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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 7 期
细粒棘球蚴 FABP基因的原核表达及蛋白鉴定
郝慧芳1 王志钢1 高连山2 赵云龙1 白健1
金永1 周华从1 李洁1 陈献威1
(1内蒙古大学生命科学学院 哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室，呼和浩特 010021;
2鄂尔多斯职业学院，鄂尔多斯 017200)
摘 要: 构建原核表达载体 pET-FABP，优化表达条件，采用免疫学方法鉴定纯化的 FABP 融合蛋白。载体 pMD19-T-
FABP和 pET-44a(+)经 EcoR Ⅰ和 Hind Ⅲ双酶切，将回收的 FABP片段与 pET-44a(+)连接，构建原核表达载体 pET-FABP
并在大肠杆菌 BL21(DE3)中表达，优化表达条件，纯化 FABP融合蛋白，Western blotting鉴定。成功构建了原核表达载体 pET-
FABP并在大肠杆菌中高效表达。纯化后的蛋白经 SDS-PAGE 和 Western blotting鉴定正确。构建的表达载体 pET-FABP 可以
在大肠杆菌中大量表达 Nus-FABP 融合蛋白，为进一步研制 FABP 亚单位疫苗奠定了基础。
关键词: 细粒棘球蚴 脂肪酸结合蛋白 原核表达
Prokaryotic Expression and Identification of FABP Gene
from Echinococcus granulosus
Hao Huifang1 Wang Zhigang1 Gao Lianshan2 Zhao Yunlong1 Bai Jian1
Jin Yong1 Zhou Huacong1 Li Jie1 Chen Xianwei1
(1 The Key Laboratory of Mammal Reproductive Biology and Biotechnology，Ministry of Education，
College of Life Science，Inner Mongolia University，Hohhot 010021;2Ordos Vocation College，Ordos 017200)
Abstract: Expressing and purifying the FABP protein in E． coli BL21(DE3)followed by immunologic identification． The vector
pMD19-T-FABP and pET-44a(+)was digested by EcoR Ⅰand Hind Ⅲ，and the FABP fragment was subcloned into pET-44a(+)to
construct the prokaryotic expression vector pET-FABP． The Nus-FABP fusion protein was expressed in E． coli BL21(DE3)at an opti-
mized expression condition． The fusion protein was purified after identification by SDS-PAGE and followed by Western blotting． The re-
combinant vector pET-FABP was constructed expressed successfully in E． coli BL21(DE3)． Purified fusion protein was identified to be
the correct target protein by Western blotting． The constructed vector pET-FABP could express the Nus-FABP fusion protein successfully
with a high level under the optimized expression condition． This result facilitates the development research of FABP as a candidate vac-
cine molecule．
Key words: Echinococcus granulosus FABP Prokaryotic expression
收稿日期:2010-01-06
基金项目:国家基础科学人才培养基金项目(J0730648) ，内蒙古自治区高等学校科学研究项目( (NJ03122，NJ05041)
作者简介:郝慧芳，女，硕士研究生，研究方向:哺乳动物生殖学与生物技术;E-mail:200114065@ 163. com
