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技术与方法

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
大豆遗传转化技术在转基因大豆研究中的应用
王振华1  杨德光 1  张辉 2  胡正 2
( 1东北农业大学农学院,哈尔滨 150030; 2中国农业科学院作物科学研究所,北京 100081)
  摘  要:  大豆是公认的难转化的作物, 大豆的遗传转化还没有模式化。利用转基因技术的原理和方法, 对大豆遗传体
系进行优化, 可以实现对大豆产量和品质的改良。综述了应用于大豆遗传转化的研究方法, 浅谈转基因技术的重要性, 对转
基因发展方向进行了展望。现阶段大豆遗传转化的效率依旧偏低,无法形成规模化的转基因体系。因此, 建立高效、快速、稳
定的大豆组织培养再生体系,解决外源基因难导入的难题, 使之广泛应用于大豆生产成为亟待解决的问题。
关键词:  大豆  遗传转化  转化方法  基因  重要性
Research Progress of TransgeneM ethod in
Transgenic Soybean(Glycinemax )
W ang Zhenhua
1  Yang Deguang1  ZhangH ui2  Hu Zheng2
(
1
Co llege of A griculture,N or theastAgricultural University, Harbin 150030;
2
Institute of Crop Sciences, Chinese A cademy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)
  Abstrac:t  The effic iency o f genetic transform a tion o f soybean is still re la tive ly low a t the present stage that can not form large-
scale system of transgen ic. Soybean genetic transfo rm ation has no t been modeled, as soybean is recognized as a kind o f crops that is dif

ficult to be transform ed. Soybean y ie ld and qua lity can be im proved obv iously by optim izing the soybean genetic sy stem. The resea rch
m ethod of soybean gene tic transfo rm ation were summ arized in this paper, the importance of transgen ic techniques w erem entioned, and
the d irection o f transgen ic in future was prospected as w e l.l
Key words:  Soybean Gene tic transfo rm ation T ransgenicm ethod Gene S ignificance
收稿日期: 2010
04
07
作者简介:王振华,女,硕士研究生,研究方向:大豆遗传转化; E
m ai:l w zhua1984@ yahoo. com. cn
通讯作者:杨德光, E
m ai:l ydg@l tom. com
大豆 (G lycinemax L. M err)属于豆科、蝶形花亚
科、大豆属的二倍体 ( 2n = 40)植物, 一种重要的经
济作物,是世界最大的油料作物, 可粮用、油用和饲
