酮含量检测
待马铃薯成熟收获后袁参照 蕴怎燥 等咱苑暂利用 匀孕蕴悦
检测 粤贼酝再月员圆 转基因番茄果实中类黄酮的方法袁对部
分转基因和非转基因马铃薯 阅藻泽蚤则藻藻块茎进行了检测遥
结果显示袁转 粤贼酝再月员圆 基因的 阅藻泽蚤则藻藻 薯块中芦丁的
含量从 园郾 园缘员 耀 猿郾 园怨员皂早 辕 早 阅宰不等渊表 圆冤袁而对照中
没有检测到芦丁渊图 源袁表 圆冤遥 保留时间为 猿员郾 园怨缘皂蚤灶
的物质 阅 为山奈酚芸香苷袁含量达到 园郾 园源员 耀
园郾 怨缘员皂早 辕 早 阅宰遥 与转 粤贼酝再月员圆 基因番茄不同的是袁
转 粤贼酝再月员圆 基因马铃薯块茎中有 圆 种新物质 粤 和 月
产生渊图 源冤袁其性质需要进一步的鉴定遥 该结果表明
粤贼酝再月员圆 基因在马铃薯中也能特异性表达并参与马铃
薯中类黄酮合成的调控遥
园圆员员
摇 远 期 利用 悦则藻 辕 造燥曾特异位点重组系统获得无选择标记转 粤贼酝再月员圆 基因的马铃薯
图 猿摇 雌二醇诱导后部分转基因再生植株 孕悦砸检测
云蚤早援 猿摇 孕悦砸 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 责葬则贼 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽 蚤灶凿怎糟藻凿 遭赠 茁鄄藻泽贼则葬凿蚤燥造
粤院 粤贼酝再月员圆 基因的 孕悦砸扩增曰月院晕孕栽陨陨基因的 孕悦砸扩增曰酝院阅蕴 圆园园园 阅晕粤 皂葬则噪藻则曰员 耀 员源院部分雌
二醇诱导后的马铃薯再生苗曰晕院阴性对照渊阅藻泽蚤则藻藻冤曰孕员院 阳性对照渊责载远鄄责葬贼葬贼蚤灶院院粤贼酝再月员圆 质粒冤曰
摇 摇 摇 孕圆院阳性对照渊转 责载远鄄责葬贼葬贼蚤灶院院粤贼酝再月员圆 基因马铃薯冤
粤院孕悦砸 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 粤贼酝再月员圆曰 月院 孕悦砸 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 粤贼酝再月员圆曰 酝院 阅蕴 圆园园园 阅晕粤 皂葬则噪藻则曰 造葬灶藻员
耀 员源院 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责燥贼葬贼燥藻泽 憎蚤贼澡 责载远鄄责葬贼葬贼蚤灶院院 粤贼酝再月员圆 蚤灶凿怎糟藻凿 遭赠 茁鄄藻泽贼则葬凿蚤燥造曰 晕院 灶藻早贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造
渊阅藻泽蚤则藻藻冤曰孕员院责燥泽蚤贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造 渊 责造葬泽皂蚤凿 燥枣 责载远鄄责葬贼葬贼蚤灶院院粤贼酝再月员圆冤曰 孕圆院 责燥泽蚤贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造 渊 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟
责燥贼葬贼燥藻泽 憎蚤贼澡 责载远鄄责葬贼葬贼蚤灶院院粤贼酝再月员圆冤
图 源摇 转基因马铃薯块茎中类黄酮含量检测
