全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 9 期
化学修饰法在酶分子改造中的应用
黎春怡1，2 黄卓烈2
(1茂名职业技术学院，茂名 525000;2华南农业大学生命科学学院，广州 510642)
摘 要: 酶的体外不稳定性限制了其工业应用，而化学修饰法通过化学手段在分子水平上对酶进行改造，可有效地改
善酶的性质，为酶的应用提供更广泛的前景。综述酶分子的化学修饰方法及其影响因素，并介绍修饰产物的常用检测评价
方法。
关键词: 化学修饰 酶 分子改造
Application of Chemical Modification in Enzyme Molecules Reform
Li Chunyi1，2 Huang Zhuolie2
(1Maoming Vocational Technical College，Maoming 525000;2College of Life Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642)
Abstract: The industrial applications of enzymes were restricted by their in vitro instabilities． By chemical reform on the molecular
level，chemical modification can improve properties of enzymes so that provide them a cheerful prospect． Chemical modification of en-
zymes and the effect factors，as well as the usual test methods of the products were introduced in this paper．
Key words: Chemical modification Enzyme Molecule reform
收稿日期:2011-04-25
作者简介:黎春怡，女，讲师，研究方向:酶学与酶工程;E-mail:mmlcy_li@ 126． com
通讯作者:黄卓烈，男，教授，博士生导师，研究方向:植物生理与生物化学;E-mail:zhuolieh@ scau． edu． cn
酶作为一种生物催化剂，其高效性与专一性是
其他化学催化剂无法比拟的。但由于其较差的体外
稳定性，极大地限制了酶在各个行业中的应用。因
此，对酶分子进行适当的改造以改善其性能是提高
酶的使用范围和应用价值的关键。酶的化学修饰就
是在分子水平上对酶进行改造，即利用化学手段将
大分子或某些功能基团结合到酶分子上，改变酶的
理化性质，最终达到改变酶的催化性质的目的。
1 酶化学修饰方法
酶的化学修饰包括两个水平上的改变。其一是
改变酶分子的主链结构［1］，这种修饰属于分子生物
学层次，又称理性分子设计，目前主要通过定点突变
和酶法进行;其二是改变酶分子的侧链基团。目前
的化学修饰研究基本上都是针对酶侧链的修饰，主
要包括酶分子表面的非选择性修饰和分子内部特异
位点的选择性修饰。
1． 1 酶分子表面的非选择性修饰
利用大分子或小分子修饰剂对酶分子表面进行
共价修饰从而改变酶的功能和活性，以获得具有临
床和工业应用价值的酶蛋白，是目前应用最广泛的
酶化学修饰技术。
小分子修饰:酶表面的烃基、酚基和琉基等官能
团，可与小分子化合物如氨基葡萄糖、乙酸酐等发生
烷基化、酞化和醚化等反应，从而达到改善酶的分散
性、提高酶活性、使酶产生新的理化性能和新功能等
目的。Distel等［2］用癸酰氯对碱性蛋白酶 Proleather
进行修饰，使其在氯仿中的溶解度高达 44 mg /mL，
修饰酶在不同有机溶剂中活性提高了 4 － 22 倍。用
邻苯二甲酸酐(PA)对辣根过氧化物酶(HRP)的蛋
白链进行修饰使其催化活性提高［3］。
大分子修饰:大分子化合物通常用来对酶蛋白
进行表面修饰，从而降低酶的免疫原性和增加酶的
热稳定性。
聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)被广泛用于
蛋白质化学修饰以降低被修饰蛋白质的抗原性。目
前用于酶表面修饰的 PEG 多为单甲氧基聚乙二醇
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
(mPEG) ，分子量一般在 500 － 20 000。在降低修饰
酶抗原性方面，大分子 mPEG 的修饰剂优于小分子
的［4］，分子量越大效果越好，其中以 mPEG-5 000(n
= 150)修饰效果最好［5］;在保持酶活性方面，小分
子活化 mPEG优于大分子［4］。
多糖由于具有无毒、溶于水和生物适合性等优
点，较多地用于酶的化学共价修饰而提高酶的稳定
性和降低免疫原性。用右旋糖苷修饰的纤溶酶原激
活剂尽管在体内的活性降低了 36%，但其半衰期提
