全 文 ：2008年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论·
收稿日期:2007-11-19
作者简介:倪万潮(1962-),研究员,研究方向:植物生物技术,E-mail:jaasicb@public1.pt.js.cn,Tel:025-84390618
甜菊醇糖苷(steviolglycosides,SGs)是从甜叶
菊(Steviarebaudian)叶片中抽提出的一类天然甜味
剂,甜度为蔗糖的 150～300倍,而热量仅为蔗糖的
1/300[1],甜味好,特别适合三高人群。不但无副作
用,而且能辅助治疗某些疾病,如糖尿病,高血压,
肥胖症、心脏病和小儿龋齿等。另外,还有促进新陈
代谢,强健身体的作用[2~4]。SGs具良好的耐热性,见
光不易分解,不易被微生物同化和发酵,可延长
SGs制品保质期。另外,甜叶菊中含有 14种微量元
素、32种营养成分[4],它既是极好的糖源,又是很
好的营养来源。近年来,SGs生物合成途径和参与
该途径的一些关键酶及其基因的研究取得了一些
进展。
1 甜菊醇糖苷的结构特征
SGs是指甜叶菊的叶片中提取的几种甜菊苷
混合物。到目前为止,已从甜叶菊中分离出至少 8
种不同甜度的甜菊苷。其中甜菊糖苷(stevioside)是
主要成分,占 60%～70%,甜度为蔗糖的 143倍;其
次是甜菊苷 A(rebaudiosideA),占 15%～20%,甜度
为蔗糖的 242倍[5]。甜菊苷 A的甜味比甜菊糖苷更
为甘醇,涩味少[5]。
SGs属于四环二萜糖苷类,含有 20个碳原
子,其核心结构通式为(C5H8)4。从立体化学分子
结构[1,6,7]来看(图 1)具有相同核心结构—内根—贝
甜菊醇糖苷生物合成及关键酶研究进展
倪万潮 郭书巧
(江苏省农业科学院生物技术所,南京 210014)
摘 要: 甜菊醇糖苷(steviolglycosides,SGs)是甜叶菊(Stevia rebaudian)叶片中一类天然甜味剂,具有高甜度、
低热量、无毒副作用等特点,同时还具有一定的药理作用。植物体内主要是通过甲基赤藓糖醇(MEP)途径形成牻牛儿牻
牛儿焦磷酸(GGPP),之后该物质在古巴焦磷酸合酶(CPPS)、贝壳杉烯合酶(KS)、贝壳杉烯氧化酶(KO)、糖菊苷转移酶
(UGTs)等一系列结构功能各异的酶的作用下最终生成甜菊醇糖苷。SGs生物合成途径的调控及该途径中关键酶的研究
已成为目前国内外生物学领域的一大热点。综述了甜叶菊 SGs生物合成途径和参与该途径中的关键酶及其基因的研究
进展,并展望了其应用前景。
关键词: 甜叶菊 甜菊醇糖苷 生物合成 关键酶
AdvancesontheSteviolGlycosideBiosynthesisandIts
KeyEnzymes
NiWanchao GuoShuqiao
(InstituteofBiotechnology,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences,Nanjing210014)
Abstract: SteviolglycosideisthemixtureofnaturalsweetenersextractedfromleavesofSteviarebaudian(Bertoni)Bertoni.
Steviolglycosideshaveintensesweetnesbutnon-calorificandnotoxicity.Andsteviolglycosidesshow somedegreeof
pharmacologicalefects.Theprecursorofstevioside,geranylgeranylpyrophosphate(GGPP),isformedviatherecentlydiscovered2-
C-methyl-d-erythritol-4-phosphatepathway.GGPPisconvertedtosteviolglycosidesbyaseriesofenzymesinvolvedcopalyl
pyrophosphatesynthase,kaurenesynthase,kaureneacid13-hydroxylase,UDP-glycosyltransferasesetal.Thisarticlereviewssteviol
glycosidesbiosyntheticpathwayofSteviarebaudianandkeyenzymesandtheirresearchforeground.
