全 文 ：ChineseJournalofNewDrugs2009, 18(10)
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中国新药杂志 2009年第 18卷第 10期
[基金项目 ] 　国家自然科学基金项目(30472026),国家中央级公益性科研院所基本科研业务专项(IMBF-20060201)
[作者简介 ] 　赵培 ,女 ,硕士研究生。联系电话:(010)83162728, E-mail:peipei fay@yahoo.com.cn。
[通讯作者 ] 　司书毅 , 男 ,研究员 ,博士生导师 ,联系电话:(010)63180604, E-mail:sisyimb@hotmal.com;洪斌 , 女, 研究员 ,博士生导师。联系
电话:(010)63028003, E-mail:binhong69@hotmal.com。
·实验研究·
刺芒柄花素调节血脂代谢及改善动脉粥样硬化病变的实验研究
赵　培 ,杨　媛 ,徐　扬 ,李　雪 ,张　晶 ,姜　威 ,洪　斌 ,司书毅
(中国医学科学院 北京协和医学院医药生物技术研究所 ,北京 100050)
　　[摘要 ] 　目的:研究刺芒柄花素上调 SR-BI蛋白表达和影响血脂代谢 、肝脏脂肪化及动脉粥样硬化病
变作用。方法:利用高通量筛选模型评价刺芒柄花素对 CLA-1/hSR-BI蛋白基因的转录激活效用。通过高
脂饲料喂养金黄地鼠 21 d,建立实验性高脂血症动物模型 。给予不同剂量的刺芒柄花素 , 28 d后测定血浆总
胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白 -胆固醇(LDL-C)及高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)含量。组织
切片 HE染色观察肝脏病变 ,胸主动脉硬化情况。结果:刺芒柄花素可以在一定程度上降低高脂血症金黄地
鼠血清 TC, TG和 LDL-C,升高 HDL-C;改善肝脂肪化 、减轻炎性细胞浸润;抑制胸主动脉壁内膜下泡沫细胞
形成和中膜平滑肌增生 。结论:刺芒柄花素具有调节体内血脂代谢 ,抑制肝脏脂肪沉积和预防动脉粥样硬化
效果。
[关键词 ] 　刺芒柄花素;HDL受体 /SR-BI蛋白;高通量药物筛选;高脂血症金黄地鼠;动脉粥样硬化
[中图分类号 ] R969.4　　[文献标识码 ] A　　[文章编号 ] 1003 -3734(2009)10 -0925 -05
Efectofformononetinonabnormallipidmetabolismandatherosclerosis
ZHAOPei, YANGYuan, XUYang, LIXue, ZHANGJing, JIANGWei, HONGBin, SIShu-yi
(InstituteofMedicinalBiotechnology, PekingUnionMedicalColegeandChinese
AcademyofMedicalSciences, Beijing100050, China)
[ Abstract] 　Objective:Formononetinwasfoundtobeanup-regulatorofSR-BIexpressionbyacel-based
highthroughputscreening.Hereweexaminedwhetherformononetinafectsbloodlipidmetabolism, atherosclerosis
andhepaticlipogenesisinhypercholesterolemichamsters.Methods:Firstly, formononetinwasfurtherevaluatedfor
itsup-regulatingactivityofSR-BIexpressioninacel-basedhighthroughputscreeningmodel.Then, hypercholes-
terolemiaingoldenhamsterswasinducedbyfeedingahigh-fatdietfor21 days, andthehamsterswereadministra-
tedwithdiferentdosesofformononetin.ThelevelsofTC, TG, LDL-C, andHDL-Cinserumwereanalyzed.Fi-
naly, pathologicalchangesofliverlipogenesisandatherosclerosisinaortathoracaliswereexamined.Results:For-
mononetinobviouslyreducedthelevelsofTC(P<0.05), TG(P<0.01)andLDL-C(P<0.01), andincreased
thelevelsofHDL(P<0.05)ascomparedwithcontrolhypercholesterolemichamsters.Pathologicalexamination
showedthatformononetinatenuatedhepaticcelsteatosisandinflammatorycelrecruiting;italsoreducedaccumu-
lationoffoamycels, andrestrainedthehyperplasiaofsmoothmusclecelsinaortawal.Conclusion:Formonone-
tincanmodifylipidmetabolisminhypercholesterolemichamstersbyreducingTC, TGandLDL-C, increasingHDL-
C, andatenuatinghepaticlipogenesisandatherosclerosis.Therefore, itmaybeapotentialdrugcandidateorlead
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compoundforanti-atherosclerosisthroughnewtargets.