高了 52%［6］，活化右旋糖苷修饰的弹性蛋白酶在常
温下其活性可保持 18 个月不变［7］。用低分子量右
旋糖苷对酵母蔗糖酶进行修饰，修饰后酶活性提高
了 56． 7%，在 pH3． 5 的稳定性上升［8］;壳聚糖［9］和
果胶［10］修饰的蔗糖酶的酶活性提高且在 65℃的半
衰期延长 500 多倍。此外，蔗糖酯、槐糖酯等糖酯化
合物也是有效的酶修饰剂。
1． 2 对酶分子的特异位点进行选择性修饰
在已知酶的结构与功能的基础上，有目的地改
变酶的某一活性基团或氨基酸残基，使酶产生新的
性状，改造酶的底物特异性、催化特性以及热稳定
性，通常通过基因重组和定点突变进行。Shaffer
等［11］通过定点突变使酪氨酸转氨酶的底物特异性
发生变化，对 Asp 的亲和性(kcat /KM)比 Phe 高了 9
倍。然而，应用基因重组和定点突变技术的修饰由
于只能用天然氨基酸进行取代，且研究时间较长，投
入成本较高。
将定点突变和化学修饰进行结合，可以得到一
种全新的化学修饰突变酶。用这种技术得到的化学
修饰突变枯草杆菌蛋白酶，其催化性质、底物特异性
和热稳定性都较天然酶有明显的提高［12］。此外，通
过将甲状腺病毒单克隆抗体 4C5 的丝氨酸转化为
硒基半胱氨酸，得到的 Se-4C5 具有和脱碘酶类似的
效果［13］。
2 影响酶化学修饰的因素
修饰反应过程中，修饰剂的大小、pH、反应温
度、反应时间、酶与修饰剂的比例及有无底物保护等
因素都会影响修饰程度和修饰酶的性质。
2． 1 修饰剂分子量对修饰效果的影响
用 T70 和 T40 右旋糖酐修饰 L-天冬酰胺酶，其
抗原性的降低和酶活性的减少均与修饰剂大小有
关，虽然 T70 修饰酶的修饰程度小于 T40 修饰酶，但
抗原性降低程度却是前者大于后者［14］。辛秀娟
等［15］使用不同分子量的 N，O-羟甲基壳聚糖对天门
冬酰胺酶进行修饰，发现分子量对修饰效果有较大
影响，分子量为 200 000 时，在有效地降低免疫原性
的同时能保持较高的酶活性。该作者认为，修饰剂
修饰了与抗原决定簇相关的氨基，破坏了抗原决定
簇从而使抗原性降低;大分子修饰剂的空间屏蔽作
用，使某些大分子物质(如蛋白水解酶、抗体分子、
体内免疫活性细胞)不易与酶分子相互作用，因而
使修饰酶具有抗蛋白酶水解、半衰期长、抗原抗体反
应性及免疫原性降低等优点。当修饰剂的分子量太
大时，其空间屏蔽作用妨碍了底物进入酶的活性中
心，从而影响了底物和酶的结合，表现为酶活性的
下降。
2． 2 pH对修饰效果的影响
一般情况下，提高 pH可以提高反应速率，降低
pH可以减小反应速率［4］。pH 能改变肽链的二级
结构，通过改变侧链基团的电荷而引起酶分子构象
的变化。由于 pH决定了酶蛋白分子中反应基团的
解离状态，控制不同的反应 pH，也就控制了各功能
基的解离程度，从而有利于修饰的专一性。
2． 3 修饰温度对修饰效果的影响
温度影响修饰反应速率，温度越高，反应速率越
大。此外，温度也影响肽链的构象，严格控制温度可
以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。在低温
下酶蛋白的构象处于较规则的 α-螺旋和 β-折叠结
构中而柔性不足，反应速率太低使修饰程度过低，从
而影响修饰效果;当温度太高时，虽然可以加速修饰
反应，但此时酶分子的二级结构由于各原子或基团
在高温下的热运动而趋于松散，容易出现修饰程度
过高、酶活性部位的疏水基团外露而被修饰失活、酶
蛋白变性等情况，最终导致修饰产物活性损失［8］。
2． 4 底物保护对修饰效果的影响
修饰过程采取底物保护酶活性部位的措施可以
减少酶活性的损失。L-天冬酰胺酶用乙酸酐进行修
饰，底物保护修饰酶的活性是无底物保护酶的 3
倍［16］。对 mPEG修饰的木瓜凝乳蛋白酶(Cp)进行
氨基修饰率和残留酶活性大小的比较，发现底物保
护修饰酶的活性明显高于无底物保护的酶活性，而
04
2011 年第 9 期 黎春怡等:化学修饰法在酶分子改造中的应用
修饰程度要低于无底物保护的修饰酶［17］。其原因
可能是酶和底物特异性结合后，阻碍了修饰剂与酶
活性中心的接近，使酶活性中心附近的自由氨基难
以被修饰，而只修饰与抗原性有关的氨基，从而在降
低或解除抗原性同时，尽可能地保持了酶的天然
活性。
2． 5 修饰剂与酶的用量之比对修饰效果的影响
修饰剂的用量会影响氨基修饰率和修饰酶的性
质，随着修饰剂用量的增大，修饰程度加大，修饰酶
的抗原性越小，残留酶活性也越低，mPEG1-Cp 的活
性随着氨基修饰率的增加而下降［17］。由于水溶性
大分子对酶蛋白的修饰是随机的，尽管在底物保护
下酶的活性中心不被破坏，但这种随机修饰极有可
能修饰到酶活性中心附近或用以维持酶活性天然构
象的有关氨基，使酶天然结构发生了一定程度的改
变，从而导致酶活性下降。其次，酶表面偶联的大分
子修饰剂造成了空间位阻效应，使底物不易与酶活
性位点接近和相互作用而致使酶活性下降，氨基修
饰率越高，空间位阻效应越明显，对酶活性的影响也
越大。
2． 6 反应时间对修饰效果的影响