Keywords: Steviarebaudian SteviolglycosidesBiosyntheticpathway Keyenzymes
2008年第2期
壳杉烯(ent-kaurene),在 C-19和 C-13位上分别连
接不同数量的葡糖基以及鼠李糖基而形成不同甜
度和甜味的 SGs(图 1)[8]。
2 甜菊醇糖苷生物合成基本过程
植物体内 SGs的生物合成途径与赤霉素(gibbe
relin,GAs)、叶绿素、类胡箩卜素、脱落酸合成途径都
具有相关性[9~11]。它们的共同前体物-牻牛儿牻牛儿焦
磷酸(geranylgeranylpyrophosphate,GGPP)在叶绿体
内形成,GGPP在古巴焦磷酸合酶(copalyl
pyrophosphatesynthase,CPPS)、贝壳杉烯合酶
(kaurenesynthase,KS)、贝壳杉烯酸羟基化酶
(kaureneacid13-hydroxylase,KAH)、UDP-糖
基转移酶(UDP-glycosyltransf-erases,UGTs)等
酶的作用下进一步催化形成SGs[5]。SGs在细胞
质中大量积累后运输到中央液泡内,但是对于
该运输机制目前还不甚了解。
2.1 SGs生物合成前体-GGPP的形成
异戊烯焦磷酸(isopentenylpyrophosphate,
IPP)是所有类异戊二烯(isoprenoids)的基本结
构单元,在高等植物中存在两条明显的 IPP合
成途径(图 2)[12]。在细胞质、线粒体和内质网
中,主要是甲羟戊酸(themevalonateacid,MVA)
途径,由乙酰CoA经羟甲基戊二酰-CoA缩合
形成 MVA,随后经 2步激酶反应,产生甲羟
戊酸焦磷酸,然后脱羧为 IPP(图 2)[10];IPP
在 IPP异构酶的作用下可逆异构化形成二甲
烯丙基焦磷酸(dimethylalylpyrophosphate,DMAPP);
DMAPP是萜烯生物合成的启动单位,它与 IPP分子
在 GGPP合酶(GGPPsynthase,GGPPS)的作用下缩
合为GGPP[10]。GGPP在线粒体形成泛醌,在细胞质
内参与异戊二烯基蛋白的形成[13]。
在叶绿体中,GGPP通过甲基赤藓糖醇(the
methy1erythritol4-phosphate,MEP)途径形成,它与
MVA途径的不同在于 IPP的形成方式不同,随后
形 成 GGPP的 步 骤 完 全 相 同 。3-磷 酸 甘 油 醛
(glyceraldehyde3-phosphate,GAP)与丙酮酸(pyruvate)
通 过 脱 氧 木 酮 糖-5-磷 酸 合 酶 (1-deoxyxyulose-5-
phosphatesynthase,DXS)催化缩合,再由脱氧木酮
糖-5-磷酸还原酶(deoxyxyulose-5-phosphatereductois
omerase,DXR)作用转变为 2-C-甲基-D-赤藓糖醇
(2-C-methyl-D-erythritol4-phosphate),随后释放核
甘酸 5’-单磷酸胞苷,形成 2-C-甲基-D-赤藓糖醇-
2,4-环焦磷酸(2-C-methyl-D-erythritol2,4-cyclopyro
phosphate),再进一步催化形成 IPP和 DMAPP,二者
在 GGPPS的作用下缩化成 GGPP(图 3B)[5]。在叶绿
体中形成的 GGPP进一步形成内根-贝壳杉烯并从
叶绿体运出,在细胞质进一步形成SGs(图2)[10]。甜菊
醇的SGs生物合成途径主要是依赖于MEP途径[12]。
图 1 甜菊醇和甜菊醇糖苷化学结构
图 2 牻牛儿牻牛儿焦磷酸(GGPP)的合成途径
