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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 6 期
香蕉凝集素 BanLec基因转化毕赤酵母及转化子的鉴定
陈石1，2 李春雨2 郑加协1 周红玲1 颜元培1 方志坚1 易干军2
(1福建省农业科学院闽台园艺研究中心，漳州 363005;2广东省农业科学院果树研究所，广州 510640 )
摘 要: 以 pMD-BanLec质粒为模板扩增 BanLec基因片段，该片段经 EcoR I /Xba I双酶切后定向克隆到同样经 EcoR I /
Xba I双酶切的 pPICZα表达载体上。将连接产物转化感受态 DH5α，用低盐 Zeocin 抗性 LB 固体培养基筛选阳性克隆菌落。
将重组质粒电转化毕赤酵母菌 GS115 后，通过 PCR鉴定目的基因整合入酵母菌的基因组中，将有助于进一步研究 BanLec 蛋
白的表达，为探讨香蕉凝集素的活性及生化功能等奠定基础。
关键词: 香蕉 香蕉凝集素基因 表达载体 毕赤酵母
BanLec Transformed into Pichia pastorisand and
Identification of the Transformants
Chen Shi1，2 Li Chunyu2 Zhang Jiaxie1 Zhou Hongling1 Yan Yuanpei1 Fang Zhijian1 Yi Ganjun2
(1Fujian-Taiwan Horticure Research Center，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Zhangzhou 363005;
2 Institution of Fruit Tree Research，Guangdong Academy of Agricldtural Sciences，Guangzhou 510640)
Abstract: BanLec fragment was amplified by PCR from pMD-BanLec vector，then the product was digested by EcoR I /Xba I to
obtain BanLec fragment;the fragment was cloned in pPICZα to form pPICZα-BanLec recombinant expression vector. After E. coli
DH5α was transformated by pPICZα-BanLec vector，positive cloning strains were selected by low salt LB medium with Zeocin and iden-
tificated by restriction analysis by EcoR I /Xba I. The PCR result showed that recombinant plasmid pPICZα-BanLec was transformed in-
to GSl15 by electroporation. The results laid a foundation for further study on the protein expression of BanLec and were helpful for in-
vestigating the activities or other physiological functions of BanLec.
Key words: Banana BanLec gene Expression vector Pichia pastoris
收稿日期:2010-01-19
基金项目:农业部公益性行业科研专项(nyhyzx07-029) ，农业部“948”项目 (2008-G1) ，国家科技支撑项目(2008BAD92B06) ，福建省科技项目
(2009R10031)
作者简介:陈石，男，研究实习员，硕士，研究方向:果树生物技术;E-mail:chenshi0759@ 163. com
通讯作者:易干军，男，研究员，博士，研究方向:果树生物技术;E-mail:yiganjun@ vip. 163. com
植物凝集素是指能可逆结合特异单糖或寡糖的
蛋白质［1］，自 1888 年 Stillmark首次发现了蓖麻凝集
素以来，人们已经发现了 1 000 多种植物凝集素［2］，
Peumans 等［3］首次从香蕉中分离了凝集素，简称
BanLec。香蕉凝集素是由两个相同的 15 kD亚基构
成的二聚体，可使兔红细胞发生凝集并对甘露糖具
有特异性。BanLec 基因与菠罗蜜凝集素(简称 Ja-
calin)相关凝集素家族的凝集素基因有序列相似
性［4］。大量存在于成熟香蕉果实中的甘露糖特异
的 Jacalin相关凝集素引发了人们对这些活性蛋白
功能的思考。一些半乳糖结合的 Jacalin 相关凝集
素亚家族的成员具有抗病虫特性，但是关于甘露糖
特异的 Jacalin 相关凝集素的功能目前知之甚少，
BanLec是否是抗病虫蛋白尚存疑问。另外，这些凝
集素的天然多糖受体也十分重要，因为只有 3 种甘
露糖特异的 Jacalin相关凝集素被定性，而且进一步
的证据表明虽然具有高度的序列相似性，这些凝集
素却各具特性和不同的生物活性，因此对 BanLec 蛋
白功能的鉴定与分析是很有必要的。
1 材料和方法
1. 1 材料
质粒和酵母菌:pMD-BanLec 质粒由本人构建;
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
pPICZαA表达载体和毕赤酵母菌 GS115 为 Invitro-
gen公司产品。主要试剂:限制性内切酶、Taq DNA
聚合酶、T4 DNA 连接酶、核酸分子量标准均购自
TaKaRa 公司。DNA 片段回收试剂盒，B 型质粒小
量提取试剂盒均购自北京博大泰克生物基因技术有
限公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 引物设计与合成 根据 pMD-BanLec 克隆
载体上的 BanLec基因和 pPICZα载体的多克隆位点
的情况，设计合成 5′端上游引物 P1:5′-GCAGAAT-
TCTATGAACGGAGCGATC-3′，下划线为含有 EcoR I
酶切位点，3′端下游引物 P2:5′-TGTTCTAGATATG-
