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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 9期
箭筈豌豆两个肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析
张磊 刘志鹏 张吉宇
张妙青
王彦荣
(兰州大学草地农业科技学院,兰州 730000 )


摘
要:
通过同源克隆获得了箭筈豌豆两个不同的 Actin基因片段, 为研究该箭筈豌豆其它基因的表达状况提供了内
标参照。根据近缘物种 Actin基因序列设计一对引物, 通过 RT
PCR技术分别从叶片和果实材料中克隆获得了两条不同的
Ac tin基因片段。生物信息学分析表明,叶片中克隆的片段长度 604 bp,编码 201个氨基酸;果实中克隆的片段长度 677 bp,编
码 225个氨基酸。两条序列与其它物种 Actin基因的碱基序列相似度高于 80% ,氨基酸序列相似度高于 93%。将来自叶片和
果实的两条序列分别命名为 VsACT7和 VsACT11, 并在 GenBank注册, 登录号分别为 HM004434和 GU946218。
关键词:
箭筈豌豆 Actin基因 RT
PCR 同源克隆
C loning and Sequencing of Two Actin Genes from Vicia sativa
Zhang Lei L iu Zhipeng Zhang J iyu ZhangM iaoqing
W angYanrong
( School of PastoralAgriculture Science and T echnology, Lanzhou University, Lanzhou 730000)


Abstrac:t
To prov ide in ternal standard fo r expression ana ly sis of othe r g enes, a partial sequence of actin gene w as iso lated from
comm on ve tch ( V icia sativa). In th is study, a pair o f pr im ers was designed according to hom o logous actin g enes am ong c lo se ly related
p lants, and then the reverse transcr iption PCR ( RT
PCR ) w as pe rform ed. Then two d ifferent sequences w ere deprived from leaf and
fru it, respec tive ly. H om o log ical ana ly sis show ed that the sim ilar ity betw een two sequences and o ther actin sequences w ere over 80% in
nuc leo ride leve,l wh ile 93% in an imo ac id leve.l So the two sequences w ere considered to be different copies of actin gene in Vicia sati

va. They we re nam ed as V sACT7 and VsACT11 respectiv ely, and subm ited to GenBank ( accession num ber: HM 004434, GU946218).
Key words:
Comm on vetch( Vicia sativa) A ctin gene
RT
PCR H om o
cloning
收稿日期: 2010
03
22
基金项目:国家基础研究发展计划
973
项目 ( 2007CB108904) ,兰州大学中央高校基本科研业务费专项资金项目 ( lzu jbky
2009
4 ) ,
十一五

国家科技支撑计划子课题 ( 2008BADB3B03
4 )
作者简介:张磊,男,在读硕士,研究方向:牧草分子生物学; E
m ai:l p lan ta@ yeah. net
通讯作者:王彦荣,女,教授,博士生导师,研究方向:牧草种子及种质资源; E
m ai:l w angyrlzu@ 126. com
肌动蛋白 ( A ctin)基因是普遍存在于真核细胞
内的一类基因,它广泛参与了细胞形态建成,细胞极
性建立,细胞物质运输,以及基因表达调控等诸多生
命过程 [ 1, 2]。目前, 已在拟南芥 (A rabidop sis thali

ana )、水稻 ( Oryza sa tiva )、玉米 (Z ea may s)、大豆
(G lycine max )、马铃薯 ( Solanum tuberosum )、胡萝卜
(Daucus carrot )、豌豆 (P isum sativa )、苜蓿 (M edicago
sativa )、花生 (Arachis hypogaea)等植物中克隆了 A c

t in基因。Actin基因在进化上具有高度保守性 [ 3 ] ,
并且在不同组织以及相同组织的不同生理状态下恒
定表达, 因而常被用作研究基因表达状况的内参
基因 [ 4, 5]。
箭筈豌豆 ( Vicia sativa )是豆科野豌豆属一年生
植物,具有较高的饲用价值和较强的抗寒特性 [ 6]。
为解决我国青藏高原地区缺乏冬春季蛋白饲料的难
题, 兰州大学草地农业科技学院南志标院士于 1998
年自国际干旱农业研究中心 ( ICARDA ) 引进了 9
个箭筈豌豆 ( Vicia sativa )品系 [ 7]。经过多年选育,
其中 3个品系表现出稳定的遗传特征和良好的生产
特性 [ 8, 9] ,具有进一步的育种潜力。以前的研究发
现,经过 5年选育的箭筈豌豆与原种相比,其生态适
应性和形态特征发生了明显变化 [ 10] , 并且过氧化物
酶同工酶酶带暗示了短期驯化过程中分子水平上的
改变 [ 9]。进一步的分子生物学研究将揭示相关基
2010年第 9期 张磊等:箭筈豌豆两个肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析
因在这一过程中的表达变化,并为通过分子手段加
快育种过程提供条件。然而,关于箭筈豌豆的 A ctin
基因却鲜有报道。鉴于此, 箭筈豌豆 A ctin基因的
克隆将为这些工作的展开奠定基础。
1
材料与方法
1
1 材料
1
1
1
植物材料
箭筈豌豆采用引进品系 2560,
种子在兰州大学草地农业科技学院试验地盆栽,采
集成熟叶片及幼嫩果实, 液氮处理后于 - 80
超低
温保存。
1
1
2
试剂
RN easy Plant M in i K it ( Q IAGEN ),
PrimeScript
TM
RT
PCR K it( TaK aRa) , DNA凝胶回收
试剂盒, pGM
T 克隆试剂盒, DH5
感受态细胞,
DNAM arker均购自天根生化科技 (北京 )有限公司。
引物由北京赛百盛生物工程公司合成。其它试剂采
用国产或进口分析纯。
1
2 方法
1
2
1
引物设计
检索 NCBI上已公布的 A ctin序
列信息,选取与箭筈豌豆亲缘关系较近物种的 A ctin
蛋白序列进行比对找出高度同源区域, 用 Primer
Prem ier 5
0进行引物设计。确定一对引物: P1: 5