倪万潮等:甜菊醇糖苷生物合成及关键酶研究进展 49
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2.2 GGPP到 SGs的形成
SGs的生物合成途径与植物体内赤霉素(gibberelin,
GAs)、胡萝卜素(carotenoid)在底物链上部分共享
(图 3)[5,9~11]。在 MEP途径的最后一步,在 GGPP合
酶(GGPPS)的作用下,IPP和 DMAPP通过三次连续
缩合转化成 GGPP(图 3),然后在环化焦磷酸合酶
(copalylpyrophosphatesynthase,CPPS)的作用下脱
氢形成为 CPP,CPP在贝壳杉烯(ent-kaurene)合酶
(KS)的催化下环化成贝壳杉烯[5]。
贝壳杉烯是 GAs合成过程中的一个的中间产
物。合成的贝壳杉烯转移到内质网,在依赖细胞色
素 P450的单加氧酶(KO)的作用下转化成贝壳杉
烯酸 (ent-kaurenoicacid)[14],这是 SGs合成与 GAs
合成途径中的一个分界点。贝壳杉烯酸在 C-7位脱
氢形成 GA12醛,最后转入细胞质形成各种 GAs终
产物;贝壳杉烯酸在内根-贝壳杉烯酸氧化酶
(KAH)的作用下,发生 C-13位脱氢氧化形成甜菊
醇(stevoil),它是甜味糖苷(glycosides)合成的前体。
甜菊醇在不同的 UDP葡糖基转移酶(UGTs)的作用
下,最终形成甜菊糖苷 (stevoiside)和甜菊苷 A
(rebaudiosideA)等(图 3)。
3 关键酶及其基因的研究
3.1 1-脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)合成酶(DXS)
和 DXP还原异构酶(DXR)酶及其基因
MEP途径在动、植物和微生物中普遍存在,
DXS和 DXR是 MEP途径中的两个限速酶。在甜叶
菊叶片中主要通过 MEP途径合成萜烯配糖体的基
本骨架内根贝壳杉烯。该途径中的前两个步骤分别
被 SrDXS和 SrDXR酶所催化,编码这两个酶的基
因已通过 RT-PCR的方法所克隆(GeneBankNo.分别
为 AJ429232和 AJ429233)。SrDXS开放阅读框全长
2148bp,编码一条由716个氨基酸组成的多肽,分子
量为 76.6kDa;SrDXR开放阅读框全长 1422bp,编码
一条由474个氨基酸组成的多肽,分子量为 51kDa;
SrDXS和SrDXR的 N-端都包含一个植物特有的质
粒靶标序列。其核苷酸序列与其它作物中的这两个
酶分别具有高度同源性[13]。DXS氨基酸序列分析表
明,它含有一个保守的硫氨二硫酸结合位点和组氨
酸残基结合基序。而 DXR含有一个 NADPH结合基
序[15]。
将 SrDXS和 SrDXR基因分别转入大肠杆菌
dxs:CAT和 dxr:TET突变体菌株中,检测结果表明,
这两个基因能互补大肠杆菌营养 DX缺失 dxs:CAT
突变体和营养 ME缺失 dxr:TET突变体,使其分别
在缺失 DX或者 ME的情况下恢复正常生长[13]。
3.2 萜烯环化酶及其基因
SGs的生物合成途径中的 GGPP在古巴焦磷酸
合酶(GGPPS)、环化焦磷酸合酶(copalyl
pyrophosphatesynthase,CPPS)和贝壳杉
烯合酶(KS)的相继作用下生成贝壳杉
烯。
Burke等(1999)从胡椒薄荷(Mentha
piperita)中分离出 GGPPS,它由 2个亚
基组成,其中大亚基具有 2个高保守
性的、富含 Asp的基元作为底物的结
合位点,而小亚基却无此结构[16];2个