云蚤早援 源摇 云造葬增燥灶燥蚤凿泽 糟燥灶贼藻灶贼 葬灶葬造赠泽蚤泽
燥枣 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责燥贼葬贼燥 贼怎遭藻则泽
粤和 月院物质未鉴定曰悦院芦丁曰 阅院山奈酚芸香苷
粤 葬灶凿 月院 糟燥皂责燥怎灶凿泽 葬则藻 灶燥贼 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤藻凿曰
悦院 则怎贼蚤灶曰 阅院 噪葬藻皂责枣藻则燥造 则怎贼蚤灶燥泽蚤凿藻
猿摇 讨论
除了植物中普遍存在的花色苷外袁黄烷酮尧黄酮
醇尧黄酮等其他类黄酮物质在马铃薯块茎尧花尧叶尧种子
中也均被发现袁但是含量极低遥 蕴藻憎蚤泽等运用 匀孕蕴悦 法
对 圆远 种有色马铃薯栽培品种的块茎尧花尧叶中主要酚
类化合物的含量进行了测定咱圆园暂 遥 结果为花中类黄酮
含量最高袁达到 员园园园 耀 猿园园园滋早 辕 早曰其次为叶袁为 缘园园 耀
圆园园滋早 辕 早曰块茎中最低袁为 圆园园 耀 源园园滋早 辕 早袁且块茎肉中
仅有 园 耀 猿园滋早 辕 早遥 块茎中的类黄酮种类主要为黄烷
酮尧柚皮素尧圣草酚尧儿茶酸和表儿茶酸遥 最常见的槲
皮素和山奈酚等黄酮醇在块茎中痕量存在咱圆员暂 遥
表 圆摇 转基因马铃薯中芦丁尧山奈酚芸香苷的含量
栽葬遭造藻 圆摇 悦燥灶贼藻灶贼 燥枣 则怎贼蚤灶 葬灶凿 噪葬藻皂责枣藻则燥造
则怎贼蚤灶燥泽蚤凿藻 蚤灶 责燥贼葬贼燥 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 造蚤灶藻泽
样品编号
泽葬皂责造藻 晕燥援
孕悦砸 检测
孕悦砸 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶
晕孕栽陨陨 粤贼酝再月员圆
芦丁
则怎贼蚤灶
渊皂早 辕 早 阅宰冤
山奈酚芸香苷
噪葬藻皂责枣藻则燥造
则怎贼蚤灶燥泽蚤凿藻
渊皂早 辕 早 阅宰冤
愿缘 垣 垣 园郾 员猿愿 园郾 园怨圆
员员员 垣 垣 园郾 园苑圆 园郾 园苑愿
远猿 垣 垣 园郾 园缘员 园郾 园源远
圆 垣 垣 园郾 远猿怨 园郾 圆愿员
圆猿 垣 垣 园郾 圆缘猿 园郾 园苑远
远怨 垣 垣 圆郾 怨猿猿 园郾 怨猿苑
员猿苑 垣 垣 园郾 园怨猿 园郾 园源员
圆怨 垣 垣 猿郾 园怨员 园郾 怨缘员
圆园 垣 垣 园郾 源苑园 园郾 圆源源
员圆苑 垣 垣 园郾 圆源愿 园郾 园远源
员员苑 垣 垣 园郾 怨园员 园郾 圆愿员
圆猿园 垣 垣 园郾 愿远园 园郾 员员园
员猿圆 垣 垣 园郾 园愿远 园郾 园怨怨
远 原 原 晕阅 晕阅
阅藻泽蚤则藻藻 原 原 晕阅 晕阅
注院 垣 院孕悦砸 检测为阳性曰 原 院孕悦砸 检测为阴性曰晕阅院未检测到含量遥
晕燥贼藻院 垣 院责燥泽蚤贼蚤增藻 遭赠 孕悦砸曰 原 院灶藻早葬贼蚤增藻 遭赠 孕悦砸曰晕阅院 怎灶凿藻贼藻糟贼藻凿援
摇 摇 本研究转 粤贼酝再月员圆 基因的粉皮品种 阅藻泽蚤则藻藻 块茎
渊包括皮和肉冤中芦丁渊槲皮素芸香苷冤含量和山奈酚
芸香苷的含量最高分别达到了 猿郾 园怨员 和 园郾 怨猿苑皂早 辕 早
阅宰袁而相同条件下对照 阅藻泽蚤则藻藻 块茎中未检测到这 圆
