全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 2期
刺参甘露糖结合凝集素的生物信息学分析
谢广成 1 李丹彤 1 周立敬2
( 1大连海洋大学 农业部海洋水产增养殖学与生物技术重点开放实验室,大连 116023; 2中央民族大学生命与环境科学学院,北京 100081)
摘 要: 甘露糖结合凝集素 ( m annanbinding lectin, M BL )属于 C型动物凝集素超家族, 特异地结合甘露糖。MBL是宿
主起始免疫系统一个重要成分,因此近年来逐渐成为研究的热点。采用生物信息学技术对刺参 (Apostichopus jap onicus)MBL
( AJMBL)的两个基因编码的蛋白质结构和功能进行了分析, 包括信号肽、分子量、等电点、跨膜结构域、糖基化和磷酸化位
点、二级结构和三级结构等,旨在了解其结构特征,为动物免疫反应方面研究提供理论基础。
关键词: 甘露糖结合凝集素 刺参 生物信息学分析
B ioinformaticsAnalysis ofMannanbinding Lectins in
Apostichopus japonicus
X ieGuangcheng
1 L iDantong1 Zhou L ijing2
(
1
K ey Laboratory of M ariculture and Biotechnology Certif icated by M inistry of A griculture, Dalian O cean University, Dalian 116023;
2
College of Life and Environmental Science, M inzu University of China, Beij ing 100081)
Abstrac:t M annanb inding lec tins(MBLs) belong to the Ctype an im a l lec tin supe rfam ily, wh ich natura l h ighaffin ity tom annose.
M BLs a re im po rtant component of inna te immunity, responsible for the first line of ho st defense, so the research in this fie ld becam e hot
in recent years. In this paper, the structure and function o fApostichopus japonicusMBL( AJMBL) genes encod ing prote in such as signa l
pep tide, mo lecu la rw eigh t, isoe lectric po int, transm em brane dom a in, g ly cosy lation and phosphory lation sites, secondary and tertiary struc
tu res w ere ana lyzed by a ser ies of bio inform a tics softw are, a im ing at understand ing the structure character istics, and prov ide theore tica l
basis fo r an im al imm une response.
Key words: M annanb ind ing lectins Apostichopus jap onicus B io inform atics ana ly sis
收稿日期: 20100916
基金项目:辽宁省教育厅团队项目 ( 2008T021)
作者简介:谢广成,男,硕士研究生,研究方向:刺参分子生物学; Em ai:l xieguangcheng123@ 126. com
通讯作者:李丹彤,女,副教授,硕士,研究方向:海洋生物化学与分子生物学; Em ai:l l idan tong@ d lou. edu. cn
动物凝集素包括 C型和 S型,以膜整合及水溶
性的形式存在, 通过与体液中的糖配体 (如某些激
素、细胞因子、生长调节因子等 )或细胞表面的糖配
体相互作用,进行识别与结合来对细胞产生信号作
用,引发细胞产生一系列反应, 参与动物体的发育、
内环境的稳定以及机体防御等功能 [ 1 ]。
MBL是一种 C型凝集素, 在人体中主要由肝脏
合成,存在于血清中 [ 2- 4]。每一条 MBL肽链包含 4
个区域: N端富含胱氨酸区 ( Cyste iner ich reg ions)、
胶原样区 ( CLD )、颈区 ( N eck reg ion)和糖识别区
( CRD)
[ 3, 5, 6]。CRD区是 MBL分子的识别功能区,
单个 CRD与糖配体单价结合的亲和力很弱,因此有
功能的人 MBL分子含有多个 CRD区,排列成数个
球状结构域,这样与糖配体多价结合才可使亲和力
增加到有生理意义的水平 [ 7]。
有关动物凝集素的研究主要集中在低等动物,
如舍蝇淋巴细胞中发现有凝集素 [ 8]。凝集素在水
生无脊椎动物体内普遍存在, 涉及一些水生动物的
幼体附着和变态行为;另外, 凝集素在无脊椎动物的
免疫识别中担当重要角色 [ 9 - 11]。动物凝集素具有
防御病原体入侵; 识别体液中或细胞表面的糖配体
并与之结合, 对细胞产生信号作用; 调节细胞 - 细
胞、细胞基质间的反应等生物学功能。由于凝集素