用,是植物蛋白的主要来源。近年来逐渐发展成为
受人青睐的保健食品。在国内外市场上占有十分重
要的地位。
由于生态环境遭到破坏,导致大豆病虫害越来
越重, 大豆生产受到制约。因此,提高大豆产量和品
质也成为现阶段的主要任务。传统的大豆生产技术
已经难以满足市场的需求, 需要借助分子生物学的
方法发展转基因大豆,通过转基因技术,将具有优良
农艺性状的基因整合到大豆基因组中, 从而获得性
状优良的转基因大豆。如今,转基因大豆已经成为
商业化种植的农作物,然而, 大豆的遗传转化受到许
多因素的限制, 1984年, 大豆的遗传转化研究首次
被报道 [ 1, 2]。从第一棵转基因大豆的诞生到现在,
大豆的遗传转化效率仍未得到提高。主要是由于大
豆离体组织培养再生难,再生体系尚不完善,致使大
豆遗传转化效率普遍偏低。
1 大豆遗传转化
1. 1 转化方法
在转基因技术中,如何将目的基因高效稳定的
转移到受体中是最为关键的环节。由于植物分生组
织再生植株的能力差,现有的转化体系同植株再生
系统不能有效结合, 因此, 大豆遗传转化效率较低。
随着近年来分子生物学试验技术的发展,转基因大
2010年第 10期 王振华等:大豆遗传转化技术在转基因大豆研究中的应用
豆研究不断深入。目前大豆遗传转化方法主要有农
杆菌介导法 [ 3, 4]、花粉管通道法、子房注射法 [ 5]电击
法 [ 6]、基因枪法 [ 7, 8]、农杆菌介导和基因枪结合转化
法 [ 9]、超声波辅助农杆菌介导法 [ 10, 11 ]等等。目前应
用最为广泛的是农杆菌介导外源基因转化, 其中根
癌农杆菌介导大豆子叶节的遗传转化系统最为常见
且效果最佳 。
1. 1. 1 农杆菌介导法  农杆菌介导法适用于双
子叶植物和一些单子叶植物, 是大豆遗传转化的
首选方法。利用农杆菌介导的转化主要以不定芽
器官发生再生系统为外植体。农杆菌转化的方法
主要有整体植株接种共感染法和叶盘转化法。从
1985年 H orsch等 [ 12]首次使用叶盘转化法获得转
基因植物报道以来, 已有很多利用此方法介导外
源基因进入植物的报道 [ 13, 14 ]。农杆菌介导操作技
术较简单和方法成熟, 耗资少, 可靠性高, 相对转
化率较高, 可以转移大片段外源基因,没有明显的
基因重排现象, 外源基因主要以单拷贝整合到大
豆基因组中, 却受宿主范围和菌株特异性等因素
的制约 [ 15, 16]。
用于植物遗传转化的土壤农杆菌包括根癌农杆
菌 (Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌 (Agrobac

terium rh izogenes)。两者均是寄主非常广泛的革兰氏
阴性菌。前者具有 T i质粒,能引起被感染植物产生
冠缨瘤 ( crown tumour) ;后者具有 R i质粒, 能引起被
感染植物产生发根瘤 ( ha iry root)。这两种质粒的结
构相似,都能把 T
DNA和在其中插入的外源基因转
移并且整合到植物基因组内。因此,它们均可以用作
转化载体。1988年, H inchee等 [ 13]首次通过农杆菌介
导法转化大豆 (M aplePresto、Pek ing、Do lmat)子叶节,
通过遗传检测分析再生植株后代基因以 3 1的比例
分离。Parrot等 [ 17]用含有 npt!和玉米醇溶蛋白基因
的农杆菌转化大豆未成熟子叶获得转基因植株, 但
是, Ro代植株都是嵌合体。Luo等 [ 18]报道了用含有
野生型 T ipT iB0542基因和具有 U id A与 NPT!基因
的根癌农杆菌 A281 pZA
7菌株转化大豆子叶, 被
转化基因在转化大豆瘤中表达。D i等 [ 19]用根癌农
杆菌介导法获得了 BPMV 外壳蛋白基因抗大豆花
叶病的转基因植株。C lemen te等 [ 20]用草甘膦代替
卡那霉素, 筛选效果更为有效。Zhang[ 21]利用农杆
菌介导的子叶节转化系统通过草甘膦进行筛选获得