一般而言，反应时间越长，反应越彻底。但是反
应时间过长也可能使非专一性的副反应增加。因
此，对反应时间进行控制可以减少以至消除一些非
专一性的修饰反应。修饰时间过短，修饰剂与酶未
能充分结合;修饰时间过长，可能导致本来不太稳定
的中间产物分解，同样不利于修饰反应的进行［8］。
3 修饰产物的检测与评价方法
酶的化学修饰效果一般可以通过平均修饰度
(氨基修饰率)、修饰产物均一性、修饰位点和修饰
酶的结构等方面进行评价。由于修饰过程的随机化
和修饰产物的多态性等原因，化学修饰酶的检测与
分析存在较大难度［5，18］。目前用于修饰产物均一
性、平均修饰度和修饰位点的分析方法主要有分光
光度法、电泳、质谱和色谱等;而用于检测修饰产物结
构的方法主要包括 X-射线、核磁共振(NMR)、紫外可
见吸收光谱、紫外差示光谱、荧光发射光谱、傅立叶变
换红外光谱(FT-IR)及圆二色谱(CD)法等。
3． 1 分光光度法
化学修饰酶的平均修饰度(氨基修饰率)常用
分光光度法进行分析，包括三硝基苯磺酸(TNBS)
法［19］和荧胺法［20］。TNBS简单易行，常被用来研究
化学修饰的平均修饰度。但该方法精确度较差，用
PEG作修饰剂时，易受到溶液中未反应的 PEG的影
响。也可以用荧胺代替 TNBS 测定修饰蛋白的平均
修饰度，该方法不受未反应的 PEG 分子的影响，仅
需纳克级的蛋白含量即可完成。但这种方法所用的
PEG衍生物昂贵，不适合于常规分析。
3． 2 电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS Polyacrylamide
gel electrophoresis，SDS-PAGE)可用于分离分析化学
修饰酶的分子量，推测结合到酶分子上的 PEG的分
子数［21］。SDS-PAGE 的不足之处在于修饰后的蛋
白质难于入胶，也难以染色;而且由于大分子修饰剂
的半径较大，大大降低了酶蛋白的迁移速度而达不
到有效分离，所测得的表观分子量与实际分子量不
符合。
毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)则是
近年发展起来的一种既能定性又能定量分析 PEG
修饰蛋白的方法。Cunico 等［22］应用这种方法分析
了不同分子量的 PEG(0． 15 － 10 kD)修饰肌红蛋白
(myoglobin)的过程;Bullock 等［23］研究了 PEG3000-
SOD的修饰度分布，分离出偶联有 1 － 8 个 PEG 的
不同 SOD 蛋白峰，并进行了定量分析，其结果与质
谱分析较接近。
3． 3 质谱
目前质谱法是唯一可以提供分子量信息和确定
分子式的分析法，具有灵敏度高、样品用量少、分析
速度快及分离和鉴定同时进行等优点，已成为肽和
蛋白分析的重要工具，可用于氨基酸序列测定、糖蛋
白鉴定和抗原决定部位指认等［24］，同时也是测定蛋
白质分子量的一种较为理想的方法。但质谱法不适
于作常规分析。
3． 4 波谱分析法
对酶化学修饰的产物的结构检测普遍采用紫外
吸收光谱、紫外差示光谱、荧光发射光谱和红外光
谱等。
当构象改变，蛋白质分子的微环境也随之改变，
引起生色基团的紫外吸收光谱的变化。由于覆盖于
木瓜凝乳蛋白酶表面的 mPEG 的存在，修饰酶的紫
14
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
外吸收光谱在 279． 2 nm处的吸收峰消失，而 mPEG
的屏蔽作用则使 230 － 235 nm处的吸收峰值明显下
降［4］。蛋白质分子构象变化前后的光谱之间的差
异组成的光谱曲线称为紫外差示光谱(differential
spectrum)。根据差光谱的光谱参数，可以推断这些
生色团在大分子中是隐藏的、半暴露的还是暴露的。
只要测出生色基团紫外吸收光谱的变化，就可以了
解其微环境的变化，从而可以推断蛋白质分子的构
象变化［8，25］。
圆二色(CD)光谱是研究稀溶液中蛋白质构象
的一种快速、简单、较准确的方法。在蛋白质或多肽
的规则二级结构中，肽键是高度有规律排列的，不同
二级结构的蛋白质或多肽所产生 CD 谱带的位置、
吸收的强弱都不相同。Greenfield 最早用 CD 光谱
数据估计了蛋白质的构象，此后不断有相关研究报
道。袁向华［26］通过 CD 谱特性对 NBS 修饰前后的
牛血清白蛋白和人血清白蛋白二级结构和高级构象
进行了比较分析。沈琼等［27］运用 CD 研究了 α 葡
萄糖苷酶与化合物的相互作用，初步提出酶被抑制
的机理。Stephanou 等［28］通过远紫外-CD 谱研究同
源二聚体蛋白 OCr 在修饰前后的二级结构变化
情况。
荧光光谱法通过测定蛋白质分子的自身荧光或
蛋白质的特殊部位引入的外源荧光来研究溶液中蛋
白质酶分子的构象变化、Trp和 Tyr的微环境以及蛋
白质的变性等，能提供激发光谱、发射光谱、斯托克
斯位移、荧光强度及量子产率等参数，从各个角度反
映分子的发光特征。通过对这些参数的分析，不但
