全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 1期
人可溶性晚期糖基化终产物受体的酵母
表达及其生物活性分析
张波1 张璟 1 张庆友 1 莫桂玲1 苏志坚2 杨鹏辉 1 徐单单 1 郑青 1
( 1暨南大学药学院,广州 510632; 2暨南大学生命与健康工程研究院,广州 510632)
摘 要: 将人可溶性晚期糖基化终产物受体 ( human solub le Receptor for advanced g lyca tion end product, hsRAGE) cDNA
插入巴斯德毕赤酵母组成型表达载体 pGAPZA,构建重组表达载体 pGAPZA-hsRAGE,并转化到毕赤酵母 X-33中,利用含抗
生素 Zeocin的 YPD平板筛选重组子。重组菌株在甘油醛-3-磷酸脱氢酶 ( GAP)启动子的调控作用下 ,进行组成型分泌表达,
在发酵液中获得了相对分子质量约 45 kD的重组蛋白。摇瓶发酵结果表明,在发酵温度 30 、pH 6. 0、发酵时间 72 h时重组蛋
白表达占发酵上清液总蛋白 68. 4%。W estern b lotting显示,重组蛋白能够被相应抗体所识别。纯化后的重组 hsRAGE具有与
AGE s相互结合的活性, 并能够显著地抑制 AGEs诱导的人血管内皮细胞系 ECV-304细胞 NF-B信号通路中 NF-B /p65基因
的表达。
关键词: hsRAGE 毕赤酵母 组成型表达 纯化 信号通路 生物活性
Expression of hsRAGE in Pichia pastoris and Analysis of Its Bioactivity
Zhang Bo
1 Zhang Jing1 Zhang Q ingyou1 Mo Gu iling1 Su Zhijian2
Yang P enghu i
1 Xu Dandan1 ZhengQ ing1
(
1
College of Pharmacy, J inan University, Guangzhou 510632;
2
Institutes of Life and H ealth Eng ineering, J inan University, Guangzhou 510632)
Abstrac:t The hsRAGE cDNA was inserted into P ichia pas tor is constitutive express ion vector, pGAPZA. Then the recomb inant
expression vector, pGAPZA-hsRAGE, w as transfo rmed into the P ichia pastor is X33. Positive co lon ies w ere selected by YPD culture
p la te conta in ing Zeocin. Under the contro l o f the prom ote rGAP ( g lycera ldehydes 3 pho sphate dehydrogenase) , hsRAGE w as expressed
constitutive ly. Them o lecular we ight o f expression product is about 45 kD. The result o f shaking flask fe rm enta tion show ed that the ex-
pression o f recomb inant prote in accout for 68. 4% in the supernatant a t the optima l ferm enta tion conditions( m ed ium pH 6. 0, tem pera-
tu re 30 , cultivation tim e 72 h) . W esternblotting analysis showed the expression product cou ld be specifically immunoprecipitated by
m ouse m onoc lonal antibod ies aga inst hum an sRAGE. A fter pur ified, the recom binant prote in displays the activ ity of binding w ith the
AGE s and can s ignificantly inh ibit the over expression of NF-B p65 of ECV-304 ce lls induced byAGEs.