[ Keywords] 　formononetin;HDLreceptor/SR-BIprotein;high-throughputscreening;hypercholesterol-
emia;hamster;lipidmetabolism;atherosclerosis
　　心血管疾病是危害人类健康的主要杀手 ,而动
脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是多种严重心血管
疾病的病理基础。目前临床上广泛应用的他汀类药
物可以降低 20% ～ 40%的心血管事件 [ 1] 。为进一
步降低心血管疾病的危害 ,需要在降低低密度脂蛋
白胆固醇 (LDL-C)的同时从预防和 /或逆转 AS病
灶的新治疗靶点出发来寻找具有新型作用机制的药
物 。高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein, HDL)的
抗动脉粥样硬化作用主要基于 HDL参与的胆固醇
逆转运(reversecholesteroltransport, RCT)过程 ,而清
道夫受体 BI(scavengerreceptorclassBtypeI, SR-
BI)已被确定为功能性的 HDL受体 [ 2] ,并被认为是
心血管药物的潜在新靶点 [ 3] 。因此可以通过升高
SR-BI表达水平来增强 RCT和促进 AS病灶的逆
转;能升高 SR-BI基因表达的化合物能加速 RCT,有
利于 AS病灶积蓄的胆固醇减少 ,促进富余胆固醇
酯的清除 ,有望成为治疗动脉粥样硬化性心血管疾
病新型药物的先导物 [ 4-6] 。
利用本实验室已建立的 HDL受体 CLA-1(人
SR-BI蛋白)表达上调剂高通量筛选模型 [ 7-9] ,筛选
了 2 600种纯的天然产物及合成化合物 [ 10] ,发现刺
芒柄花素可激活 SR-BI蛋白转录 。刺芒柄花素 [ 7-
羟基-3-(4-甲氧基苯基)色酮 ]为异黄酮类化合物 ,
是红车轴草提取物成分之一 。饮食添加红车轴草提
取物可调节绝经期妇女血脂代谢 [ 7] 。
本实验目的在于利用高通量筛选模型评价刺芒
柄花素对 CLA-1 /hSR-BI蛋白的转录激活效用 ,并
通过建立实验性金黄地鼠高脂血症病理模型 [ 11] ,观
察刺芒柄花素对体内胆固醇及脂蛋白 -胆固醇代谢
的影响 ,是否可以纠正由高脂血症引起的血脂代谢
异常 ,以及是否可以改善肝脏脂肪沉积 ,炎性病变 ,
预防 AS病灶形成和发展 。
材料与方法
1　材料
1.1　细胞株　表达人 HDL受体 CLA-1上游调控序
列(-1055 ～ 62bp)-荧光酶素报告基因稳定转染细
胞株 CLAP-LUCHepG2, 是以细胞为基础的 SR-BI
蛋白上调剂高通量筛选模型 ,由中国医学科学院医
药生物技术研究所国家新药筛选实验室构建 , MEM-
EBSS培养基 +10%胎牛血清 , 600 μg·mL-1 G418
维持培养。
1.2　动物　金黄地鼠(叙利亚地鼠)(120 ±20)g,
雄性 ,由北京维通立华实验动物技术有限公司提供 。
饲养于中国医学科学院医药生物技术研究所 SPF
级动物房 ,每日光照 12 h,并于实验开始前 1周适应
饲养。
1.3　饲料　高脂饲料配方:78.8%基础饲料 +1%
胆固醇 +10%蛋黄粉 +10%猪油 +0.2%胆酸钠 。
由中国医学科学院实验动物研究所提供 ,并进行钴
60照射灭菌。
1.4　主要试剂 、药品及器材　刺芒柄花素购自陕西
慧科植物开发有限公司(纯度 >98%);MEM-EBSS
培养基 、标准胎牛血清购自美国 Hyclone公司;G418