可以进行一般定量测定，而且还可以推断分子在各
种环境中的构象变化［8，25］，从而了解大分子的结构
与功能的关系。
红外光谱(IR)是定性鉴定化合物及其结构的
重要方法之一，可用于多肽和蛋白质结构分析。FT-
IR可以分析蛋白质热变性、溶剂变性、化学变性、化
学修饰、配基结合和个别氨基酸残基的替换所引起
的微小构象变化，成为揭示溶液构象变化的又一重
要工具。
4 结语
近年来，越来越多的科研工作者致力于酶化学
修饰的研究，使之成为前沿研究的一个热点。随着
研究的不断深入，许多酶的结构与作用机理逐渐被
揭示，在理论及实用上均具有重要意义。大量的研
究结果表明，只要选择合适的修饰剂，利用化学修饰
法可快速、廉价地提高酶的稳定性，甚至合成出新功
能的酶，酶的化学修饰具有诱人的发展前景。
参 考 文 献
［1］Davis B． Chemical modification of biocatalysts ． Current Option in Bi-
otechnology，2003，14:379-386．
［2］Distel K，Zhu GY，Wang P． Biocatalysis using an organic-soluble en-
zyme for the preparation of poly(lactic acid)in organic solvents．
Bioresource Technol，2005，96:617-623．
［3］宋海燕，尹友谊．邻苯二甲酸酐化学修饰对辣根过氧化物酶催化
活性的影响．分子催化，2009，23(5) :465-469．
［4］舒薇，郭勇，贺丽苹，等．木瓜凝乳蛋白酶的单链单甲氧基聚乙二
醇修饰产物的检测与分析． 华南农业大学学报，2005，26(3) :
64-68．
［5］李伟军，林炳承，苏志国．聚乙二醇共价修饰药用蛋白质的分析
方法．分析化学，2001，29(2) :228-231．
［6］吴本传，刘红，陈昭烈，等．化学修饰对组织型纤溶酶原激活剂的
纤溶活性和体内半衰期的影响． 药物生物技术，2003，10(6) :
368-371．
［7］杨漩，孙建和，罗时蕾．修饰的弹性酶在保健食品中的应用．贵州
师范大学学报:自然科学版，2003，21(3) :113-114．
［8］伍志权，黎春怡，麦小珊，等．右旋糖苷修饰酵母蔗糖酶条件的筛
选及修饰酶性质的研究． 华南农业大学学报，2009，30(4) :
48-52．
［9］ Gomez L，Ramirez HL，Villalonga R． Stabilization of invertase by
modification of sugar chains with chitosan． Biotechnology Letters，
2000b，22:347-350．
［10］Gomez L，Villalonga R． Functional stabilization of invertase by co-
valent modification with pectin． Biotechnology Letters，2000，22:
1191-1195．
［11］Shaffer W，Luong T，Rothman C，et al． Quantitative chimeric analy-
sis of six specificity determinants that differentiate Escherichia coli
aspartate from tyrosine aminotransferase． Protein Sciences，2002，11
(12) :2848-2859．
［12］Khumtaveeporn K，Ullmann A，Matsumoto K，et al． Expanding the
utility of protease in synthesis:broadening the substrate acceptance
in non-coded amide bond formation using chemically modified mu-
tant of subtilisin． Tetrahedron Asymm，2001，12:249-261．
［13］Lian G，Ding L，Chen M，et al． A selenium-containing catalytic anti-
body with type I deiodinase activity． Biochem Biophys Res Com-
mun，2001，283:1007-1012．
［14］罗贵民．酶工程［M］．北京:化学工业出版社，2003:156，184．
［15］辛秀娟，魏东芝，董常松，等．壳聚糖修饰 L-天门冬酰胺酶对酶
24
2011 年第 9 期 黎春怡等:化学修饰法在酶分子改造中的应用
活及抗原的影响．华东理工大学学报，2002，28(4) :380-382．
［16］曹淑桂，田洁，赵秋宇，等．几种因素在 L-天冬酰胺酶化学修饰