通讯作者:王志钢，男，教授，研究方向:哺乳动物生殖生物学与生物技术;E-mail:lswzg@ imu． edu． cn
细粒棘球蚴病又称囊型包虫病(cystic echino-
coccosis，CE) ，是由细粒棘球绦虫的幼期细粒棘球
蚴寄生于人或动物体内引起的一类重要的、具有地
方流行性的人畜共患寄生虫病。内蒙古是我国囊型
包虫病发病较高的地区之一［1，2］，严重危害了当地
农牧民的身体健康。
寄生性蠕虫不能从头合成其自身的大多数脂
类，特别是长链脂肪酸和胆固醇，而是从宿主获得这
些分子，脂肪酸结合蛋白(fatty acid bining proteins，
FABP)在这一过程中起到重要作用［3］。已经分离的
几种寄生性蠕虫 FABPs 包括曼氏血吸虫的 Sm14［4］、
日本血吸虫的 SjFABPc［5］、肝片吸虫的 Fh15［6］和巨片
2010 年第 7 期 郝慧芳等:细粒棘球蚴 FABP基因的原核表达及蛋白鉴定
吸虫的 FgFABP 等［7］。研究表明，在不同的试验动
物模型中来自于不同蠕虫的 FABPs 均显示出有效
的保护性［8 － 10］。细粒棘球蚴的原头蚴中表达两种
脂肪酸结合蛋白，分别为 EgFABP1和 EgFABP2［11，12］。
Chabalgoity 等［13］利用 pTECH 载体原核表达 FABP
融合蛋白，从而成功构建了 rSt-FABP 疫苗。我们在
前期克隆细粒棘球蚴 FABP 基因的基础上，构建原
核表达载体，优化表达条件，以获得纯化的 FABP 蛋
白，为研制 FABP蛋白亚单位疫苗创造条件。
1 材料和方法
1. 1 虫株、质粒和菌种
细粒棘球蚴原头蚴采自内蒙古锡林郭勒盟屠宰
场羊肝脏，现场采集后立即放入液氮中，带回实验室
置 － 80℃保存。原核表达载体 pET-44a(+)和 E．
coli BL21(DE3)株由本院侯鑫博士惠赠，E． coli
DH5α 株和重组质粒 pMD19-T-FABP 由本实验室
保存。
1. 2 主要酶及生化试剂
LA TaqDNA 聚合酶、限制性内切酶(EcoRⅠ和
HindⅢ)、T4 DNA 连接酶、dNTP、DL2000、λ-EcoT14
Ⅰ、低相对分子量标准蛋白 Protein Molecular Weight
Marker(High)购自宝生物工程(大连)有限公司;
Mid-Range Protein Molecular Weight Markers 购自上
海生工生物工程技术服务有限公司;琼脂糖凝胶
DNA回收试剂盒购自 AXYGEN 公司;预染蛋白
Marker购自 Fermentas公司;蛋白纯化试剂盒(TAL-
ON Purification Kit)购自 Clontech 公司;6 × His单克
隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG 购自天根
生化科技(北京)有限公司;异丙基-β-D-硫代半乳糖
苷(IPTG)、丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、溶
菌酶、考马斯亮蓝 R250 购自 Sigma 公司;辣根过氧
化物酶标记羊抗人 IgG 购自北京博奥森生物技术有
限公司;DAB 购自 BIO BASIC INC 公司;确诊包虫
病患者血清由内蒙古医学院张莉博士惠赠，健康人
血清采自内蒙古自治区医院体检健康人群;常规试
剂为国产分析纯。
1. 3 原核表达载体 pET-FABP的构建
重组质粒 pMD19-T-FABP经由 EcoR Ⅰ和 Hind
Ⅲ双酶切，回收 FABP 基因片段，在 T4 DNA 连接酶
的作用下，与经相同双酶切的原核表达载体 pET-
44a(+)相连接，构建原核表达载体 pET-FABP(图
1)。转化 E． coli DH5α 感受态细胞，经氨苄青霉素
筛选阳性克隆，碱裂解法提取重组质粒，单、双酶切
和 PCR鉴定正确后送宝生物工程(大连)有限公司
测序。
图 1 重组质粒 pET-FABP的构建
1. 4 原核表达条件的优化
采用单因子法进行表达条件的优化，每项优化
结果用于后续试验。将重组质粒 pET-FABP 转化
E． coli BL21(DE3)感受态细胞，挑取阳性克隆接种
于 5 mL LB 培养基(100 μg /mL 氨苄青霉素，
0. 2% 葡萄糖)中，37℃，过夜培养，次日按 1 ∶ 100
接种到新鲜 LB 培养基中，诱导表达。表达条件优
化包括诱导前 OD600值、IPTG浓度、诱导时间、诱导
温度等因素。诱导表达后，离心收集菌体，超声破
碎细胞提取总蛋白，离心，取上清，10% SDS-PAGE
电泳检测。
1. 5 融合蛋白的纯化
采用 TALON Purification Kit 纯化 FABP 融合蛋
白。在优化的表达条件下大量诱导目的蛋白表达，
离心收集菌体，加入终浓度为 0. 75 mg /mL 的溶菌
酶，超声波破碎菌体，离心分离上清和沉淀，将上清
与树脂充分结合。按试剂盒操作程序纯化目的蛋