购自 Sigma公司;荧光酶素检测试剂盒(Luciferase
AssaySystem)购自 Promega公司;辛伐他汀购自杭州
默沙东制药有限公司;血清胆固醇(TC)、三酰甘油
(TG)、LDL-C、高密度脂蛋白 -胆固醇(HDL-C)生化试
剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司;荧光检测
仪 BMGpolarstarGalaxy多功能分析测试仪;日立
7060全自动生化分析仪。
2　方法
2.1　CLA-1表达上调模型转录激活的测定　消化
对数生长期的 CLAP-LUCHepG2细胞 ,计数以 5 ×
10
5·mL-1 ,接种 96孔板 ,加入 100 μL单细胞悬液 。
细胞充分贴壁后 ,移去含血清培养基 ,用 PBS漂洗 1
次 ,每孔再加入不含血清培养基 MEM-EBSS200
μL,加入用 0.1%DMSO溶解的刺芒柄花素 ,同时空
白对照孔加入相应浓度的 DMSO,以罗格列酮处理
组(10 μmol·L-1)作为阳性对照组。 37 ℃, 5% CO2
培养 18 ～ 24 h后移去培养基 ,按照 LuciferaseAssay
System的操作方法测定细胞荧光酶素的活性。
2.2　高脂血症病理模型的建立及给药　将金黄地
鼠随机分成 6组 ,每组 10只 。正常对照组(NC),给
予普通饲料 ,其余为高脂饮食组 ,给予高脂饲料。饲
养 21 d,禁食 12 h后内眦静脉采血测定血脂 ,再按
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血脂水平将高脂饮食组随机分为 5组:①模型对照
组(MC), ig生理氯化钠溶液 。 ②刺芒柄花素低剂
量组:ig50 mg·kg-1·d-1。③刺芒柄花素中剂量组
ig100mg·kg-1·d-1。 ④刺芒柄花素高剂量组:ig
200 mg·kg-1·d-1。 ⑤阳性药辛伐他汀组:ig3 mg·
kg-1·d-1。 22 d起按照组别给予药物(或生理氯化
钠溶液)28 d,同时给予正常对照组普通饲料 ,其余
各组维持高脂饲养 。
2.3　血脂及脂蛋白测定 　末次给药 ,动物禁食
12 h后 ,内眦静脉取血 , 分离血清。酶法测定 TC,
TG, LDL-C, HDL-C,用全自动生化分析仪一步直接
测定 。
2.4　实验动物肝脏 、胸主动脉病理切片制作　给药
后 30 d,颈椎脱臼法处死实验动物 。取肝脏 、胸主动
脉 ,用 10%甲醛固定 ,石蜡包埋 , 4 μm切片 , HE染
色 ,观察肝脏组织病变 ,胸主动脉壁病理改变 ,并依
据通用半定量肝脏病理评分标准 ,对肝脏损伤进行
积分 ,病理积分标准如下:肝脏水样变性积 1.00分 ,
脂肪样空泡形成积 2.00分 ,炎性细胞浸润积 1.00
分 ,嗜酸性变积 1.00分 ,坏死积 3.00分 。
3　数据统计分析
实验数据通过统计软件 SPSS10.0处理 ,实验
结果均采用组间差异比较 t检验 。
结　　果
1　刺芒柄花素对 CLA-1基因转录激活的影响　
　　刺芒柄花素以微摩浓度激活 CLA-1基因上游
调控序列转录 ,并以剂量依赖方式增加 CLAP-LUC
HepG2细胞荧光酶素活性。刺芒柄花素在 5.00
μmol·L-1浓度时 ,其上调 CLA-1表达活性达最高值
219.36%,其 EC50值为 0.31 μmol·L-1。
图 1　刺芒柄花素在 CLA-1表达上调剂筛选
模型中的量效关系曲线
2　刺芒柄花素对实验性高脂血症金黄地鼠血脂代
谢的影响
与空白对照组比较 ,模型对照组可见血清 TC,