转基因大豆, 其后代植株能表达 bar基因。徐香玲
等 [ 22, 23]用农杆菌 T i质粒介导分别将 Bt基因和菜豆
几丁质酶基因导入大豆,得到转化植株,经检测证明
外源基因已整合到大豆基因组上。Y an等 [ 24]用农
杆菌转化未成熟合子子叶, 经过体细胞胚再生系统
获得了转基因大豆植株。 Paula等 [ 25]把 T
DNA和
GU S基因导入大豆子叶节细胞,产生可育的 To代转
基因植株; Pau la的研究报告还指出, 硫醇类物质如
DTT, L
cysteine等能够明显提高农杆菌转化中 T

DNA转入大豆子叶节细胞的频率, Southern分析检
测表明大豆后代遗传稳定。 Schm idt[ 26]将 cry 1 AC
转入大豆,得到了转基因植株。卜云萍等 [ 27]报道采
用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将深黄
被孢酶脂肪酸脱氢酶基因导入大豆。赵桂兰等 [ 28]
将 npt!和 Barnase基因导人大豆子叶节中,筛选得
到转基因植株, PCR检测证明 npt!和 Barnase基因
已整合到大豆基因组上。张毅等 [ 29]用根癌农杆菌
转化大豆下胚轴, 将人的

1, 4
半乳糖苷转移酶基
因 ( hGT)导入大豆, 获得了完整的抗性再生植株。
分子杂交证实了外源基因 hGT已稳定地整合到植
物基因组中。党尉等 [ 30]以大豆胚尖为外植体,最高
转化率分别达到 18%, 是现有报道中效率较高的转
化体系。 Pau la等 [ 31]利用发根农杆菌大豆初生节为
外植体,侵染后的再生转基因植株可育并且表型正
常, 在对照试验中, 使用发根农杆菌菌株 SHA17和
根癌农杆菌 AGL1侵染外植体再生频率没有明显不
同, 但转化效率方面有 3. 5倍的提高。 Saini等 [ 32]根
癌农杆菌介导黑绿豆的转化, 转化频率已经稳固的
达到了 4. 31%。GUS基因在叶、根、花粉粒和 T1代
种子中有活性可以检测到,对 T0代植株 Southern杂
交分析表明, nptII基因已经整合到植株的基因
组中。
1. 1. 2 基因枪法  基因枪法称微弹轰击法 ( parti

cle bombardment) ,是依靠一种基因枪来帮助导入
外源基因。基因枪根据动力系统可分为火药引
爆、高压放电和压缩气体驱动三类。火药式是原
始的基因枪类型, 是由美国康奈尔大学 Sanford等
( 1988)设计制造的, 其基本原理是通过动力系统
将带有基因的金属颗粒 (金粒或钨粒 ) , 将 DNA吸
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 10期
附在表面, 以一定的速度射进植物细胞, 由于小颗
粒穿透力强, 故不需除去细胞壁和细胞膜而进入
基因组,从而达到稳定转化的目的。它具有应用
面广、方法简单、转化时间短、转化频率高、试验费
用低等优点。对于农杆菌不能感染的植物, 采用
该方法可打破载体法的局限。基因枪的转化频率
与受体种类、微弹大小、轰激压力、制止盘与金颗
粒的距离、受体预处理、受体轰击后培养有直接
关系。
M cCabe等 [ 33]首次用基因枪转化大豆未成熟胚,
获得的再生植株有 2%的 GUS基因嵌合表达并获得
可育的转基因植株。Santarem等 [ 34]用基因枪法从未
成熟大豆子叶诱导的胚性悬浮培养物有效地产生了
可育的转基因大豆植物。GUS基因试验和 DNA杂
交证实 GUS基因已稳定整合。Maughan等 [ 8]用基因
枪轰击固体培养的胚性细胞团,将牛酪蛋白基因转
入大豆,并获得了可育的转基因植株。S tew art等 [ 7]
用基因枪法将 B t
C ryIAC导入大豆体细胞胚获得转
基因大豆植株。Falco等 [ 35]用基因枪法获得一些游
离赖氨酸增加几百倍的转基因大豆植株及高含量赖
氨酸的种子。苏彦辉等 [ 36]用苏云金芽孢杆菌杀虫