Key words: hsRAGE P ich ia pastoris Constitutive expression Pur ification Signa l passw ay B ioactiv ity
收稿日期: 2010-09-10
基金项目:暨南大学 211项目
作者简介:张波,女,硕士研究生,研究方向:蛋白质药物学; E-m ai:l zhangbo19850216@ 163. com
通讯作者:郑青,教授,硕导,研究方向:生物制药方向; E-m a i:l tzhengq@ jnu. edu. cn
晚期糖基化终产物 ( advanced g lycation end prod-
ucts, AGE s)这一概念由美国的 V lassara等 [ 1, 2]于 1984
年首先提出, 现已发现 AGEs可与多种细胞表面受
体和其他 AGE s结合蛋白结合 [ 3] , 进而引发各种病
理反应。RAGE是 AGE s结合受体中的一种, AGE-
RAGE过度结合可激活系列反应。RAGE由细胞外
段、跨膜段和细胞内段 3个部分构成。RAGE胞外
段也称为可溶性晚期糖基化终产物受体 ( sRAGE ),
可以与 AGE s特异性结合, 但是由于其不含胞内段
和跨膜段,所以不具备细胞信号传导的功能,可以作
为 RAGE拮抗剂阻断 AGE-RAGE的相互作用,具有
重要的研究价值和广泛的临床应用前景。 hsRAGE
为糖蛋白,在其 N端附近有两个糖基化位点, 糖基
化对于 hsRAGE稳定与结合 AGEs具有重要作用。
2011年第 1期 张波等:人可溶性晚期糖基化终产物受体的酵母表达及其生物活性分析
巴斯德毕赤酵母作为一种简单的单细胞真核生
物 [ 4] ,与大肠杆菌相比, 对表达的蛋白质进行正确
加工、修饰, 并进行合理的空间折叠, 从而有效克服
大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足,有
利于真核基因的表达。并且,表达的蛋白可在分泌
信号作用下将蛋白分泌到胞外,构成可溶性表达,有
利于外源蛋白的分离和纯化。本研究旨在通过构建
hsRAGE毕赤酵母中表达载体, 进行 hsRAGE的表
达与纯化及其发酵条件的优化研究, 并初步验证其
生物学活性。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 质粒,菌株和试剂 含 pET3c /hsRAGE重组
质粒的大肠杆菌及大肠杆菌 DH5均为暨南大学医
药生物技术开发中心实验室保存,毕赤酵母 X33,表
达载体 pGAPZA为广州中医药大学惠赠, ECV-304
细胞购于中山医科大学细胞中心。羊抗兔 IgG-HRP,
羊抗鼠 IgG-HRP购自广州威佳生物技术有限公司,
hsRAG抗体购自北京爱迪博生物技术有限公司,
NF-bp65抗体购自 Cell Signaling Techno logy公司。
限制性核酸内切酶, Taq DNA聚合酶, Pyrobest DNA
聚合酶, T4DNA连接酶, 质粒 DNA提取纯化试剂
盒, DNA凝胶回收试剂盒均购自宝生物工程 (大连 )
有限公司。
1. 1. 2 培养基 LB培养基: 酵母抽提物 5 g /L,胰
蛋白胨 10 g /L, NaC l10 g /L。LB固体培养基再加入
10 g /L琼脂粉。YPD培养基: 10 g /L酵母抽提物,
20 g /L胰蛋白胨, 20 g /L葡萄糖。YPD固体培养基
再加入 20 g /L琼脂粉。
1. 2 方法
1. 2. 1 hsRAGE基因的克隆,重组质粒的构建及转化
将本实验室已构建的含模板质粒 pET3c /hsRAGE
的大肠杆菌抽提质粒 DNA作为 hsRAGE的模板。使
用 DNAStar软件设计合成引物。hsRAGE的上游引物
(下划线为 Xho 酶切位 ): 5-CCGCTCGAGAAAA-
GAGAGGCTGAAGCTGCTCAAAACATTACTGCTAG-3,
hsRAGE的下游引物 (下划线为 Xba l酶切位点 ): 5-
CTAGTCTAGATTAATGATGATGATGATGATGACCAG
CCAAAGTACCC-3。
PCR扩增 pET3c /hsRAGE质粒上 hsRAGE蛋白全
基因序列将 PCR产物 sRAGE及表达载体 pGAPZA
用 Xho和 Xba l双酶切回收之后连接。将连接反
应混合物转化大肠杆菌株 DH5, 挑取单克隆于 5
mL LB( Amp+ )培养液中培养过夜, 用质粒小量提
取试剂盒进行制备 hsRAGE /pET-3c重组质粒, 用
PCR和 Xho I/ Xba l I双酶切鉴定。挑选阳性的菌
体送广州英骏生物技术公司进行序列测定。选用
测序正确重组质粒 pGAPZA /hsRAGE, 用Avr II酶
切 pGAPZA /hsRAGE质粒, 得到线性化重组质粒。
用电击转化法将线性化重组质粒转化到酵母菌, 挑
取单克隆于 5 mL( Zeocin抗性 ) YPD培养液中过夜
培养。用 PCR进行阳性筛选鉴定。
1. 2. 2 融合蛋白的表达鉴定 将 PCR呈阳性的转
化子,分别接种到 5mL YPD培养基中 30 振荡培
养 24 h至 OD600 > 6, 然后按 5% 的比例转接到 10
mL YPD液体培养基中, 于 30 , 250 r /m in培养 24
h,无菌条件下 6 000 r /m in常温离心去掉 YPD培养
基, 加入 5mL YPD培养基继续培养, 每隔 24 h加入
50 L 20%葡萄糖。 72 h后离心取上清液进行 15%
