全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 11期
非洲爪蟾 IL6基因的克隆及
生物信息学分析
齐志涛 1, 2, 3 张启焕 3 王资生 1 许伟 3 黄贝 2 王爱民 1
( 1盐城工学院海洋技术系 江苏省沿海池塘养殖生态重点实验室,盐城 224051;
2中国科学院水生生物研究所 淡水生态与生物技术国家重点实验室,武汉 430072;
3盐城工学院化学与生物工程学院生物实验中心,盐城 224051)
摘 要: 生物信息学作为一门新兴学科, 已经应用到生命科学、临床医药、工农业等方面。白细胞介素6( IL6)是机体
重要的免疫因子, 但在两栖类中未见报道。采用生物信息学方法对两栖类模式动物非洲爪蟾 IL6进行分析。以人 IL6基因
对非洲爪蟾数据库进行搜索、分析, 并采用 RTPCR方法对所得序列进行验证。结果表明, 非洲爪蟾 IL6基因位于 sca ffo ld_52
基因架上, 具有保守的 IL6家族基序。采用生物信息新方法进行不同物种的免疫基因挖掘、克隆,是一种有效的方法。
关键词: 生物信息学 非洲爪蟾 白细胞介素6 基因克隆
Cloning and BioinformaticsAnalysis of the
Interleukin6 Gene from Xenopus trop icalis
Q iZhitao
1, 2, 3
ZhangQ ihuan
3
W ang Z isheng
1 XuW ei3 Huang Bei2 W ang A im in1
(
1
D epar tment of O cean T echnology, Yancheng Institute of T echnology, K ey Laboratory of A quaculture and E cology of Coastal Pool of
J iangsu Province, Yancheng 224051;
2
State Key Laboratory of FreshwaterE cology and B iotechnology, Institute of H ydrobiology,
Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072;
3
Central Laboratory of Biology, Chemical and BiologicalEngineering College,
Yancheng Institute of T echno logy, Yancheng 224051)
Abstrac:t B io in fo rm a tics, as a new deve lop ing science, has been app lied in life sc ience, c lin ica l m ed ic ine, indu stry and
ag r icu ltu re. In ter leuk in6 is an im portan t imm une cy tok ine, how ever, there have been no report on th e IL6 gene from am ph ib
ian. The IL6 gen e from the am ph ib ian m ode l an im a lX enopu s trop icalis w as ana ly zed firstly us ing b io in fo rm a tics m e thod s. U
sing BLAST ana lys is w ith the hum an IL 6 sequ en ce, theX enopus trop ica lis genom e databa se w as sea rched and ana lyzed, then
the ob ta ined xeIL6 sequence w as ve r ified u sing RTPCR. Resu lts show ed th at the X enopus IL6 w as loca ted on sca ffo ld _52
and con ta ined conserved IL6fam ily m o tif. Th e resea rch proved that b io in fo rm a tics m ethods is a conven ient techn ique for c lo
n ing new imm une gene s.
Key words: B io informa tics X enopus trop icalis Inter leuk in6 Gene clone
收稿日期: 20100630
基金项目: 2010年江苏省省属高校自然科学研究项目 ( 10K JB240001 ),农业部水生动物遗传育种和养殖生物学重点开放实验室重点开放课题