TG, LDL及 HDL含量明显升高(P<0.01),表明金
黄地鼠高脂血症模型建立成功 。与模型对照组相
比 ,刺芒柄花素 50 , 100 , 200 mg·kg-1·d-1可以明显
降低血清 TC(P<0.05), TG(P<0.01), LDL(P<
0.01),升高 HDL(P<0.05或 P<0.01),结果见
表 1。
表 1　给药 28 d后各组金黄地鼠血脂及载脂蛋白含量 x±s, mmol·L-1
组　别　 剂量 /mg·kg-1·d-1 TC/mmol·L-1 TG/mmol·L-1 LDL-C/mmol·L-1 HDL-C/mmol·L-1
正常对照组 — 3.79 ±0.47 0.95±0.19 0.74±0.05 2.542±0.43
模型对照组 — 45.99 ±14.10a 21.25±8.80a 17.49±4.19a 6.03±0.512a
刺芒柄花素低剂量组 50 24.03 ±10.09b 6.39±3.31c 7.19±3.51c 7.80±0.82c
刺芒柄花素中剂量组 100 24.79 ±12.42b 5.31±3.06c 7.20±2.60c 7.69±1.15b
刺芒柄花素高剂量组 200 22.50 ±8.70b 3.20±1.78c 6.53±3.06c 7.48±0.56c
阳性药辛伐他汀组 3 24.46 ±7.47b 3.23±1.87c 8.47±2.88c 7.67±0.76b
　　模型对照组与正常对照组相比a:P<0.01;给药组与模型对照组相比b:P<0.05;给药组与模型对照组相比 c:P<0.01
3　刺芒柄花素对实验性高脂血症金黄地鼠肝脏的
保护作用
各组金黄地鼠肝脏标本固定切片后 HE染色 ,
观察肝组织病变情况。结果显示正常对照组 10只
金黄地鼠未见肝脏组织异常改变 ,模型对照组 10只
金黄地鼠均可见肝细胞明显肿胀 ,水样变形 ,可见散
在或灶性肝细胞气球样变 ,细胞核皱缩或者崩解 ,有
脂肪样空泡形成;肝窦缩小或消失;肝间质灶性或小
片状或散在炎性细胞浸润;小叶周边或汇管区有纤
维细胞增生 。刺芒柄花素各给药组 10只金黄地鼠:
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肝脏可见轻微水肿 、气球样变 ,未见脂肪样空泡形
成;肝间质可见少量炎性细胞浸润或纤维细胞增生。
阳性药辛伐他汀组 10只金黄地鼠肝组织均可见较
为轻微脂肪变性 ,水样变性 ,肝间质少量炎性细胞浸
润及纤维组织增生 。见图 2。肝脏损伤积分经 t检
验 ,刺芒柄花素各剂量组和阳性药组与模型对照
组比较均差异有显著性(P<0.05或 P<0.01),
见表 2。
表 2　给药 4周后各组金黄地鼠肝组织
损伤积分表 x±s
组　别　 动物数 肝组织损伤积分
正常对照组 10 —
模型对照组 10 6.50 ±0.50a
刺芒柄花素低剂量组 10 5.20 ±0.87b
刺芒柄花素中剂量组 10 5.30 ±0.57c
刺芒柄花素高剂量组 10 5.10 ±0.82b
阳性药辛伐他汀组 10 5.25 ±0.68b
　　模型对照组与正常对照组相比 a:P<0.01;给药组与模型对照组相比 b:
P<0.05;给药组与模型对照组相比 c:P<0.01
图 2　各组金黄地鼠肝组织病理学观察(HE染色 ×100)
4　刺芒柄花素对实验性高脂血症金黄地鼠动脉粥
样硬化形成的预防作用
各组金黄地鼠胸主动脉标本固定切片后 HE
染色 ,观察胸主动脉壁病变情况。结果显示正常
对照组 10只金黄地鼠主动脉内膜 、中膜 、外膜未