晶体蛋白基因和葡糖苷酸酶基因通过基因枪轰击和
根癌土壤杆菌介导转入大豆,诱导大豆转基因植株
再生。王萍等 [ 37]在研究影响基因枪转化效率时发
现,未成熟子叶被轰击后在高渗培养基中停留的天
数是影响大豆转化率的主要因素之一。 Ponappa
等 [ 38]转化 5个不同载体的 gfP基因, 得到 g fP基因
瞬时表达的愈伤组织和稳定表达的再生植株。Ma

sood等 [ 39]的试验结果揭示转基因大豆无性系含有
多达 10- 15个质粒。
1. 1. 3 超声波辅助农杆菌转化方法  超声波辅助
农杆菌转化方法 ( sonicstion assisted Agrobacterium
mediated transformat ion)是近年发展起来的一种遗传
转化方法。超声波基因转化的基本原理是利用低声
强脉冲超声波的物理作用, 击穿细胞膜, 使外源
DNA进入细胞。在进行农杆菌转化时用超声波处
理外植体组织, 使其产生小的通道 (伤口 ), 有利于
农杆菌进入植物细胞内, 大大提高转化效率。用超
声波处理材料的时间和强度, 不宜过大。 T rick
等 [ 40]用扫描电镜及光学显微镜观察发现,超声波处
理后使外植体表面及近表面产生大量的细小贯穿通
道, 农杆菌易于与植物细胞接触, 从而促进转化过
程。 Santarem等 [ 41]以未成熟子叶为外植体利用超
声波辅助进行农杆菌转化, 获得了 GUS基因的高效
表达。M eurer等 [ 42]超声波辅助农杆菌转化未成熟
子叶和子叶节, 试验结果并没有得到稳定的转化。
至今,有关于超声波辅助农杆菌转化的方法报道
甚少。
1. 1. 4 花粉管通道法  花粉管通道法 ( po llen
tube
pathw ay)是利用花粉管通道导入外源 DNA的技术。
1978年周光宇等 [ 43 ]授粉过程中混入异种作物花
粉, 在后代中存在与异种作物对应性状的变异,推断
异源 DNA可能参与了受精过程。花粉管通道法应
用在棉花、水稻、小麦等作物上, 大豆上的应用也有
相关的试验,但大豆的花器官小且是闭花授粉,因此
这项技术在大豆上的应用难度较大。
H ess
[ 44 ]以花粉为载体, 花粉萌发过程吸收外
源 DNA,诱导矮牵牛和烟草花色和叶形发生变异。
Luo等 [ 45] 1988年首次利用此法将质粒 DNA导入
水稻, 分子杂交检测证实了外源 DNA已整合到了
水稻基因组中。崔岩 [ 46]利用花粉管通道法首次将
几丁质酶基因转入大豆中。谢道听等 [ 47]通过花粉
管途径, 将这两种杀虫基因导入棉花品种中,获得
转基因植株。分子杂交的结果证明杀虫基因已经
整合到棉花的基因组中。曾君祉等 [ 48 ]利用此法将
含有 GU S基因转化普通小麦品种 ∀小山 3号#的小
花,得到 5株转基因小麦植株, 转化率为 4. 7%。
雷勃钧等 [ 49]将蛋白含量高的野生大豆的 DNA导
入栽培品种获得了变异的后代, 培育出高蛋白大
豆新品种。刘德璞等 [ 50]使用此种方法导入高抗花
叶病的外源 DNA获得抗 SMV的大豆转基因植株。
胡张华等 [ 51]将反义 PEP基因转入浙春 3号大豆品
种中, 获得再生植株。徐香玲等 [ 52 ]将几丁质酶基
因转入大豆栽培品种中获得再生植株, 斑点分子
杂交检测后证明了几丁质酶基因已整合到大豆基
因组中。
1. 1. 5 电激法和 PEG电激法  电激法 /PEG电激
法 ( e lectropration /po lyeth lene)是将植物细胞原生质
置于高压脉冲下, 在原生质体膜上 ∀电激穿孔 #, 使
细胞膜的透性增加,形成可逆的瞬间通道,从而促进
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2010年第 10期 王振华等:大豆遗传转化技术在转基因大豆研究中的应用
外源 DNA的进入。李宝健等 [ 53]首次将电激法应用
于植物细胞的基因转化中, 并获得了水稻转基因植