亚基只有在共表达时才有催化活性。
Brandle等(2002)从甜叶菊叶片 EST数
据库中搜集了3个EST序列,序列拼接
得到SrGGPPS的cDNA序列(GeneBank
No.DQ432013),其编码产物与向日葵
HaGGPPS氨基酸序列 (GeneBankNo.AAC77874)的
一致性和相似性分别为63%和80%[5,17]。但尚无进一
步的研究。
编码 CPPS和 KS酶的基因已经从许多植物中
分离,并对其特征进行了描述[18,19]。Nothern分析表
图 3 甜菊糖苷的主要生物合成途径
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2008年第2期
明,甜叶菊 SrCPPS和 SrKS在叶片中高丰度表达,
在完全张开的叶片中表达丰度最高。以 CPPS和 KS
基因序列为探针进行原位杂交,发现二者仅在植物
叶片的薄壁细胞中有转录产物[19],因而认为萜烯环
化的过程被局限于植物绿色组织中,这与 SGs仅仅
存在于植物的叶绿体中是相一致的[20]。亚细胞定位
研究也表明,拟南芥 CPPS和 KS信号肽序列的靶
标酶定位于叶绿体中[21]。由于 CPPS和 KS酶在植物
体内还参与 GA的生物合成,而甜叶菊中 GA的含
量与其它植物中含量相似(鲜重约 1.2μg/kg)[19],这
说明 CPPS和 KS的过高表达并没有合成更多的
GA,对植物的生长和发育没有明显的影响,在植物
次生代谢过程中,这两种酶应该是依赖于某种时空
表达模式,来协调其在 GAs和 SGs合成过程中的
表达方式。
3.3 内根-贝壳杉烯氧化酶(KO)及其基因
贝壳杉烯极性很低,能够穿透叶绿体膜,从它
的合成场所叶绿体基质中转移到内质网膜上,然后
由贝壳杉烯氧化酶(ent-kaureneoxidase,KO)经过三
次连续的氧化形成贝壳杉烯酸。KO是一种依赖于
P450的单加氧氧化酶,是 SG和 GA合成过程中的
关键酶[22,23]。
Humphrey(2006)等以拟南芥 KO(AtKO1)为探
针,从甜叶菊叶片的 EST中分离到一个全长 KO序
列(SrKO1),它所编码的氨基酸序列与 AtKO1一致
性为 58%,相似性 87%。并且同属于 CYP701A5氧
化酶家族的成员[17,24]。利用 SrKO1全长为探针搜索
甜叶菊基因组文库,发现该基因存在两个拷贝
SrKO1和 SrKO2(GenBank号分别为 DQ200952和
AY995178)。序列分析表明两者核苷酸序列一致性
为 99.5%,氨基酸序列完全一致。SrKO1和 SrKO2
都由 8个外显子和 7个内含子组成,其 cDNA编码
一条由 513个氨基酸组成的多肽链。
对参与 SGs生物合成过程的几种酶所对应的
基因进行 DNA斑点杂交分析表明,在叶片中 CPPS
和 UGT85C2表达丰度较高,而 KO中等强度表达;
在不同组织中的 Northernblot表明,SrKO在叶片和
花中高丰度表达,而在根中表达量相对较低[24]。将
KO的全长 cDNA序列转入酵母,从重组酵母中提
取 KO酶并检测其活性,发现它能将贝壳杉烯氧化
成贝壳杉烯酸。将 SrKO与 GFP融合后,转入洋葱
表皮细胞和烟草叶片保卫细胞,用 YFPHDEL共定
位,发现 SrKO:GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞和烟
草叶片保卫细胞的内质网 (endoplasmicreticulum,
ER)表达[24]。而拟南芥的 AtKO定位于叶绿体中[21]。
3.4 KAH酶及其基因