在生命有机体中识别外来物,在体内 (外 )起调理作
2011年第 2期 谢广成等 :刺参甘露糖结合凝集素的生物信息学分析
用。因此,凝集素在认识和解决集约化、半集约化的
养殖生物防病治病中有重要作用 [ 12]。熊川男等 [ 13]
提出凝集素可以作为海参免疫增强剂, 在人工养殖
海参中应用。
有关刺参 MBL凝集素生物信息学的研究, 相关
报道比较少。Bulgakov等 [ 14 ]只对刺参 MBL氨基酸
序列进行了多序列对比分析。本研究利用生物信息
学方法对两个刺参 MBL ( AJMBL)基因编码的蛋白
质结构和特征进行分析, 以期提高对凝集素的认识
和普及,从而提高我国的养殖业总体水平。
1 材料与方法
数据资料来源于 NCBI核酸及蛋白质数据库中已
注册的 AJMBL1(AY625513) , AJMBL2(DQ359950)的
核苷酸序列及其对应的氨基酸序列。
利用 DNAMAN和 SignalP 3. 0 Server进行氨基
酸序列的信号肽预测,利用 ProtParam在线工具分析
基因编码蛋白的氨基酸组成、相对分子量、等电点等
理化性质。氨基酸序列同源性比对和系统发育树构
建由 DNAMAN, MEGA4. 0完成。利用 GOR模型算
法对基因的氨基酸序列二级结构进行在线预测,基
因编码的氨基酸序列的跨膜结构域、亲水性 /疏水
性、糖基化、磷酸化和亚细胞定位预测分别由 TM
HMM、ProtSca le、NetNG lyc、Netphos和 SubLoc完成,
由 SW ISSMODEL完成三级结构建模预测。
2 结果
2. 1 A JMBL核苷酸及氨基酸序列分析
从 NCBI数据库检索到两条刺参 MBL mRNA序
列, 分别为 A JMBL1 ( AY625513 ), A JMBL2 ( DQ
359950)。两序列比较结果见表 1。
表 1 A JMBL1和 AJMBL2核苷酸序列比较
序列 全长 ( bp ) CDS区 ( bp) 氨基酸数目
AJMBL1 714 535 178
AJMBL2 975 540 179
利用 S ignalP 3. 0 Server在线预测工具对 AJ
MBL1和 A JMBL2编码的相应蛋白质进行信号肽预
测。预测结果显示, A JMBL1在 19和 20位氨基酸
(AQGCL)之间有分裂位点。A JMBL2在 20和 21位
氨基酸 ( SSGCT )之间有分裂位点。利用 DNAMAN
进行信号肽预测验证, AJMBL1信号肽预测结果同
S ignalP, AJMBL2在 18和 19位氨基酸 ( VHSSG)之间
有分裂位点,两者预测结果相差两个氨基酸。AJMBL2
成熟氨基酸后期分析以 SignalP预测结果为准。
两条核苷酸序列经过 NCB I的 BLASTn比对,发
现两条序列没有相似度。将两条核苷酸编码的相应
氨基酸序列进行 BLASTp比对, 结果显示, AJMBL1
与刺瓜参 CELIV C 型凝集素完全重叠比率为
65% ,与 A JMBL2重叠比率为 55%; A JMBL2与刺
瓜参 CELIV C型凝集素完全重叠比率为 60% , 与
A JMBL1重叠比率也为 55%; 但二者都属于 CLECT
超家族成员。
利用 ProtParam 在线工具推测 AJMBL1和 A J
MBL2蛋白的理化性质, 结果见表 2。两种蛋白质的
氨基酸组成中,位居前四位的分别为 Ser、A la、G ly和
Leu。A JMBL1中含量分别为 Ser( 17个,占 107% )、
A la( 13个,占 8. 2% )、G ly( 10个,占 63% )和 Leu( 18
个,占 11. 3% ), A JMBL2中含量分别为 Ser( 20个,占
12. 6% )、A la( 14个,占 88% )、G ly( 12个,占 7. 5% )
和 Leu( 10个,占 6. 3% )。
表 2 AJMBL1和 AJMBL2蛋白的理化性质比较
序列 分子式 分子量
( kD )
理论等
电点
脂溶
指数 GRAVY
A JMBL1 C781H 1172N210O241 S8 17. 62 5. 22 73. 71 - 0. 278
A JMBL2 C772H 1141N213O238 S9 17. 50 6. 29 57. 74 - 0. 369
2. 2 A JMBL氨基酸序列二级结构预测和跨膜区
预测
AJMBL氨基酸序列二级结构在线预测由 GOR
程序完成,预测结果见表 3。A JMBL1中 螺旋贯
穿整个序列中, 折叠主要在前端和中间, AJMBL2
中 螺旋主要在序列的前端, 折叠主要在中间和
末端 (图 1)。
利用在线分析工具 TMHMM Server 2. 0, 对 A J
MBL的跨膜结构域进行在线预测和分析, 结果表
明, 两条序列编码的蛋白无明显的跨膜结构。
表 3 AJMBL1和 AJMBL2蛋白二级结构比较
序列 螺旋 (% ) 折叠 (% ) 不规则卷曲 (% )
A JMBL1 27. 67 19. 50 52. 83
A JMBL2 25. 16 24. 53 50. 31
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
竖线由长至短分别表示 螺旋, 折叠,不规则卷曲
图 1 AJMBL1和 A JMBL2蛋白二级结构预测
2. 3 A JMBL氨基酸序列的亲水性 /疏水性以及亚
细胞定位预测和分析
依据氨基酸分值越低亲水性越强,分值越高疏
水性越强的规律,用 ExPASy网络服务器的 ProtSca le
Server在线工具对 AJMBL基因的氨基酸序列的疏
水性 /亲水性进行预测 (图 2)。A JMBL1最大分值