GCTCCAAGTAG-3′，下划线为含有 Xba I 酶切位点。
根据 pPICZα载体设计酵母转化子检测引物，5′端上
游引物 P3:5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′，3′
端下游引物 P4:5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-
3′。引物合成由上海英骏生物技术有限公司完成。
1. 2. 2 目的基因 BanLec 的制备和鉴定 以 pMD-
BanLec质粒为模板，在引物 P1 /P2 引导下通过 PCR
扩增获得 BanLec 基因片段，经 EcoR I /Xba I 双酶
切，琼脂糖电泳鉴定后，用 DNA 片段回收试剂盒回
收，获得具有黏性末端的 BanLec基因片段。
1. 2. 3 pPICZα-BanLec 重组表达载体的构建 1)
EcoR I /Xba I双酶切 pPICZα载体，回收获得具有黏
性末端的 pPICZα基因片段。2)连接线性化的 Ban-
Lec和 pPICZα，用 CaCl2转化法将连接产物转化感受
态 DH5α，用低盐 Zeocin抗性 LB固体培养基筛选阳
性克隆菌落。
1. 2. 4 pPICZα-BanLec 重组表达载体的酶切鉴定
从 5 个阳性克隆菌中，提取 2 个阳性克隆的质粒
DNA，进行酶切分析，用 1. 2% 琼脂糖凝胶电泳
鉴定。
1. 2. 5 酵母菌转化和筛选鉴定 制备酵母菌
GS115 感受态，将 100 μL GS115 感受态和 5 － 10
μg 经 Sac I线性化的重组表达质粒 pPICZα-BanLec
转入 0. 2 cm电转杯，通过电转化(电压 1. 5 kV;电
容 25 μF;电阻 200 Ω;电激时间为 4 － 10 msec)将
其导入感受态 GS115 酵母菌中。取转化菌涂布于
含有 120 mg /L Zeocin 的 YPDS 平板上，于 30℃温
箱中培养 2 － 3 d。挑取单个菌落接种于 5 mL YPD
液体培养基中，于 30℃培养 20 － 24 h。离心收集
菌体，提取酵母菌基因组 DNA，并以此为模板，通
过 PCR鉴定目的基因是否整合入酵母菌的基因
组中。
2 结果与分析
2. 1 PCR扩增产物 BanLec片段的鉴定
以 pMD-BanLec质粒为模板，在 P1 /P2 引导下，
PCR扩增获得大小约 420 bp的基因片段，与预期结
果相符(图 1) ，将其产物进行测序，结果进一步表明
扩增到的片段为 BanLec基因。
1. BanLec基因的 PCR产物;M. 200 bp marker
图 1 PCR扩增产物 BanLec的鉴定
2. 2 BanLec基因回收产物和 pPICZα质粒的酶切
对 BanLec基因回收产物和 pPICZα质粒分别用
EcoR I /Xba I 双酶切后，分别获得大小约为 420 bp
和 3. 6 kb 的 DNA 片段，与预期产物大小相符(图
2)。
1. pPICZαA质粒酶切产物;2. BanLec基因酶切产物;
M. 200 bp marker
图 2 EcoR I /Xba I双酶切产物的鉴定
2. 3 pPICZα-BanLec重组表达载体的鉴定
pPICZα-BanLec重组表达载体用 EcoR I /Xba I
双酶切后，在琼脂糖凝胶电泳中出现两条大小约为
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2010 年第 6 期 陈石等:香蕉凝集素 BanLec基因转化毕赤酵母及转化子的鉴定
3. 6 kb和 420 bp的 DNA片段，与预期结果相符(图
3)。
1，2. pPICZα-BanLec重组质粒的 EcoR I
和 Xba I双酶切; M. 200 bp marker
图 3 pPICZα-BanLec重组质粒的酶切鉴定
2. 4 酵母阳性重组子 PCR鉴定
分别以 P1 和 P4;Pl 和 P2 为引物，以筛选出的
酵母重组子 DNA 为模板进行 PCR 鉴定，预期目的
片段大小分别约为 600 bp和 420 bp (图 4 )。电泳
检测结果发现 PCR 扩增出的片段与预期片段大小
相符，这证明目的片段已经整合到酵母基因组中。
1，2. P1和 P4引物扩增酵母重组子;3. P1和 P4引物
扩增 pPICZα-BanLec;4，5.分别用 P1和 P4及 P1和 P2
引物扩增酵母 DNA;6，7. P1和 P2 引物扩增酵母重组子;
8. P1和 P2引物扩增 pPICZα-BanLec;M. 200 bp marker
图 4 毕赤酵母转化子的 PCR鉴定
3 讨论
具有结合几丁质能力的凝集素能够抑制真菌孢
子萌发及菌丝生长，具有强烈的抗真菌能力［5］，但
香蕉凝集素的理化性质和结构功能，目前还很少研
究。将香蕉枯萎病菌接种香蕉果实表明，果实具有
很强的抗菌能力，镰刀菌并不能在果实里繁殖，但香
蕉果实中是哪种物质能抑制香蕉枯萎病菌目前还不
清楚。金志强等［6］研究了 BanLec 基因的表达同时
具有发育特异性和组织特异性，即仅在果实中表达，
其他发育阶段和器官不合成这种蛋白质，而且其表
达量随果实成熟度的变化而变化，因此推断它可能
与香蕉果实发育阶段的防御性有关。陈石等［7］克
隆了香蕉果实凝集素基因，并对其进行了原核表达。
原核表达是能够在较短时间内获得基因表达产物，
且所需的成本相对较低，但原核表达还存在许多难
以克服的缺点，如目的蛋白常以包涵体形式表达，致
使产物纯化困难;原核表达系统翻译后加工修饰体
系不完善，表达产物的生物活性较低等。而真核系
统具有翻译后的加工修饰体系，表达的外源蛋白更
接近于天然蛋白质［8］。因此，利用真核表达系统来
表达目的蛋白越来越受到重视。笔者将 BanLec 基
因转化至毕赤酵母，将有助于进一步研究 BanLec 蛋
白的表达，揭示香蕉凝集素在植物防御及其它理化
性质和结构功能，并为植物抗病、虫基因工程提供有
用的素材。
参 考 文 献
［1］Lis H，Sharon N. Lectins as molecules and tools. Annu Rev Bio-
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［2］舒晓燕，阮期平，侯大斌.植物凝集素的研究进展.现代中药研究
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［5］王志斌，李学勇，郭三堆.植物凝集素与抗虫基因工程.生物技
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