白，10% SDS-PAGE检测。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
1. 6 Western Blotting鉴定
纯化的蛋白样品经 10% SDS-PAGE 电泳分离、
转 PVDF膜，5%脱脂奶粉 TBST 37℃封闭 1 h。6 ×
His标签检测以鼠源 His-单抗(1∶ 2 500)为一抗，以
羊抗鼠 IgG-HRP为二抗。FABP 蛋白检测分别以包
虫病患者血清(1∶ 20)和健康人血清(1∶ 20)为一抗，
羊抗人 IgG-HRP 为二抗。一抗 4℃孵育过夜，二抗
室温孵育 1 h，DAB显色。
2 结果与分析
2. 1 表达载体 pET-FABP的构建
构建的重组质粒 pET-FABP经 PCR(图 2)及酶
切(图 3)鉴定，均获得了预期大小(402 bp)的目的
条带。测序结果显示基因与载体连接正确。
M． DL2000 Marker;1，2． PCR 产物
图 2 pET-FABP PCR产物电泳鉴定
M． λ-EcoT14 Ⅰdigest;1． Hind Ⅲ 单酶切;
2． EcoRⅠ + Hind Ⅲ 双酶切
图 3 pET-AgB8 /2 酶切电泳鉴定
2. 2 原核表达条件优化
在 pET-FABP 表达载体中，Nus 蛋白分子量约
为 66. 4 kD，FABP蛋白大小约 15. 2 kD，预期融合蛋
白的分子量约为 85. 78 kD。SDS-PAGE 结果(图 4)
显示，在预期位置获得了一条特异性条带，说明
pET-FABP重组载体在 E． coli BL21(DE3)成功地表
达了 Nus-FABP 融合蛋白。通过对诱导前 OD600、诱
导时间、IPTG 浓度和温度的优化，SDS-PAGE 分析
结果表明，FABP融合蛋白的最佳表达条件为:当菌
液 OD600值为 0. 8 时，加入终浓度为 0. 05 mmol /L的
IPTG，28℃，振荡培养 7 h(图 4) ，并且表达量占菌体
总蛋白的 25%以上。
1． BL21 菌体总蛋白;2． BL21 /pET-44a(+)菌体总蛋白;
3．蛋白标准分子量;4． BL21 /pET-FABP菌体总蛋白
图 4 FABP融合蛋白的 SDS-PAGE鉴定
2. 3 蛋白纯化
按试剂盒操作说明纯化蛋白，SDS-PAGE 分析
表明获得了较纯的目的蛋白(图 5)。
1．蛋白标准分子量;2． BL21 菌体总蛋白;3． BL21 /pET-
44a(+)菌体总蛋白;4，5． BL21 /pET-FABP纯化蛋白
图 5 蛋白纯化的 SDS-PAGE鉴定
2. 4 融合蛋白的 Western Boltting检测
纯化的 FABP融合蛋白带有 2 个 6 × His 标签，
以 Anti-His单克隆抗体检测纯化的蛋白，结果(图
6)表明 Anti-His 单抗可与融合蛋白特异性的结合。
用包虫病人手术前血清和健康人血清分别作为一
抗，Western Blotting 检测结果(图 7)表明 Nus-FABP
融合蛋白可特异性识别病人血清，而不能识别正常
人血清。说明获得了纯化的 FABP融合蛋白。
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2010 年第 7 期 郝慧芳等:细粒棘球蚴 FABP基因的原核表达及蛋白鉴定
1．蛋白标准分子量;2．纯化的融合蛋白
图 6 融合蛋白 His 单抗的Western Blotting分析
1．蛋白标准分子量;2．纯化的融合蛋白
图 7 确诊包虫病人血清为一抗的Western Blotting分析
3 讨论
寻找保护性抗原是包虫病疫苗研制中的关键问
题。目前普遍认为用来源于细粒棘球蚴的疫苗分子
构建重组疫苗预防中间宿主的感染是切实可行的控
制措施。Chabalgoity 等［13］构建的 rSt-FABP 疫苗不
仅可以诱导宿主 IgA，还可以诱导高水平的 IgG1 和
IgG2，显示了广阔的应用前景。我们在克隆细粒棘
球蚴 FABP基因［14，15］的基础上构建 FABP原核表达
载体，优化表达条件，纯化蛋白并进行血清学鉴定，
为进一步研究研制细粒棘球蚴 FABP 亚单位疫苗奠
定了基础。
许多研究表明细菌生长速率严重影响外源蛋白
的表达，因此必须对接种细菌量、诱导时间和诱导后
细菌密度进行控制。本试验通过对诱导时间、IPTG
浓度、诱导前菌液 OD600和诱导温度进行梯度优化，
大大提高了 FABP融合蛋白的表达量。用囊性包虫
病人血清和健康人血清对纯化的 FABP 蛋白进行
Western Blotting检测，表明该蛋白可特异性地识别
包虫病人血清中的抗体，这一结果确定了表达蛋白
的正确并具有实际应用价值。
参 考 文 献
［1］史大中． 中国囊性包虫病的地理分布． 地方病通报，2000，15:
74-75．
［2］蒋次鹏．我国包虫病流行近况．地方病通报，2002，17(3) :77-79．
［3］潘卫庆，汤林华． 分子寄生虫学［M］． 上海:上海科学技术出版
社，2004:345-369．