中对酶活性及抗原性的影响． 药学学报，1990，25(10) :
732-738．
［17］舒薇，贺丽苹，崔堂兵，等．聚乙二醇修饰对木瓜凝乳蛋白酶酶
学及药物生物学性质的影响． 华南农业大学学报，2006，27
(1) :65-68．
［18］姜忠义，高蓉．药物蛋白的聚乙二醇修饰．中国药学杂志，2002，
37(6) :410-412．
［19］Habeeb AF． Determination of free aminogroups in proteins by trini-
trobenzene sulfonic acid． Anal Biochem，1966，14:328-336．
［20］Stocks SJ，Jones AJ，Ramey CW，et al． A fluorometric assay of the
degree of modification of protein primary amines with polyethylene
glycol． Anal Biochem，1986，154(1) :232-234．
［21］田国贺，郭佳亦，吕团伟，等．聚乙二醇对菠萝蛋白酶的化学修
饰．生物技术，2002，21:35-38．
［22］Cunico RL，Gruhn V，Kresin L，et al． Characterization of polyethy-
lene glycol modified proteins using charge-reversed capillary elec-
trophoresis． J Chromatogr，1991，559(1-2) :467-477．
［23］Bullock J，Chowdhury S，Severdia A，et al． Comparison of results of
various methods used to determine the extent of modification of me-
thoxy polyethylene glycol 5000-modified bovine cupri-zinc superox-
ide dismutase． Anal Biochem，1997，254(2) :254-262．
［24］罗国安，王义明，朱瑛，等．质谱在肽和蛋白分析中的应用．药学
学报，2000，35(4) :316-320．
［25］宋翼行，黎春怡，黄卓烈，等．甲醇对胰蛋白酶催化活性影响的
机理研究．生命科学研究，2010，14(4) :311-315．
［26］袁向华．重金属 Hg 对 NBS 修饰前后血清蛋白圆二色谱的影
响．西华师范大学学报:自然科学版，2005，26(3) :298-301．
［27］沈琼，黄滨，邵嘉亮，等． 运用圆二色谱研究酶与化合物相互
作用的机理． 中山大学学报:自然科学版，2006，45(4) :
62-65．
［28］Stephanou AS，Roberts GA，Cooper LP，et al． Dissection of the DNA
mimicry of the bacteriophage T7 ocr protein using chemical modifi-
cation． J Mol Biol，2009，391:565-576．
(责任编辑 狄艳红
櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧
)
(上接第 38 页)
［60］Kano S，Kurita T，Kanematsu S． Agrobacterium tumefaciens-media-
ted transformation of the violet root-rot fungus，Helicobasidium mom-
pa，and the effect of activated carbon． Mycoscience，2009，52(1) :
24-30．
［61］Nyilasi I，Papp T，Csernetics A，et al． Agrobacterium tumefaciens
mediated transformation of the zygomycete fungus Agrobacterium tu-
mefaciens-Backusella lamprospora． J Basic Microbiol，2008，48
(1) :59-64．
［62］Fitzgerald A，Van Kan JA，Plummer KM． Simultaneous silencing of
multiple genes in the apple scab fungus，Venturia inaequalis，by ex-
pression of RNA with chimeric inverted repeats． Fungal Genetics
and Biology，2004，41(10) :963-971．
(责任编辑 狄艳红)
34