为 1. 60,最小分值为 - 2. 189, 且绝大部分氨基酸分
值为负值 (图 2A )。A JMBL2最大分值为 1156,
最小分值为 - 2. 544,同时绝大部分氨基酸分值为负
值 (图 2B)。据此推测, 二者可能属于亲水性蛋白。
用 SubLoc v1. 0分析 A JMBL亚细胞定位, 结果显
示, AJMBL1位于细胞外, AJMBL2位于细胞核。
图 2 A JMBL1(A )和 A JMBL2(B )氨基酸序列的疏水性 /亲水性分析
2. 4 A JMBL氨基酸序列的糖基化和磷酸化预测
通过网络在线预测工具 N etNG lyc 1. 0 Server,
对 A JMBL氨基酸序列的糖基化位点进行预测。预
测结果显示,二者均没有糖基化位点。通过 N etPhos
2. 0 Server进行 A JMBL氨基酸序列的磷酸化位点
预测, 结果为 A JMBL1氨基酸序列中有 7个 Ser、1
个 Thr和 2个 Ty r磷酸化位点。A JMBL2氨基酸序
列中有 6个 Ser、1个 Thr和 3个 Tyr磷酸化位点。
2. 5 A JMBL氨基酸序列的同源比对和系统进化
树构建
将 GenB ank 中 登 录 的 SSL1 ( Salmosalar,
AAO43605) , CELIVCTL ( C. echinata, AAB35250) ,
M BPA ( M ouse, AAB19342 ) , Rat MBPA ( Rattus,
P19999) , Hum an MBP ( Human, AAH69338 ) , CHL
( Gallus gallus, P02707)等来源的 C型凝集素 CTL
结构域的氨基酸序列与 AJMBL1和 A JMBL2的
CTL结构域的氨基酸序列进行同源比对 (图 3) , 并
构建系统进化树 (图 4)。
不同来源的 MBL氨基酸序列的比对和系统进
化分析结果表明, 不同来源的 MBL明显分为两组,
其中哺乳动物 MBL亲缘关系比较近, 在同一分支。
A JMBL1和 A JMBL2也在同一分支,但二者在不同
的亚枝, 二者属于不同的分类单元, 且 AJMBL1与
CELIV关系更近,这与前面的氨基酸比对结果一致。
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2011年第 2期 谢广成等 :刺参甘露糖结合凝集素的生物信息学分析
图 3 不同来源的MBL蛋白的氨基酸序列比对
图 4 AJMBL系统进化分析
2. 6 A JMBL氨基酸三级结构的预测
将两条 A JMBL氨基酸序列分别上传至 SW ISS
MODEL服务器中进行基于同源性的三维建模,结果
(图 5)表明, AJMBL1和 A JMBL2均具有 2个 螺
旋, 但 折叠的类型和数目存在差异。二者在三维
空间结构上存在显著差异。
图 5 AJMBL1( A)和 AJMBL2( B)三级结构
3 讨论
蛋白质是一种重要的生物大分子,是生命活动
的重要承担者,因此蛋白质的结构预测是一个重要
的问题。生物信息学作为一门新兴交叉学科, 以数
学和计算机科学为基础, 为生物科学服务。本研究
以生物信息学的方法, 对刺参两条核苷酸编码的氨
基酸序列进行结构预测和分析。
两条刺参 MBL的核苷酸序列长度不同且没有
相似度,但编码的蛋白质仅相差 1个氨基酸并且前
18位氨基酸均为信号肽。氨基酸序列比对结果显
示, 二者具有 55%的相似度, 都和刺瓜参 CELIV C
型凝集素具有 60%以上的相似度,证明两条基因编
码的蛋白均为凝集素。但两条核苷酸编码的氨基酸
序列经过理化性质分析 (分子式、理论等电点、分子
量、脂溶指数和 GRAVY ), 二级结构等方面均存在
差异。两条氨基酸序列均没有跨膜结构和糖基化位
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
点,都属于亲水性蛋白,但二者的细胞定位不同: A J
MBL1位于细胞外, AJMBL2位于细胞核,都有 Ser、
Thr和 Tyr磷酸化位点, 但数目不同。
经过其他来源的凝集素氨基酸序列与 A JMBL1
和 A JMBL2氨基酸序列同源比对, 发现比对序列均
具有保守于所有已知甘露糖结合蛋白 ( MBP)的
G luProA sn( EPN )甘露糖残基结合位点的三肽结构
( EPN mo tif)
[ 15, 16]。EPN motif对于甘露糖和 Ca2+的
结合都是必须的 [ 17]。部分序列的同源性为来自刺
参的这两条核苷酸序列是 MBL序列提供了额外证
据。A JMBL1和 A JMBL2同刺瓜参半乳糖结合凝
集素 CELIV的相似度为 65%和 60%, 该凝集素具
有甘露糖结合区域 EPN mot i,f但是没有半乳糖结合
区域 QPD /QPN motif[ 14, 16] , 表明刺参和刺瓜参在海
参种里具有很近的亲缘关系。刺瓜参 CELIV氨基
酸序包括两个链间二硫键 ( Cys5Cys16, Cys41
Cys147) ,其中一个链间二硫键和另一个亚单位通过
Cys1形成多肽链 [ 18] , 因此推测这些二硫键在 A J
MBL中也存在。通过氨基酸同源序列比对可以看
到,在脊椎动物 MBLsCa结合保守区域 WND motif
中 [ 17] , A JMBL1、A JMBL2和 CELIV氨基酸残基由
A la替换, 成为WAD区域。通过进化树和三维结构
分析, 发现 A JMBL1和 AJMBL2均存在差异。
参 考 文 献
[ 1 ] 周柔丽.哺乳动物凝集素及其生物学作用.生命的化学, 1995, 15
( 1 ) : 1215.