［4］Moser D，Tendler M，Griffiths G，et al． A 14kDa Schistosoma mansoni
polypeptide is homologous to a gene family of fatty acid binding pro-
teins． Biol Chem，1991，266(13) :8447-8454．
［5］Becker M，Kalinna BH，Waine GJ，et al． Gene cloning，overproduc-
tion and purification of a functionally active cytoplasmic fatty acid-
binding protein(SjFABPc)． Gene，1994，148(2) :321-325．
［6］Rodrguez-Perez J，Rodrigues-Medina JR，Garca-Blanco MA，et al．
Fasciola hepatica:molecular cloning，nucleotide sequence and ex-
pression of a gene encoding a polypeptide homologous to a Schistoso-
ma mansoni fatty acid binding protein． Exp Parasitol，1992，74(4) :
400-407．
［7］Smooker PM，Hickford DE，Vaiano S，et al． Isolation，characterization
and expression of a cDNA encoding a Fasciola gigantica fatty acid
binding protein． Exp Parasitol，1997，85(1) :86-91．
［8］Hyllier GV，Garcia MIR，Alicea H，et al． Successful vaccination a-
gainst murine Schistosoma mansoni infection with a purified 12kDa
Fasciola hepatica cross-reactive antigen． Am J Trop Med Hyg，1988，
38(1) :103-110．
［9］Tendler M，Brito CA，Vilar MM，et al． A Schistosoma mansoni fatty
acid-binding protein，Sm14，is the potential basis of a dual-purpose
anti-helminth vaccine． Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(1) :
269-273．
［10］Estuningsih SE，Smooker PM，Wiedosari E，et al． Evaluation of anti-
gens of Fasciola gigantica as vaccines against tropical fasciolosis in
cattle． Int J Parasitol，1997，27(11) :1419-1428．
［11］Esteves A，Dallagiovanna B，Ehrlich R． A developmentally regulated
gene of Echinococcus granulosus codes for a 15． 5-kilodalton poly-
peptide related to fatty acid binding protein． Mol Biochem Parasitol，
1993，58(2) :215-222．
［12］Esteves A，Portillo V，Ehrlich R． Genomic structure and expression
of a gene coding for a new fatty acid binding protein from Echino-
coccus granulosus． Biochim Biophys Acta，2003，1631(1) :26-34．
［13］Chabalgoity JA，Moreno M，Carol H，et al． Salmonella typhimurium
as a basis for a live oral Echinococcus granulosus vaccine ． Vaccine，
2000，19(4-5) :460-469．
［14］郝慧芳，王志钢，李志伟．细粒棘球蚴内蒙株疫苗侯选基因克隆
及分析．中国公共卫生，2007，23(10) :1194-1195．
［15］郝慧芳，王志钢，李志伟．细粒棘球蚴内蒙株 FABP 基因 cDNA
的克隆与核酸疫苗的构建． 中国寄生虫学与寄生虫病杂志，
2007，25(4) :352-354．
59