株。南相日等 [ 54]利用 PEG电激法将苏云金芽孢杆
菌杀虫晶体蛋白基因导入大豆原生质体中, 获得 3
株转基因植株,经过分子检测 Bt基因已经整合到大
豆基因组中。Christou等 [ 55 ]用 3个大豆品种研究电
激条件, 得到了抗卡那霉素的愈伤, 并诱导生根。
Jones等 [ 56]以野生大豆材料, 得到了抗卡那霉素植
株。Dh ir[ 57]以 C lark63为材料, 将构建有 GUS和
HPT基因的质粒导入大豆原生质, 获得抗潮霉素的
转基因植株。
1. 1. 6 微注射法  微注射法 ( m icro injection)是用
专门的仪器制作毛细玻璃针 (一般的直径为 0. 5
nm ), 利用显微注射仪将外源基因直接注射到子房
或是胚囊中, 然后转入受精卵, 继而发育成胚和种
子,以此获得转基因植株。在植物中应用可用琼脂
糖多聚赖氨酸固定细胞。该方法的转化率较高,可
达到 14% - 16% ,但由于操作难度大, 实际转化效
率并不高。
刘博林等 [ 58]用微注射法将 A trazine抗性基因
转入大豆叶绿体中, 获得转基因再生植株。岳绍
先 [ 59]将 A trazine抗性基因导入大豆中, 获得转基因
植株。
1. 1. 7 原位转化法  以上所述方法中,无论是基因
枪法、农杆菌介导法以及其它的几种转基因方法,都
必须经过组织培养。但是, 外植体在组织培养过程
中容易发生变异,而且大豆又较难再生,应尽量避免
组织培养或缩短组织培养时间,这在其它植物转化
过程中得到了证实。Chee等 [ 60]用农杆菌感染大豆
发芽种子的腋芽获得转基因植株, 其中有 0. 07%产
生了转化的种子。 Bechto ld等 [ 61]创立了拟南芥浸
花转化法, 将种子在含有 0. 5%蔗糖和 0. 05%表面
活性剂的菌液中浸泡,可获得 0. 5%的转化种子,此
种浸花法目前已被用于大豆。
1. 2 不同转化方法比较
选择适宜的遗传转化方法是提高遗传转化效率
的关键环节之一,不同的遗传转化方法对转化效果
的影响不同,使用时可根据不同基因型,不同受体等
多种因素选择最佳方法。不同转化方法优缺点见
表 1。
表 1 不同转化方法比较
转化方法 优点 缺点
农杆菌介导法 低拷贝,完整整合; 可直
接用于植物组织, 周期
短;操作简便,成不低; 转
化频率高
受基因型限制,具
有组织特异性,对
大豆可再生组织
感染率低
基因抢法 不受宿主限制,转化受体
广泛;操作简便
工作量大, 成本
高;嵌合体多
原位转化法 缩短或避免了组织培养
过程
转化频率低
花粉管通道法 打破种、属间限制; 省略
组织培养过程;
后代异产生变异,
转化频率低
微注射法 转化频率高 操作难度大
超声波辅助
农杆菌介导法
易于农杆菌与细胞结合 不能稳定转化
2 转基因大豆研究中的应用
2. 1 转基因大豆重要性
中国是继美国、巴西、阿根廷之后的世界第四大
豆生产国。作为大豆原产地的中国, 在 1995年, 由
过去的大豆出口国变成了大豆进口国,随着国内人
民生活水平的提高,对油脂和植物蛋白需求的日益
增加,对进口大豆依赖度也逐渐攀升。大量进口大
豆, 严重影响了国内豆农和以国产原料为加工对象
的国内油脂加工企业。目前, ADM、嘉吉、邦基、路
易达孚、金光、正大等跨国公司已经占有我国近
90%的大豆进口量。外资垄断严重挤压内资大豆加
工业的生存和发展,要及时控制这样的局面,避免国
外大豆企业毁掉我国大豆产业, 保证粮食安全。截
止目前, 仅大豆进口量就达到 3 800多万吨, 是国
内产量的 2. 5倍。由于国际油脂油料的大量进
口,国内油料产业话语权渐失, 市场价格受国际大
环境影响波动剧烈, 不利于国民经济的稳定发展。
近年来, 外国转基因大豆如潮水般涌入, 短短几年
便控制了我国市场。国内大豆生产与加工之所以
陷入受制于人的被动境地, 其根本原因并非对国
内非转基因大豆保护不力, 而在于大豆转基因技
术自主研发实力的不足。这一事件发人深省, 再
次提醒我们, 发展转基因作物育种是保障我国粮