种物质遥 这一研究结果与 粤贼酝再月员圆 在拟南芥尧烟草和
番茄中表达导致黄酮醇大量积累基本一致遥 在 蕴怎燥 等
的研究中咱苑暂提到这种变化可能是由于 粤贼酝再月员圆 诱导
黄酮醇合成途径多个酶的表达所致遥 说明通过利用
粤贼酝再月员圆 基因可以调控马铃薯中类黄酮的合成遥
虽然马铃薯和番茄同属于茄科袁但从本研究结果
看袁两者类黄酮代谢的途径可能存在不同之处渊图 源冤遥
员圆员员
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
圆园员员袁圆缘渊远冤院员员员苑 耀 员员圆圆
蕴怎燥等咱苑暂在番茄中的试验表明袁粤贼酝再月员圆 在果实特异
性启动子 耘愿 的驱动下可以达到类黄酮累积至 苑圆皂早 辕 早
阅宰的高积累水平遥 但本研究发现袁在马铃薯中袁芦丁
和山奈酚的含量仅能达到 猿 和 员皂早 辕 早 阅宰 左右的水
平袁显著低于番茄中的累积量遥 推测此差异的存在可
能由两方面因素决定院一方面袁马铃薯 阅藻泽蚤则藻藻 中类黄
醇的背景非常低袁痕量存在曰另一方面袁马铃薯中类黄
酮的代谢途径可能不同遥 本试验 匀孕蕴悦 结果显示袁除
了芦丁和山奈酚芸香苷的含量倍增外袁还有 圆 种未鉴
定的物质 粤和 月渊图 源冤袁推测是类黄酮或其衍生物袁其
峰面积甚至高于芦丁和山奈酚芸香苷袁然而这 圆 种物
质在转 粤贼酝再月员圆 基因番茄中并不存在咱苑暂 袁其性质还需
进一步鉴定遥
在先前的研究中袁宰蚤造皂藻则等利用热诱导的 悦则藻 辕 造燥曾
重组系统袁在马铃薯上获得了约 源郾 苑豫的 皂葬则噪藻则 基因
去除效率咱圆圆暂 袁而本研究利用雌二醇诱导的 悦则藻 辕 造燥曾 重
组系统使马铃薯中 皂葬则噪藻则 基因去除效率达到了
愿郾 愿豫 遥 但不同转基因系间拷贝数不同袁阅晕粤 插入位
点不同等原因也会严重影响到不同转基因系间的去除
效率袁要进一步提高 皂葬则噪藻则基因去除效率还需对整个
体系进行进一步的优化遥
源摇 结论
本研究证实外源 粤贼酝再月员圆 基因能调控马铃薯中
类黄酮生物合成途径袁导致马铃薯块茎中芦丁和山奈
酚芸香苷的积累量大大增加袁分别达到最高 猿郾 园怨员 和
园郾 怨猿苑皂早 辕 早 阅宰袁这有利于进一步培育富含类黄酮的马
铃薯品种遥 利用 茁鄄藻泽贼则葬凿蚤燥造 化学诱导的 悦则藻 辕 造燥曾 系统
成功获得了 皂葬则噪藻则鄄枣则藻藻 再生马铃薯苗袁标记基因的去
除率达到 愿郾 愿豫 遥
参考文献院
咱 员 暂 摇 砸蚤糟藻鄄耘增葬灶泽 悦 粤袁 酝蚤造造藻则 晕 允援 杂贼则怎糟贼怎则藻鄄葬灶贼蚤燥曾蚤凿葬灶贼 葬糟贼蚤增蚤贼赠
则藻造葬贼蚤燥灶泽澡蚤责泽 燥枣 枣造葬增燥灶燥蚤凿泽 葬灶凿 蚤泽燥枣造葬增燥灶燥蚤凿泽咱允暂 援 云造葬增燥灶燥蚤凿泽 蚤灶 匀藻葬贼澡
葬灶凿 阅蚤泽藻葬泽藻袁 员怨怨苑院员怨怨 原 圆员怨
咱 圆 暂 摇 运燥藻泽 砸 耘袁 匝怎葬贼贼则燥糟糟澡蚤燥 云袁 酝燥造 允 晕 酝援 栽澡藻 枣造葬增燥灶燥蚤凿 遭蚤燥泽赠灶贼澡藻贼蚤糟
责葬贼澡憎葬赠 蚤灶 责造葬灶贼泽院 枣怎灶糟贼蚤燥灶 葬灶凿 藻增燥造怎贼蚤燥灶咱允暂 援 月蚤燥耘泽泽葬赠泽袁 员怨怨源袁 员远
渊圆冤院 员圆猿 原 员猿圆
咱 猿 暂 摇 月蚤则贼 阅 云袁 匀藻灶凿则蚤糟澡 杂袁 宰葬灶早 宰援 阅蚤藻贼葬则赠 葬早藻灶贼泽 蚤灶 糟葬灶糟藻则