贝壳杉烯酸C-13羟基化酶(KAH)是SGs合成从
GAs生物合成分支后的第一个关键酶,在 NADPH和
分子氧参与下催化贝壳杉烯酸13位羟基化,形成萜
烯类化合物甜菊醇[25]。叶片提取物纯化后发现,KAH
的分子量为39kDa,在植物体内其天然蛋白以四聚体
的形式存在,分子量为160kDa。四聚体结构的KAH
蛋白与FBPA结构类似,也存在于叶绿体中。可见光
的吸收谱表明,它属于黄素蛋白类酶[25~26]。
Kim(1996)等声称从纯化的 KAH蛋白中获得
了部分氨基酸,N-端含有 20个保守的氨基酸残基
“TYADELVKDAGNLAGHLYEI”,但没有得到有意义
的基因序列,所以有人怀疑它的有效性[25,26]。Geuns
(2003)等利用已公布的 N-末端序列设计引物利用
PCR的方法克隆该基因,结果得到一个果糖二磷酸
醛缩酶(FBPA)[26],后来 Brandl和 Telmer(2007)以
N-末端序列搜索甜叶菊叶片 EST库也获得了
FBPA基因。并且叶片蛋白提取物体外纯化后并
没有检测到 KAH的活性,推测在该蛋白在纯化
过程中得到的是可能 FBPA而不是 KAH[5]。Brandle
等(2002)从 EST数据库中获得 5个候选的细胞色
素 P450基因的 EST序列。其中有一个序列能在甜
叶菊 WAT21中表达,并有能力将贝壳杉烯酸转化
成甜菊醇[5,17]。
贝壳杉烯酸在 KO的作用下进一步氧化形成
GA12醛;最后转入细胞质形成各种 GAs最终产物;
贝壳杉烯酸在内根-贝壳杉烯酸氧化酶(KAH)的作
用下,发生C-13位脱氢氧化形成甜菊醇(stevoil)[25]。
3.5 UDP-糖基转移酶(UGTs)及其基因
植物 UDP-糖基转移酶(UGTs)是糖基转移酶家
族中的一个分支,糖基的转移有利于改变受体分子
的稳定性,解毒功能和可溶性等,并经常作为次生
代谢终产物出现[5]。在甜叶菊中,甜菊醇在不同的
UGTs作用下,在 C-19和 C-13位上分别连接不同
数量的葡糖基以及鼠李糖基形成不同的甜度和甜
倪万潮等:甜菊醇糖苷生物合成及关键酶研究进展 51
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
味的甜菊糖苷 (stevoiside)、甜菊苷 A(rebaudioside
A)等。UGTs在 SGs的合成过程中起着重要作用
(图 3)。
糖苷基甜菊醇有位于 C-13和 C-19的两个羟
基集团(图 1),理论上这两个位点都能够糖基化。
以不同的甜菊醇衍生物为底物来检测甜叶菊叶片
蛋白粗提物的糖基化作用,结果表明:19-O-糖菊醇
的 C-13位羟基转化为糖基;甜菊单苷糖基化成甜
菊双苷;甜菊双苷进一步糖基化形成甜菊苷 A
(rebaudiosideA,表 1)。推测,SGs合成起始于 C-13
位羟基化;甜菊苷 A可能是该途径的最终产物;3
个糖基的甜菊糖苷和 4个糖基的甜菊苷 A是甜叶
菊叶片中存在的 SG的主要类型[6,7,24]。
植物 UGTs是一种混合物,各个酶对底物的作
用位点具有专一性,从某种程度上讲,具有高度特
异性;很多 UDP-糖基转移酶与不同的底物有很高
的亲和力,酶可能识别受体分子的某些特定的基团
而不是整个分子[5,24]。Richman等(2005)从甜叶菊的
EST中分离了几个UGTs基因,体外活性分析表明,
其中有3个UGTs(UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1)参
与了甜菊糖苷和甜菊苷A的生物合成,并分离和鉴
定了编码这3个酶的基因[8]。Humphrey等(2006)用甜