SDS-PAGE电泳检验及 Western blott ing鉴定。
1. 2. 3 重组蛋白表达的摇瓶发酵 参考 Inv itrogen
公司毕赤酵母表达说明书方法并略作修改,取筛选出
的表达株接种于 5mL YPD中 30 摇床 250 r/m in培
养 24 h至 OD> 6后,按 5% 接种于 250mL YPD液体
培养基中,置于 30摇床中, 250 r/m in培养,每隔 24 h
加入葡萄糖至终浓度 2%, 60 h后停止发酵,收集上清。
1. 2. 4 hsRAGE蛋白纯化 将 1. 2. 3离心收集的
发酵上清液于 4 加入固体硫酸铵至饱和, 离心收
集沉淀, 用 PBS缓冲液 ( pH6. 8)重悬, 再用 PBS缓
冲液透析。用 N -iNTA层析柱进行蛋白纯化。纯化
收集的 hsRAGE蛋白用 10K的超滤管超滤浓缩。
1. 2. 5 重组 hsRAGE蛋白的活性测定 通过检测
重组蛋白同 AGE s的结合作用, 对 ECV-304细胞
NF-B /p65表达的抑制作用作为测活指标。 ( 1) 重
组 hsRAGE蛋白同 AGE s的结合作用检测: 按照参
考文献 [ 5 ]的方法, 体外制备 AGE s修饰蛋白,
ELISA方法检测 hsRAGE同 AGEs的体外结合反
应。 ( 2) W estern blott ing检测内皮细胞的 NF-B /
p65的表达情况: 取已经培养好的 EVC304内皮细
胞, 按照文献 [ 6] , 用无血清的 DMEM培养基饥饿
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
24 h后,随机分为阳性对照组、药物组、阴性对照组
和空白对照组。加药作用 6 h后, 取约 107个培养细
胞,加入 200 L冰预冷的胞浆蛋白提取液, 冰浴中
混匀, 冰上放置 10 m in, 加入 10% SDS, 涡旋 30 s。
4 , 12 000 r /m in离心 15 m in, 取上清。BCA法测
蛋白质含量, 兔抗人 NF-B /p65抗体 ( 11 000)
W estern blotting检测 NF-B /p65表达情况。
2 结果
2. 1 hsRAGE基因的克隆
经 PCR扩增, 重组表达质粒 pGAPZA /hsRAGE
扩增出与目的基因大小相符的片段 (图 1), 位置为
960 bp左右。
2. 2 重组子的筛选
对酵母菌体裂解液的 PCR检测表明, 从转化后
的 1、2、3号毕赤酵母 X33菌株裂解液中扩增出 960
bp的片段 (图 2), 说明 pGAPZA /hsRAGE已经插
入到这些毕赤酵母的基因组中。
2. 3 融合蛋白的表达
30 振荡培养 72 h后离心取上清液进行 15%
SDS-PAGE检验。结果如图 3所示, 除了空白对照
外, 1、2、3号转化子在分子量约为 45 kD处可见有
一条明显的蛋白条带出现。
M. DNA M ark er DL2000;
1. pGAPZA /h sRAGE
图 1 hsRAGE的 PCR产物
M. DNA M ark er DL2000; 1-3. 毕赤酵母重
组子; 4.空质粒 pGAPZA
图 2 毕赤酵母的菌落 PCR检测
M.蛋白质分子量标准; 1.空质粒 pGAPZA; 2-4.
重组质粒 pGAPZA /hsRAGE
图 3 重组毕赤酵母的蛋白表达分析
2. 4 表达上清液的W estern b lo tting分析
用 pGAPZA-hsRAGE的表达上清液进行Wes-t
ern b lo tting分析,结果 (图 4)显示,表达产物能与鼠
抗人 hsRAGE单克隆抗体成阳性反应。
2. 5 重组蛋白表达的摇瓶发酵
30 摇瓶发酵 72 h, 发酵上清液 SDS-PAGE结
果如图 5,表达产物占发酵上清液总蛋白的 68. 4%。
2. 6 重组 hsRAGE蛋白的纯化
采用亲和层析和超滤法对目的蛋白进行分离纯
化,分别用含 0. 5 mo l /L NaC,l 30 mmo l /L 咪唑
( pH6. 8、5. 8、4. 8) , 250 mmo l/L咪唑 ( pH6. 8)的 50
mmo l /L磷酸二氢钠缓冲液的洗脱液梯度洗脱, 并收
集洗脱峰。 SDS-PAGE结果表明, 纯品 hsRAGE主
要位于 30 mmo l /L 咪唑 ( pH4. 8 )和 250 mmo l /L
( pH6. 8)咪唑洗脱峰中 (图 6-A )。经超滤处理后,
其纯度达到 90% (图 6-B)。
图 4 hsRAGE的
W estern blotting分析
M.分子量标准; 1.重组
子 pGAPZA /hsRAGE
图 5 摇瓶发酵结果
2. 7 表达产物与 AGE-HSA结合活性的 ELISA检测
如图 7所示, 随着 hsRAGE浓度的增加, AGE-
HSA组 D ( l )值不断增大, 而 HSA组 D ( l )值则无
明显增大,且水平较低, 这说明 hsRAGE融合蛋白与
AGE s能够特异结合。
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2011年第 1期 张波等:人可溶性晚期糖基化终产物受体的酵母表达及其生物活性分析
A:亲和层结果; 1.上清; 2. 30 mmo l/L 咪唑 pH 6. 8; 3. 30
mm ol /L咪唑 pH 5. 8; 4. 30 mm ol /L 咪唑 pH 4. 8; 5. 250
mm ol /L咪唑 pH 6. 8; M .分子量标准; B:超滤法结果; M.