TTGGCCGACCTCGTCATACTGG
3
, P2: 5

GACTTCT

GGGCAACGGAACCTC
3
,预测片段长度为 677 bp。
1
2
2
总 RNA的提取
参照 RN easy PlantM in iK it
(Q IAGEN )使用说明分别提取箭筈豌豆成熟叶片和
果实总 RNA, 产物用紫外分光光度计进行纯度测
定,通过琼脂糖凝胶电泳检验 RNA完整性。
1
2
3
RT
PCR扩增
cDNA第一链合成参照 Pri

meScript
TM
RT
PCR K it ( TaKaR a)使用说明, PCR反
应体系 50
L: 10
PCR Bu ffer, 5
L; dNTP M ix ture
( 10mmo l /L ), 2
L; Ex Taq HS ( 5 U /
L) , 0
5
L;
引物 P1和 P2各 1
L。反应程序: 94
预变性 1
m in, 然后以 94
30 s, 55
30 s, 72
1m in进行 30
个循环,于 72
延伸 10 m in, 取 5
L扩增产物用
1
5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1
2
4
阳性克隆的筛选与鉴定
PCR产物进行琼
脂糖凝胶回收后克隆在 pGM
T, 转化 DH5
感受
态细胞, 经过蓝白斑筛选挑取阳性克隆, 经过 PCR
鉴定后送上海生工生物工程有限公司进行测序。
1
2
5
序列的生物信息学分析
序列翻译, 多重
比对通过 DNAMAN软件进行, 在 NCB I ( http: / /
b las.t ncb.i n lm. n ih. gov /B las.t cg i) 网站上进行
B last检索, 用 C lusta l进行聚类后, 用 DAMBE绘制
进化树。
2 结果与分析
2
1
总 RNA的提取及检测
分别提取叶片和果实总 RNA后, 经 1%琼脂糖
凝胶电泳检测, 结果显示两份总 RNA 材料 28S
rRNA、18S rRNA条带清晰, 且前者亮度约为后者 2
倍 (图 1) , 表明所提取 RNA完整性较好。经 NAN

ODROP1000紫外分光光度计检测, 叶片总 RNA
OD260 /OD280、OD260 /OD 230分别为 1
92、2
11; 果实
总 RNA OD 260 /OD280、OD 260 /OD230分别为 1
95、
2
07。说明两份 RNA 材料纯度较高。所提取
RNA可以用于后续试验。
1.叶片总 RNA; 2.果实总 RNA
图 1 箭筈豌豆荚果总 RNA 1%琼脂糖凝胶电泳图
2
2
RT
PCR扩增
以总 RNA反转录得到的 cDNA第一链做为模
板,用引物 P1和 P2扩增 Actin基因片段。琼脂糖凝
胶电泳分析发现,叶片总 RNA模板扩增产物约在 600
bp附近有一亮带,而果实总 RNA模板扩增产物片段
略大,约 700 bp(图 2)。推测可能在不同组织中克隆
到了不同的 A ctin基因片段,结果有待进一步鉴定。
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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 9期
图 2 RT
PCR产物凝胶电泳图
2
3
阳性克隆的鉴定
将目的片段切胶回收, 连接至 pGM
T载体, 转
化 DH5
感受态细胞, 通过蓝白斑筛选随机挑取阳
性克隆提取质粒,提取质粒进行 PCR鉴定 (图 3) ,
目的产物大小与 RT
PCR结果一致。将样本送往上
海生工测序。
M. DNA m ark er; 1. V sACT7阳性克隆; 2. V sACT11阳性克隆
图 3 阳性克隆的 PCR鉴定
2
4
测序结果及序列分析
测序结果显示,叶片总 RNA模板克隆片段长度
604 bp, 编码 201个氨基酸 (图 4) ;果实总 RNA模板
克隆片段长度 677 bp, 编码 225个氨基酸 (图 5)。
B last比较结果显示: 2条片段与多种植物 Actin核
酸序列相似度高于 80% ,编码氨基酸序列的相似度
高于 93%,表明克隆获得的 2条片段来自箭筈豌豆
Act in基因的不同拷贝。通过与拟南芥 (Arabidop sis
thaliana ) 10个 A ctin基因的比对发现, 在叶片中获
得片段和在果实中获得的片段分别与 A tACT7基因
和 A tACT11基因具有最高的氨基酸序列相似度, 分
别为 98% 和 94%。故分别将两条基因命名为 Vs