责则藻增藻灶贼蚤燥灶院 枣造葬增燥灶燥蚤凿泽 葬灶凿 蚤泽燥枣造葬增燥灶燥蚤凿泽 咱 允 暂 援 孕澡葬则皂葬糟燥造燥早赠 驭
贼澡藻则葬责藻怎贼蚤糟泽袁 圆园园员袁 怨园渊圆鄄猿冤院 员缘苑 原 员苑苑
咱 源 暂 摇 匀藻则贼燥早 酝 郧 蕴袁 运则燥皂澡燥怎贼 阅袁 粤则葬增葬灶蚤泽 悦袁 藻贼 葬造援 云造葬增燥灶燥蚤凿 蚤灶贼葬噪藻 葬灶凿
造燥灶早鄄贼藻则皂 则蚤泽噪 燥枣 糟燥则燥灶葬则赠 澡藻葬则贼 凿蚤泽藻葬泽藻 葬灶凿 糟葬灶糟藻则 蚤灶 贼澡藻 泽藻增藻灶
糟燥怎灶贼则蚤藻泽 泽贼怎凿赠咱允暂援 粤则糟澡蚤增藻泽 燥枣 陨灶贼藻则灶葬造 酝藻凿蚤糟蚤灶藻袁 员怨怨缘袁 员缘缘院 猿愿员
原猿愿远
咱 缘 暂 摇 郧藻造藻蚤躁灶泽藻 允 酝袁蕴葬怎灶藻则 蕴 允袁 孕燥造泽 匀 粤 孕袁 藻贼 葬造援 栽藻葬 枣造葬增燥灶燥蚤凿泽 皂葬赠
责则燥贼藻糟贼 葬早葬蚤灶泽贼 葬贼澡藻则燥泽糟造藻则燥泽蚤泽 咱 允暂 援 粤则糟澡蚤增藻泽 燥枣 陨灶贼藻则灶葬造 酝藻凿蚤糟蚤灶藻袁
员怨怨怨袁 员缘怨院 圆员苑园 原 圆员苑源
咱 远 暂摇 酝藻澡则贼藻灶泽 云袁 运则葬灶扎 匀袁 月藻凿灶葬则藻噪 孕袁 宰藻蚤泽泽澡葬葬则 月援 栽澡藻 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽
贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 枣葬糟贼燥则 酝再月员圆 蚤泽 葬 枣造葬增燥灶燥造鄄泽责藻糟蚤枣造糟 则藻早怎造葬贼燥则 燥枣
责澡藻灶赠造责则燥责葬灶燥蚤凿 遭蚤燥泽赠灶贼澡藻泽蚤泽 咱 允暂 援 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 圆园园缘袁 员猿愿院
员园愿猿 原 员园怨远
咱 苑 暂摇 蕴怎燥 允袁 月怎贼藻造造蚤 耘袁 匀蚤造造 蕴袁 藻贼 葬造援 粤贼酝再月员圆 则藻早怎造葬贼藻泽 糟葬枣枣藻燥赠造 择怎蚤灶蚤糟
葬糟蚤凿 葬灶凿 枣造葬增燥灶燥造 泽赠灶贼澡藻泽蚤泽 蚤灶 贼燥皂葬贼燥院 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 蚤灶 枣则怎蚤贼 则藻泽怎造贼泽 蚤灶
增藻则赠 澡蚤早澡 造藻增藻造泽 燥枣 遭燥贼澡 贼赠责藻泽 燥枣 责燥造赠责澡藻灶燥造咱允暂 援 栽澡藻 孕造葬灶贼 允燥怎则灶葬造袁
圆园园愿袁 缘远渊圆冤院猿员远 原 猿圆远摇
咱 愿 暂 摇 悦澡葬则灶早 再 悦袁 蕴蚤 运 栽袁 栽葬蚤 匀 运袁 蕴蚤灶 晕 杂袁 栽怎 允援 粤灶 蚤灶凿怎糟蚤遭造藻
贼则葬灶泽责燥泽燥灶 泽赠泽贼藻皂 贼燥 贼藻则皂蚤灶葬贼藻 贼澡藻 枣怎灶糟贼蚤燥灶 燥枣 葬 泽藻造藻糟贼葬遭造藻 皂葬则噪藻则 蚤灶
贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽咱 允暂 援 酝燥造藻糟怎造葬则 月则藻藻凿蚤灶早袁 圆园园愿袁 圆员 渊猿冤院 猿缘怨 原
猿远愿
咱 怨 暂摇 郧燥造凿泽遭则燥怎早澡 粤 孕袁 蕴葬泽贼则藻造造葬 悦 晕袁 再燥凿藻则 允 陨袁 栽则葬灶泽责燥泽蚤贼蚤燥灶 皂藻凿蚤葬贼藻凿