( BZ200706)
作者简介:齐志涛,男,博士,副教授,研究方向:水产动物疾病与免疫学; Em ai:l q izhitao@ ycit edu cn
白细胞介素 ( Interleukin, IL ) 6是机体先天性
免疫反应中重要的多功能因子,对淋巴细胞、造血干
细胞、中枢神经系统具有促进生长、诱导分化的功
能 [ 1, 2]。此外, IL6还可以促进 B淋巴细胞分化和
抗体的分泌, 诱导细胞毒性 T淋巴细胞活化, 具有
增强免疫的作用 [ 3, 4]。目前, IL6已在人、鼠和硬骨
鱼等物种中报道 [ 5, 6]。然而, 在动物进化过程中具
有重要地位的两栖类中未见 IL6基因的相关报道。
本研究以两栖类模式动物 非洲爪蟾 (X enopus
trop icalis)为研究对象, 首次对其 IL6进行了克隆,
同时采用生物信息学的方法分析了 xeIL6基因序
列特征。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
1 材料与方法
11 材料
111 主要试剂 Trizo l试剂和反转录酶 Super
Script
TM
II Reverse T ranscriptase购自 Inv itrogen公司;
逆转录试剂盒 RevertA idTM F irst Strand cDNA Synthesis
K it购自 Fermentas公司; SMART cDNA synthesis K it
购自 C lontech公司;质粒提取试剂盒 ( E. Z. N. ATM
Plasm id m ini kit I)和胶回收试剂盒 ( E. Z. N. ATM Gel
Extraction K it)购自 Omega公司; pMD18T 载体和
DL2000M arker购自 TaKaRa公司。
112 试验动物 试验用非洲爪蟾购自中国科学
院遗传与发育生物学研究所。运回实验室后定期投
放猪肝饲养。水温保持在 37! 左右。通过捣碎脊
髓方法处死, 选取组织放于 1 mL Trizol中,置于–
80! 保存备用。
12 方法
121 非洲爪蟾基因组搜索 以人 IL6基因蛋
白质序列 ( GenB ank登录号: NP_000591)对非洲爪
蟾基因组数据库 ( http: / /www ensemb lo rg /Xeno
pus_ trop ica lis/ indexhtm l)进行 tB lastp搜索, 得到
一系列基因组序列, 对得到的序列中相似度最高
( Iden tity > 40% )的 Scaffo ld_52进行 G enscan结构
预测, 之后对预测结构进行 tBLASTn和 BLASTp
分析。
122 总 RNA提取及反转录合成单链 cDNA 采
用 Trizol提取 RNA。将 - 80! 保存的组织取出,冰
上解冻、匀浆。室温静置 10 m in, 离心 ( 11 400
r /m in, 10 m in, 4! ) ; 取上清, 加入 02 mL 氯仿, 剧
烈摇动 15 s, 室温静置 3m in,离心 ( 11 400 r/m in, 15
m in, 4! ) ; 取上清, 转移到干净的离心管中, 加入
05 m l异丙醇, 室温静置 10 m in, 离心 ( 10 400
r /m in, 10 m in, 4! )。沉淀用 75% 乙醇洗涤后,
- 80! 保存在 100% 乙醇中。用前通过凝胶电泳
检测 RNA样品质量。按 SMART cDNA SynthesisK it
操作手册进行 cDNA合成。
123 xeIL6基 因部分序列的 扩增 根据
scaffold_52的预测结果, 采用 Primer Prem ier 50设
计了 xeIL6特异性引物。上游引物 xeIL6F: 5∀TT
GGTGTTGGCATCCCTG3∀, 下游引物 xeIL6R: 5∀
TTTGTGACTCGCTGTCTCCA3∀。所用的引物由上海
生工生物工程公司合成。以 Po ly I: C诱导的非洲爪蟾
脾脏组织的 SMART cDNA为模板,扩增 xeIL6 cDNA
片段。PCR反应程序: 94! 预变性 5m in; 94! 30 s,
55! 30 s, 72! 1m in, 35个循环; 72! 延伸 10m in。
124 PCR产物的回收、测序 将 PCR产物经 1%
琼脂糖凝胶电泳后,切下含目的 DNA片段的胶条,
使用 Omega公司的凝胶回收试剂盒回收 DNA,回收
步骤按试剂盒推荐进行。将回收得到的目的基因片
段与 pMD18T载体连接, 16! 反应过夜。取连接产
物 5 L转化大肠杆菌 DH 5感受态细胞。通过特
异性引物筛选阳性克隆。阳性菌液送北京奥科生物
科技有限公司测序。
125 生物信息学分析 利用 ExPASy网站 ( ht
tp: / /www expasyorg)中的 Translate程序进行氨基
酸序列 推导。使用 NCBI 网站 ( http: / /www nc