食安全的战略选择。
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 10期
2. 2 转基因大豆的应用
通过转基因技术将具有优良性状的外源目的基
因导入栽培大豆中, 可以获得高产、优质、抗病虫害
的新品种。目前转基因大豆的主体是抗除草剂、抗
虫、改良营养品质。转基因大豆已经是全球种植面
积最大的转基因作物, 商业化种植的转基因大豆以
美国孟山都公司推出的抗除草、抗病虫害等品种为
主。20世纪 80年代, 中国科学院遗传所与中国农
业科学院作物所合作, 获得我国最早的转基因抗除
草剂作物抗阿特拉津大豆。 20世纪 90年代, 转基
因大豆的应用得到突飞猛进的发展, 1994年 M on

santo公司抗草甘膦大豆, 1997年 Dupont公司高油
酸大豆, 1998年 A grEvo公司抗草丁膦大豆。雷勃
钧等利用花粉管通道法将外源 DNA导入大豆, 获得
了蛋白质含量高达 45. 32%的优质高蛋白品系 D89

982和蛋白质 +脂肪占 66%的双高品系 D90
1217,
两个新品系经过试验和示范得到推广。黑龙江省农
业科学院利用花粉管通道法将高蛋白野生大豆总
DNA直接导入栽培大豆, 培育出黑生 101大豆新品
种。1999年, M azur等通过试验, 获得了种子油酸
相对含量高达 85% 比原来提高 3. 4倍, 而且农艺
性状优良的大豆新品系, 当前, 这种油酸含量高的
品系已经开始大规模商业化种植。河南周口市农
科所选用玉米总 DNA为供体, 导入受体豫豆 24
号, 经过多年选择成功育成蛋白质含量 39. 8%, 脂
肪含量 22. 56%的中熟夏大豆品种周豆 12号。由
美国北达科他州农业试验站研发的转基因大豆品种
RG7008RR经过 2年的测试证实, 此品种的株高相
对于 RG6008RR减少 5 cm左右,蛋白和油含量并无
差异。巴西培育出含有拟南芥 ahas基因的可以抗
目前广泛使用的咪唑啉酮类除草剂的转基因大豆品
种,该新品种计划于 2012年投入市场。
3 转基因大豆研究中应解决的关键问题及
展望
大豆组织培养再生困难、重复性差、基因型依赖
性强、培养条件复杂, 这在很大程度上限制了利用基
因工程方法对大豆的遗传改良, 因此, 建立一套高
效、简便的大豆再生体系是大豆遗传转化的工作
重心。
转基因大豆能够有效地控制病虫草害、抵御干
旱和盐碱条件。相对于非转基因大豆而言, 转基因
大豆的品质、产量都将有所提高, 可以满足人们对食
物的需求,一方面可以提高土地利用率,另一方面可
以降低大豆产品的生产成本。随着生物技术手段的
不断发展和人们对于消费品需求水平的提高, 转基
因作物开始着眼于作物的品质、营养特性方面。目
前, 在经济和人口的双重压力下, 在全球提倡环境保
护, 可持续发展的战略条件下,将会有更多的国家重
视转基因作物的生产。
大豆遗传转化技术目前面临的另外一个重要问
题是生物安全性问题,迄今应用于农业生产的转基
因大豆几乎都是抗除草剂的转基因大豆。最初的转
基因作物目的在于通过导入抗病毒、抗真菌疾病、抗
虫基因或是抗除草剂来提高作物产量。大豆遗传转
化中常用的筛选
基因主要是抗生素基因和除草剂抗性基因, 然
而这些基因的存在可能影响人类身体健康, 破坏生
态环境。转基因作物研究的目的是服务于人类, 即
转基因食品,然而现阶段,人们对转基因食品的安全
性存在怀疑,在一定程度上抵制转基因食品。因此,
去除转基因大豆中筛选基因显得尤为重要, 如何去
除筛选标记基因将是大豆遗传转化研究的一个必然
趋势。
因此,就要加强转基因作物安全评价的研究,科
研单位制定安全评价方案, 各级监管部门制定法规
政策,对商品化的转基因作物长期监管, 形成稳定、
安全的转基因安全评价体系, 使转基因作物真正为
民是今后发展的主要方向。
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