[ 2] 陈佳,李秋.甘露糖结合凝集素临床意义的研究进展.国际检验
医学杂志, 2006, 27( 9 ) : 798800.
[ 3] 吴蔚,陶然,尚世强.甘露糖结合凝集素研究进展.中华微生物学
和免疫学杂志, 2009, 29( 12 ): 11481152.
[ 4] 顾圆圆,夏正坤.甘露糖结合凝集素的研究进展. 医学研究生学
报, 2008, 21( 5) : 537541.
[ 5] Tay lorME, B riek ell PM, C raig RK, et a.l S tructu re and evolu tionary
origin of the gene encod ing a hum an serum m annoseb ind ing p ro
tein. B iochem ical Journa,l 1989, 262( 3 ) : 763771.
[ 6] Presan is JS, K ojim a M, S ire RB. B iochem istry and gen et ics ofm an
nanb ind ing lectin (MBL) . B iochem ical Society T ransact ion s, 2003,
31( Pt4 ): 748752.
[ 7] W orth ley DL, B ardy PC, Mu ll ighan CG. M annose b ind ing lect in:
b iology and clin ical im p lications. In ternalM ed icine Journa,l 2005, 35
( 9) : 548555.
[ 8] 王霁,李根君,段吉群.舍蝇 (Mu sca d om estica vicina )凝集素的分
离、纯化和部分性质的研究.生物化学杂志, 1991, 7( 1) : 4753.
[ 9] 徐海圣,徐步迸.甲壳动物细胞及体液免疫机理的研究进展.大
连水产学院学报, 2001, 16 ( 1) : 4956.
[ 10] 余燕泽,石安静.贝类血细胞研究进展.动物学杂志, 1998, 33
( 5) : 4041.
[ 11] 柯佳颖,陈寅山,饶小珍.凝集素及其生物学作用.宁德师专学
报:自然科学版, 2005, 17 ( 1) : 1922.
[ 12] 赵寅生.凝集素生物学功能及应用. 安徽农业大学学报, 2001,
28( 4) : 445447.
[ 13] 熊川男,李伟,白雪芳,等.凝集素作为海参免疫增强剂在人工
养殖海参中的应用.饲料工业, 2005 ( 18) : 3032.
[ 14] Bu lgakov AA, E liseik ina MG, Petrova IY. M olecu lar and b iolog ical
characterization of a m annanb ind ing lectin from the holothurian
Apostich opu s japonicas. G lycob iology, 2007, 17 ( 12) : 12841298.
[ 15] 李瑞,魏勤,王婉瑜,等.菜花烙铁头蛇毒 C型凝集素基因的克
隆与序列分析.动物学研究, 2003, 24( 4) : 293296.
[ 16] Drickam er K. Eng ineering galacloseb ind ing act ivity into a Ctype
m annoseb inding protein. N ature, 1992, 360: 183186.
[ 17] Zelen sky AN, G ready JE. Th e Ctype lect in like dom ain superfam i
ly. FEBS Journa,l 2005, 272( 24 ) : 61796217.
[ 18] H atakeyam a T, Oh ich iK, Ku rok iM, Yam asak iN. Am ino acid se
quen ce of a Ctyp e lectin CELIV from the m arine inverteb rateCu
cumaria ech ina ta. B ioscience, B iotechn ology, and B iochem ist ry,
1995, 59( 7 ): 13141317.
(责任编辑 李楠 )
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