叶菊叶片蛋白粗提物作用不同的甜菊醇衍生物,分析
叶片粗提物中3个UGTs酶的活性,利用Western杂
交,发现了 UGT85C2和 UGT76G1蛋白的存在,而没
有检测到UGT74G1蛋白[24]。
使用 TMHMM程序对 UGTs的氨基酸序列进行
预测,发现 UGT85C2的 N-端含有一个转膜结构域,
说明它可能是一个膜定位蛋白。每一个 UGT的 N-
端融合 GFP后,在洋葱表皮细胞瞬时表达,同时在
拟南芥中稳定表达,结果表明,融合蛋白分散于细
胞质中,有向细胞核集中的趋势;将 UGTs和 SrKO1
分别与 CFP和 YFP融合,定位研究表明,也得到同
样的结论。UGTs定位于整个细胞质中,而 SrKO1定
位于 ER中[24]。
将 3个 UGTs基因与 GFP分别融合后,转化拟
南芥,提取转化植株和非转化植株叶片蛋白粗提
物,体外进行酶活鉴定。非转化植株的叶片蛋白粗
提物,能将甜菊醇的 C-19糖基化,而不是形成甜菊
单苷;能将甜菊单苷和甜菊双苷分别糖基化形成甜
茶素(rubusoside)和甜菊糖苷(图 4)。UGT74G1转化
株的叶片蛋白粗提物仍然保持其特异性。而
UGT85C2和 UGT76G1转化株的叶片粗提物可能与
拟南芥内源 AtUGT存在互作(图 4)。总的来讲,在
甜叶菊中甜菊醇的 C-13位的糖基化由 UGT85C2
完成;C-19位的糖基化由 UGT74G1完成;C-13位
C3′糖基化由 UGT76G1完成;从甜菊单苷到双苷的
UGT还没有克隆到[5,24]。
4 甜菊糖苷的应用及前景
甜菊醇糖苷甜度高且热量低,甜叶菊中含有
14种微量元素、32种营养成分,因此它既是理想的
低热天然糖源,又是很好的营养来源。甜菊醇糖苷
作为一种新型天然的甜味剂已广泛应用于各类食
品、饮料、餐桌佐料、酱菜、罐头、蜜饯、果脯、糕点、
口香糖和牙膏等,用甜菊醇糖苷代替部分蔗糖不会
降低产品质量,且其成本比蔗糖低 50%以上,既可
实现低糖化,改善食品口感,还可以延长食品保藏
期。另外,它还有预防糖尿病、肥胖病及小儿龋齿等
疾患的作用。榨糖后的甜菊叶残渣含有多种营养成
分,如粗蛋白、粗纤维、粗脂肪及微量元素等,可提
取微晶纤维素、作饲料、肥料及食用菌的培养基等。
近年来,随着生物化学和基因组学的发展,甜菊醇
糖苷生物合成途径中的大多数基因已经分离、测序
并对其功能进行了初步的研究,为甜叶菊的有效成
表1 甜叶菊叶片蛋白粗提物对甜菊醇衍生物的糖基化作用
图 4 甜菊糖苷糖基转移酶在拟南芥中活性
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备条件。另外,目前已有至少 70种食用菌的原生质
体分离培养被报道,而真正形成较稳定的融合子仅
有侧耳属、香菇属中的少数种类[2]。因而,目前食用
菌原生质体融合育种技术尚处于探索阶段。
国内外的相关研究得到核融合菌株的极少,而
偶然得到的核融合菌株均被淘汰或忽视,但在远缘
杂交中,为避免异核不稳定的现象,促使双亲细胞
核融合是今后的发展方向之一。原生质体融合育种
研究理论上将向融合子菌株形成子实体的遗传机
制、基因调控机理纵深方向探讨;技术上将广泛应
用现代分子生物学技术鉴别融合子;育种将向目
间、纲间等远缘融合方向迈进。原生质体融合技术
已经为遗传操纵、基因育种、基因定位、酶的定位、
细胞壁的合成提供了一种重要工具。随着人们对原
生质体融合技术研究的进一步深入,这项技术必将
成为现代生物学研究的最重要领域之一。
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倪万潮等:甜菊醇糖苷生物合成及关键酶研究进展 53