分子量标准; 1. hsRAGE
图 6 hsRAGE蛋白的纯化
图 7 hsRAGE与 AGE-HSA的结合活性曲线
2. 8 表达产物的生物学活性鉴定
Western blotting检测结果如图 8所示, AGE-HSA +
hsRAGE组 NF-Bp65蛋白表达明显低于 AGE-HSA
组,说明表达产物 hsRAGE可以抑制 AGE s引起的
人脐静脉内皮细胞信号蛋白 NF-B /p65表达的上
调,具有较高的生物学活性。
A: 1.对照; 2-4. AGE-H SA ( 12. 5、50、200 mg /L ) ; 5-7.
AGE+ sRAGE ( 12. 5、50、200 m g/L) ; 8-10. HSA ( 12. 5、
50、200 m g/L) ; B:内参
图 8 NF-B /p65的 W estern b lotting分析
3 讨论
目前报道的表达重组 hsRAGE的表达系统有大
肠杆菌表达系统和昆虫细胞表达系统 [ 7, 8]。大肠杆
菌表达系统表达量高,但产物多以包涵体形式存在,
复性困难;并且 hsRAGE在其蛋白的 N端附近有两
个 N偶联的糖基化位点 [ 9] , 对于 hsRAGE稳定与
结合 AGEs具有重要作用, 但大肠杆菌表达系统却
无法对外源蛋白进行翻译后修饰, 因此其表达产物
活性较低。昆虫细胞表达系统的操作及后处理较复
杂, 表达量较低。相比之下, 用酵母表达具有特殊优
势, 特别是毕赤酵母,其表达量大,活性高,可对表达
产物进行糖基化修饰,主要为分泌型可溶性表达,而
自身外分泌蛋白极少,目的蛋白易于纯化。因此,本
研究采用组成型毕赤酵母系统进行 hsRAGE蛋白表
达的研究。
AGEs-hsRAGE的竞争性结合会抑制 AGEs引起
的 NF-B信号蛋白的表达上调,目前关于 hsRAGE的
生物活性检测主要是通过在细胞和分子水平测定
NF-B /p65的表达情况。W estern blotting试验证实,
表达产物 hsRAGE和 AGE-HSA相互作用显著下调了
NF-B /p65的表达量,说明 hsRAGE具有良好的生物
学效应。
参 考 文 献
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(下转第 178页 )
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
示的载体蛋白利用的就是絮凝功能结构域。将白地
霉脂肪酶利用柔性连接序列 G ly-G ly-G ly-Ser与絮凝
功能结构域 FLO的 C端融合,融合蛋白 N端的 FLO
结构域锚定于酵母细胞壁, C端的脂肪酶可以与底
物充分接触完成催化反应。免疫荧光和罗丹明平板
检测结果表明脂肪酶已成功展示于细胞表面并保持
催化活性。
本研究中表面展示脂肪酶的酶活可达 81 U /g
干细胞,与相同发酵条件下表达游离脂肪酶的重组
毕赤酵母相比产量偏低, 但酶的热稳定性较之游离
酶大幅度提高,并且反应结束后可以方便地回收再
利用。如果尝试选用不同的表面展示载体蛋白,探
索载体蛋白和酶之间的连接序列对酶活的影响,优
化表达条件,表面展示酶的活性还可能进一步提高。
参 考 文 献
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(责任编辑 狄艳红 )
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