则藻鄄责燥泽蚤贼蚤燥灶蚤灶早 葬灶凿 泽怎遭泽藻择怎藻灶贼 藻造蚤皂蚤灶葬贼蚤燥灶 燥枣 皂葬则噪藻则 早藻灶藻泽 枣则燥皂
贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 贼燥皂葬贼燥 咱 允暂 援 晕葬贼怎则藻 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 员怨怨猿袁 员员院 员圆愿远 原
员圆怨圆
咱员园暂摇 运燥皂葬则蚤 栽袁 匀蚤藻蚤 再袁 杂葬蚤贼燥 再袁 酝怎则葬蚤 晕袁 运怎皂葬泽澡蚤则燥 栽援 灾藻糟贼燥则泽
糟葬则则赠蚤灶早 贼憎燥 泽藻责葬则葬贼藻 栽鄄阅晕粤泽 枣燥则 糟燥鄄贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 燥枣 澡蚤早澡藻则 责造葬灶贼泽
皂藻凿蚤葬贼藻凿 遭赠 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂 贼怎皂藻枣葬糟蚤藻灶泽 葬灶凿 泽藻早则藻早葬贼蚤燥灶 燥枣
贼则葬灶泽枣燥则皂葬灶贼泽 枣则藻藻 枣则燥皂 泽藻造藻糟贼蚤燥灶 皂葬则噪藻则泽咱 允暂 援 孕造葬灶贼 允燥怎则灶葬造袁 员怨怨远袁
员园渊员冤院 员远缘 原 员苑源
咱员员暂摇 单晓昳袁李摇 蓓袁张举仁援 利用 云蕴孕 辕 枣则贼 重组系统产生无选择标
记的转基因烟草植株咱允暂 援 生物工程学报袁圆园园远袁 圆圆渊缘冤院 苑源源 原
苑缘园
咱员圆暂摇 阅葬造藻 耘 悦袁 韵憎 阅 宰援 郧藻灶藻 贼则葬灶泽枣藻则 憎蚤贼澡 泽怎遭泽藻择怎藻灶贼 则藻皂燥增葬造 燥枣 贼澡藻
泽藻造藻糟贼蚤燥灶 早藻灶藻 枣则燥皂 贼澡藻 澡燥泽贼 早藻灶燥皂藻 咱 允 暂 援 孕则燥糟藻藻凿蚤灶早泽 燥枣 贼澡藻
晕葬贼蚤燥灶葬造 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 杂糟蚤藻灶糟藻 燥枣 贼澡藻 哉杂粤袁 员怨怨员袁 愿愿院 员园缘缘愿 原 员园缘远圆
咱员猿暂摇 砸葬遭遭蚤贼贼泽 栽 匀援 悦澡则燥皂燥泽燥皂葬造 贼则葬灶泽造燥糟葬贼蚤燥灶泽 蚤灶 澡怎皂葬灶 糟葬灶糟藻则 咱 允暂 援
晕葬贼怎则藻袁 猿苑圆院 员源猿 原 员源怨
咱员源暂摇 杂贼藻则灶遭藻则早 晕袁 匀葬皂蚤造贼燥灶 阅援 月葬糟贼藻则蚤燥责澡葬早藻 孕员 泽蚤贼藻泽责藻糟蚤枣蚤糟
则藻糟燥皂遭蚤灶葬贼蚤燥灶 陨援 砸藻糟燥皂遭蚤灶葬贼蚤燥灶 遭藻贼憎藻藻灶 造燥曾孕 泽蚤贼藻泽 咱 允暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣
酝燥造藻糟怎造葬则 月蚤燥造燥早赠袁 员怨愿员袁 员缘园渊源冤院 源远苑 原 源愿远
咱员缘暂摇 在怎燥 允 砸袁 晕蚤怎 匝 宰袁 藻贼 葬造援 悦澡藻皂蚤糟葬造鄄则藻早怎造葬贼藻凿袁 泽蚤贼藻鄄泽责藻糟蚤枣蚤糟 阅晕粤
藻曾糟蚤泽蚤燥灶 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽咱 允暂 援 晕葬贼怎则藻 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 圆园园员袁 员怨院