ACT7和 VsACT11,在 GenBank注册, 登录号分别为
HM004434和 GU946218。
将预测的两个箭筈豌豆 Actin基因片段的氨基
酸序列与大豆 ( AAB40079
1), 烟草 ( BAD27408
1),
拟南芥 ( NP _187818
1, NP _196543
1 ), 水稻 ( BAB
63635
1) ,玉米 (NP_001150462
1)和豌豆 ( P30164
1)
的 Actin氨基酸序列进行多重比较 (图 6)。发现在
199个位点上,两个基因片段的保守位点为 180个,非
保守位点为 19个, 说明我们克隆到的片段为箭筈豌
豆 A ct in基因的高度保守区域。基于氨基酸序列的进
化分析表明 (图 7), VsACT7与豌豆 PsACT1基因亲缘
关系最近,并与拟南芥 A tACT7基因聚类为一个最大
的进化分支;而 V sACT11与大豆 GmACT基因亲缘关
系最近,与拟南芥 A tACT11基因的关系不明晰。
3 讨论
不同物种的肌动蛋白基因可能起源于同一祖
先, 无论核苷酸序列还是氨基酸序列在进化上都有
较高的保守性 [ 3, 11]。我们克隆到的两条箭筈豌豆
Act in基因片段 V sACT7和 VsACT11与多个物种的
Act in基因相比,核苷酸水平相似度高于 80%, 氨基
酸水平相似度高于 93%。上述结果进一步证实了
前人的结论。
通过在高海拔地区的多年驯化, 引种品系的箭
筈豌豆与原种相比表现出抗寒性增强, 生育期缩
短 [ 9] , 裂荚率降低, 以及种子质量和单个种荚种子
数增加 [ 10]等一系列与环境适应及人工选择相关的
变异。尽管同工酶分析在一定程度上从分子的角度
解释了部分变异产生的原因, 但是设法找到控制这
些性状的基因并对它们的功能进行深入研究将更加
促进今后育种工作。基于此, 我们已经克隆获得了
3个与箭筈豌豆引种驯化相关的基因 (数据未公
布 )。A ctin基因序列的获得将为通过 Realtime PCR
等技术分析这些基因的表达提供内标参照。
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2010年第 9期 张磊等:箭筈豌豆两个肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析
图 4 箭筈豌豆 V sACT7基因片段的核苷酸序列及推测的氨基酸序列
图 5
箭筈豌豆 VsACT11基因片段的核苷酸序列及推测的氨基酸序列
高等植物 A ctin基因是一类多拷贝基因, 目前
在拟南芥中已证实存在 10个 A ctin基因, 而豌豆中
A ctin基因多达 18个 [ 12]。相关研究发现, 尽管这些
基因来源于同一祖先基因, 具有高度保守的结构特
征,但是它们的表达仍然存在组织特异性 [ 13, 14 ]。例
如,拟南芥的 10个肌动蛋白基因可以按照组织表达
特性分为营养体型和生殖体型两个亚类。这些发现
暗示, 作为内参基因实用的 Actin基因的选择应十
分谨慎。
值得注意的是, 通过与拟南芥 A ctin基因家族
10个成员的氨基酸序列比对, 我们发现在箭筈豌豆
叶片中获得的 V sACT7与拟南芥营养体型肌动蛋白
A tACT7具有较高的相似度, 为 98%; 而在幼嫩荚果
中获得的 V sACT11与拟南芥生殖体型肌动蛋白
A tACT11的相似度为 94%。这一结果暗示了箭筈
豌豆 Act in基因的不同拷贝在不同组织间的表达差
异。因而,必须选取不同器官来源的材料做进一步
的表达分析,才能最终确定两个基因作为内参基因
的应用潜力。
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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 9期
图 6 V sACT7, V sACT11氨基酸序列片段与其它植物 Actin基因的氨基酸序列多重比较
图 7 V sACT7, V sACT11氨基酸序列片段与其它植物 Actin基因的进化树分析
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2010年第 9期 张磊等:箭筈豌豆两个肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析
参 考 文 献
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