见异常改变 。模型对照组 10只金黄地鼠主动脉
壁均可见泡沫细胞浸润(脂纹期),脂斑形成;中膜
平滑肌细胞肿胀 、肥大或增生 , 弹性纤维紊乱;外
膜未见异常改变 。刺芒柄花素各给药组 10只金
黄地鼠主动脉壁均可见少量泡沫细胞形成 ,未见脂
质斑块形成 ,中膜平滑肌轻度增生;外膜未见异常 。
阳性药辛伐他汀组 10只金黄地鼠中部分动物
(6/10),内膜未见异常改变;中膜平滑肌轻微肿胀;
外膜未见异常改变 。可见 ,刺芒柄花素对实验性高
脂血症金黄地鼠的 AS病变的发生发展有一定的抑
制作用 。
图 3　各组金黄地鼠胸主动脉壁病理学观察(HE染色 ×100)
讨　　论
AS是缺血性心 、脑血管病的主要病理基础 ,防
止 AS的发生及促使 AS的消退是降低心脑血管病
发病率及死亡率的根本性措施。大量的流行病学和
临床研究表明:脂质代谢异常是 AS形成的重要因
素 ,血浆中低密度脂蛋白水平与 AS危险性呈正相
关 ,而高密度脂蛋白水平与 AS危险性呈负相关 [ 12] 。
因此 ,一种理想的降脂药应该能有效地调节脂质代
谢 ,既能降低 TC, TG, LDL-C, 又能升高 HDL的水
平 ,从而预防和 /或逆转 AS。近年来研究表明 , HDL
的抗 AS作用主要基于 HDL参与的胆固醇逆转运
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RCT过程 ,并确定 SR-BI为功能性的 HDL受体。
SR-BI在 RCT的起始和终末步骤都可以发挥相应作
用 ,即既可以促进胆固醇从外周细胞(如动脉壁中
的巨噬细胞和泡沫细胞)的流出 ,又可以促进肝脏
(调节胆固醇代谢的重要器官)中胆固醇的选择性
摄取。文献报道在 ApoE敲除小鼠中 ,如果 SR-BI
被敲除将更易发生 AS[ 13] ;在高脂饮食的 LDLR敲
除小鼠中过量表达 SR-BI将明显减少 AS损伤[ 14] 。
SR-BI不仅在 HDL的代谢中发挥了重要作用 ,它还
参与了 LDL或含载脂蛋白 B(apoB)的代谢[ 15] 。有
报道证明 SR-BI能够以较低的效率参与 LDL的选
择性摄取 , 并且在 SR-BI转基因小鼠中 , VLDL,
LDL, apoB的水平普遍降低 [ 16] 。因此 ,能升高 SR-BI
表达的化合物有可能成为有效治疗 AS性心血管疾
病新型药物的先导物。
本实验利用高通量筛选模型对刺芒柄花素激活
CLA-1(人 SR-BI蛋白)基因转录进行了评价;其明
显降低实验性高脂血症大鼠的 TC, TG, LDL,并升高
HDL,与模型对照组相比差异有显著性 ,证明了对血
脂代谢的良性影响 。刺芒柄花素的血脂调节作用在
3个实验组中并未呈现剂量依赖效应 ,是因为刺芒
柄花素主要通过加速胆固醇逆转运 ,清除血管壁过
多胆固醇酯转运到肝脏代谢 ,而血浆脂代谢受多因
素影响如:HMG-CoA还原酶活性和低密度脂蛋白受
体表达水平。病理结果显示刺芒柄花素在一定程度
上改善肝脏的脂肪化 、炎性病变 、纤维组织增生;抑
制高脂血症实验动物主动脉壁的泡沫细胞形成和平
滑肌细胞增生 ,预防和延缓动 AS的形成和发展。
说明刺芒柄花素通过上调 SR-BI蛋白的表达来减
轻外周组织胆固醇的蓄积 ,预防延缓 AS病灶的形
成 ,保护肝脏免于脂肪沉积 ,有望成为通过新作用
靶点治疗动脉粥样硬化性心血管疾病新型药物的
先导物 ,亦有可能应用于高脂血症合并的脂肪肝
治疗 。
[ 　参　考　文　献　]
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编辑:杨青 /接受日期:2009 -03-20