binml nihgov /blast)的 tBLASTp软件进行同源基因的
搜索; 用 PROSITE预测氨基酸可能含有的结构域
及 N糖基化位点。氨基酸的多序列比对使用
C lustalW 183分析 [ 7]。不同物种同源基因的相似
性用 DNASTAR软件包中的 MEGAL IGN程序分
析 [ 8]。采用 M ega30软件中的 NJ法构建系统发
育树, 并设置 1 000次的 Boo tsraps进行评估 [ 9]。
2 结果与分析
21 IL6基因座同线性分析
通过对人、鸡、非洲爪蟾 IL6基因座分析 (图
1)显示, IL6基因座在进化上较为保守。该基因座
中的细胞因子在基因排列顺序及转录方向上均保持
一致。在 IL6基因附近的基因在进化的过程中也
保持一致,如 RAPGEF5、CDCA7L、SP4等。
22 xeIL6生物信息学分析
Genscan预测结果显示, 在 Scaffo ld_52序列中
包含有一个长度为 260个氨基酸的蛋白质序列。对
该序列进行 BLASTp分析, 发现该序列与鸡的 IL6
基因具有很高的相似性。为了进一步证明所得序
列, 分别进行序列比对和系统进化树分析。图 2为
使用 C lustaWl 软件进行序列比对的结果。结果显
示, 该序列与其它物种 IL6序列相似性较高,其中
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2010年第 11期 齐志涛等 :非洲爪蟾 IL6基因的克隆及生物信息学分析
图 1 不同物种的 IL6基因座同线性分析
与鸡 IL6相似性最高, 为 396%。其它物种 IL6
中保守的 4个半胱氨酸残基在 xeIL6同样存在。
同时,在其它物种中保守的 4个半胱氨酸在 xeIL6
中同样存在,而且 xeIL6含有保守的 IL6蛋白基
序 CX ( 9 ) CX ( 6) GLX ( 2 ) FYX ( 3) L。采用
M ega30软件中的 NJ法构建系统发育树, 结果
(图 3)显示该序列与鸡 IL6聚为一簇, 具有较高
的枝值 ( 83% ), 这与在进化的过程中两栖类与鸟
类地位较为接近相一致。以上分析提示我们, 所
预测到的序列是非洲爪蟾的 IL6基因。
23 RTPCR
为了验证以上方法所预测到的序列的正确性,
我们采用 RTPCR方法对 xeIL6基因部分序列进
行了扩增。PCR结果经 12%琼脂糖凝胶电泳, 结
果 (图 4)显示单一条带, 约 560 bp目的片段, 与预
计大小相符。用 pMD18T载体克隆后测序,结果与
预测序列一致。
黑色、深灰色、浅灰色分别代表 100%、80%、60%的氨基酸相似度; # ∃表示保守的半胱氨酸; # % ∃表示 IL6蛋白基序 ( CX ( 9 )
CX( 6 ) GLX ( 2) FYX( 3) L )
图 2非洲爪蟾 IL6部分序列与其它物种 IL6氨基酸序列的比较
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
括号中为各物种 GenBank登录号
图 3 系统发育树分析非洲爪蟾 IL6与其它物种中 IL6基因进化关系
图 4 非洲爪蟾 IL 6 cDNA RTPCR产物的琼
脂糖凝胶电泳分析
3 讨论
本研究通过比较生物信息学方法,首次对两栖
类模式生物非洲爪蟾的 IL6基因进行了克隆及序
列分析。 IL6基因座在进化的过程中较为保守,表
明 IL6可能是由同一个祖先基因进化而来。同时,
xeIL6具有 IL6基因家族保守的蛋白基序 CX
( 9) CX( 6) GLX ( 2) FYX ( 3) L, 提示 xeIL6可
能具有与哺乳类 IL6类似的功能。序列比对和系
统进化树分析显示,非洲爪蟾 IL6与鸟纲的 IL6具
有较高的相似性 ( 396% ),这与物种进化的结果相
一致,提示 IL6基因可能由同一个祖先基因进化
而来。
生物信息学 ( b io in formatics)作为一门新兴学科,
已广泛应用于生命科学、临床医药、工农业等方面。
随着各种生物基因组计划的完成, 采用比较生物信息
学方法对不同物种的基因组数据库进行发掘、分析,
越来越多的免疫基因得到了克隆鉴定 [ 10, 11]。与传统
基因克隆方法相比,该方法具有针对性强、快捷、成
本低等特点。随着其它物种基因和蛋白质结构的完
成, 通过生物信息学方法可以为新基因的发现提供
简捷的途径,为今后的试验工作奠定基础。当然,仅
依靠生物信息学方法还远远不够, 还要求我们在后
续的工作中采用相应的分子生物学方法予以检验。
相信随着今后生物信息学的发展, 人类对于自身及
其它生物基因组中所包含的信息将会突飞猛进。
参 考 文 献
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(上接第 128页 )
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