员缘苑 原 员远员
咱员远暂摇 在澡葬灶早 再 再袁 蕴蚤 匀 载袁 韵怎赠葬灶早 月袁 藻贼 葬造援 悦澡藻皂蚤糟葬造鄄蚤灶凿怎糟藻凿
葬怎贼燥藻曾糟蚤泽蚤燥灶 燥枣 泽藻造藻糟贼葬遭造藻 皂葬则噪藻则泽 蚤灶 藻造蚤贼藻 贼燥皂葬贼燥 责造葬灶贼泽 贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿
憎蚤贼澡 葬 早藻灶藻 糟燥灶枣藻则则蚤灶早 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 贼燥 造藻责蚤凿燥责贼藻则葬灶 蚤灶泽藻糟贼泽 咱 允 暂 援
月蚤燥贼藻糟澡灶燥造 蕴藻贼贼藻则泽袁 圆园园远袁 圆愿院 员圆源苑 原 员圆缘猿
咱员苑暂摇 杨先泉袁王 翠袁赵 勤袁刘勇强援 远园 悦燥 酌 射线辐照马铃薯适宜剂量
与效应研究咱允暂 援 核农学报袁圆园员园袁圆源 渊缘冤院 怨员苑 原 怨圆员
咱员愿暂摇 允燥灶藻泽 粤 杂袁 宰葬造噪藻则 砸 栽援 陨泽燥造葬贼蚤燥灶 葬灶凿 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡藻
凿藻燥曾赠则蚤遭燥灶怎糟造藻蚤糟 葬糟蚤凿 燥枣 酝赠糟燥责造葬泽 皂葬皂赠糟燥蚤凿藻泽 增葬则援 糟葬责则蚤援 咱 允暂 援
晕葬贼怎则藻袁 员怨远猿袁 员怨愿院 缘愿愿 原 缘愿怨
咱员怨暂摇 杂贼藻增藻 酝蚤造造葬皂援 酝藻贼澡燥凿泽 蚤灶 酝燥造藻糟怎造葬则 月蚤燥造燥早赠袁 增燥造援 猿源源院
粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂 孕则燥贼燥糟燥造泽袁 圆 辕 藻袁 增燥造怎皂藻 圆 咱 酝 暂援 栽燥贼燥憎葬袁 晕允院
匀怎皂葬灶葬 孕则藻泽泽 陨灶糟袁 圆园园远院 圆缘 原 猿缘
咱圆园暂摇 蕴藻憎蚤泽 悦 耘袁 宰葬造噪藻则 允 砸 蕴袁 蕴葬灶糟葬泽贼藻则 允 耘袁 杂怎贼贼燥灶 运 匀援
阅藻贼藻则皂蚤灶葬贼蚤燥灶 燥枣 葬灶贼澡燥糟赠葬灶蚤灶泽袁 枣造葬增燥灶燥蚤凿泽 葬灶凿 责澡藻灶燥造蚤糟 葬糟蚤凿泽 蚤灶
责燥贼葬贼燥藻泽援 陨院 悦燥造燥怎则藻凿 糟怎造贼蚤增葬则泽 燥枣 杂燥造葬灶怎皂 贼怎遭藻则燥泽怎皂 蕴援 咱 允 暂 援
允燥怎则灶葬造 燥枣 贼澡藻 杂糟蚤藻灶糟藻 燥枣 云燥燥凿 葬灶凿 粤早则蚤糟怎造贼怎则藻袁 员怨怨愿袁 苑苑院 源缘 原 缘苑
咱圆员暂摇 宰蚤造皂藻则 悦袁 粤皂藻造蚤藻 郧袁 阅藻灶灶蚤泽 杂袁 藻贼 葬造援 杂藻造枣鄄藻曾糟蚤泽蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 葬灶贼蚤遭蚤燥贼蚤糟
则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 早藻灶藻 灶责贼陨陨 怎泽蚤灶早 葬 澡藻葬贼 蚤灶凿怎糟蚤遭造藻 悦则藻鄄造燥曾孕 泽赠泽贼藻皂 枣则燥皂
贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责燥贼葬贼燥咱允暂 援 孕造葬灶贼 酝燥造藻糟怎造葬则 月蚤燥造燥早赠袁 圆园园远袁 远圆院 苑员 原 愿圆
渊责任编辑摇 王媛媛冤
圆圆员员