全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 6 期
骆驼来源单域抗体在免疫治疗中的研究进展
苏幼红 李江伟
(新疆大学生命科学与技术学院 新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐 830046 )
摘 要: 近几年多种单克隆抗体药物已成功上市并用于治疗人类多种疾病，但因单克隆抗体的复杂结构和高昂的生产
成本，限制了其在临床上的广泛应用。随着生物技术的进步，使抗体朝着小型化的基因工程单域抗体发展。20 世纪末，在骆
驼科动物(camelidae)和护士鲨(nurse shark)体内发现一种天然缺失轻链的重链抗体(heavy chain antibody，HCAb) ，这种特殊
抗体的抗原结合位点仅由单一结构域构成。该结构域在骆驼中称为 VHH，经基因重组修饰易于进行工程表达，产物即称为
VHH单域抗体，具有分子量小，可溶性好，稳定性高及组织穿透力强等优势，在调节免疫功能方面的应用前景更加广阔。就目
前国际上对骆驼来源的 VHH单域抗体在免疫治疗应用研究的进展情况进行综述，为基因工程单域抗体改造提供新思路。
关键词: 骆驼 VHH单域抗体 重链抗体 免疫治疗
Research Progress on Immunological Therapy Application of
Single Domain Antibodies Derived from Camel
Su Youhong Li Jiangwei
(Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，
College of Life Science and Technology Xinjiang University，Urumqi 830046)
Abstract: Over the years，several monoclonal antibodies come into the market and have been successfully proved to be therapeu-
tic in the treatments of many human diseases However，the clinical use of mAbs was limited by their immunogenicity With the devel-
opment of biotechnology，the generation of smaller sized engineering antibodies is available，but the expensive cost of production still
hampered the wide scale use of mAb Till the end of the last century，a unique type of heavy chain antibody (HCAb)naturally devoid
of L-chains was discovered in members of the Camelidae family and nurse shark，and its antigen binding site consists only of single do-
main，which was called VHH in camels For the easy cloning of VHH and its other properties，such as small size，good solubility，
high stability，the VHH antibody holds great promise in immunological modulation and therapy application This review focuses on the
potential therapeutic applications of single domain antibodies generated from camels，and might provide the new ideas for engineering
antibodies
Key words: Camel VHH single domain antibody HCAb Immunological therapy
收稿日期:2009-12-29
作者简介:苏幼红，女，硕士，从事基因抗体工程研究;E-mail:wuxing8281@ yahoo com cn
通讯作者:李江伟，博士，副教授，E-mail:lijiangwei67@ gmail com
自 1975 年诺贝尔奖获得者 Kohler 和 Milstein
发明杂交瘤技术以来，单抗作为临床治疗药物发展
迅速［1］。第一代鼠源单抗在临床治疗上得到了一
定的应用，但随后发现，由于鼠源抗体在人体内会产
生鼠抗人抗体反应(human anti-mouse antibody，HA-
MA反应) ，使鼠源单抗在临床上的用于受到很大限
制。另外，传统抗体分子量较大，结构复杂，由此产
生的高昂成本也限制了其在临床上的应用。20 世
纪 80 年代以来，采用基因工程抗体技术，对抗体进
行人鼠嵌合，人源化，小型化修饰，使得基于单个可
变区结构域的单域抗体应运而生。单域抗体的问世
克服了大分子抗体不利的理化性质、提高了组织穿
透性、降低了生产费用，对于发展治疗性的抗体提供
了良好的解决方案。但是，经基因工程改造获得的
由 VH和(或)VL构成的单域抗体 FV 片段，由于存
在疏水残基在稀释时易发生解聚，需要在 VH 和 VL
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
间连接一段人工合成的接头(如 scFv) ，以保持其在
溶液中的稳定性。这样得到的单域抗体的亲和力不
高，加入的接头也会导致抗体的凝聚，并且使得它对
一些蛋白酶变得敏感，影响其治疗使用效果，而且在
制备过程中由于抗体的凝聚，使得分离和纯化变得
不易，并会使得率大大降低。所以，单域抗体尽管有
诸多优点，但由于上述原因使得它们仍不能很好地
应用于临床。
1993 年 Hamers等［2］偶然发现骆驼体内存在一
种仅具有重链的抗体，被称为重链抗体(heavy-chain
antibodies，HCAbs)。此后，在一些软骨鱼，如护士
鲨体内也发现类似骆驼重链抗体结构的新抗原受体
(new antigen receptor，NAR)［3］。这类抗体的抗原
结合位点仅由重链的可变区 VHH(variable domain
of the heavy chain of HCAbs，VHH)单结构域形成，
尽管缺失轻链可变区，却仍具有良好和广泛的抗原
结合力［4］。并且由于在框架 FR2 区存在一些不同
于常规抗体的亲水性氨基酸，使得 VHH 抗体在水
溶液中具有良好的稳定性。VHH 抗体是目前可以
得到的具有完整功能的最小抗体分子片段，分子量
为 15 kD，仅为常规抗体的 1 /10，其分子高度 4 8
nm，直径在 2 2 nm，故被称为纳米抗体(nanobody)。
更为重要的是，由于具有伸展的抗原互补结合区
(CDR)以及更高的组织穿透性和更小的分子，VHH
抗体可以结合一些常规抗体无法接近的抗原表
位。如位于酶蛋白裂隙中的活性中心结构。另
外，纳米抗体还具有易表达，水溶性好，稳定性强，
免疫原性弱，组织穿透性好等优点，使得该抗体作
为一种小型化的基因工程抗体在基础研究、药物
开发等领域有广阔的应用前景。目前，基于骆驼
重链抗体的 VHH 单域抗体研究在欧美地区已开
始成为热点之一，但在国内仍鲜见报道。新疆是
我国双峰驼的主要产地，对于双峰驼中重链抗体
的研究，可为研发新型基因工程抗体提供便利，也
为进一步了解该型抗体在骆驼免疫中的作用提供
线索。在此，将对来源于骆驼重链抗体的单域抗
体在国内外的应用研究现状展开综述，期望在未
来即将开展的基因工程抗体改造及其在免疫治疗
方面的应用工作中有所借鉴。
1 骆驼重链抗体的生物学特征
骆驼科在动物分类学上共分为 3 属 6 种动物，包
括骆驼属的双峰驼和单峰驼;大羊驼属的美洲驼、羊
驼和原驼;小羊驼属的骆马［5］。目前国际上所研究报
道的 VHH单域抗体的来源动物主要为美洲驼(Lla-
ma)和羊驼(Alpaca)。这些骆驼体内不仅存在由两
条重链和两条轻链组成的 IgG1 型常规抗体，还存在
仅由两条重链组成的 IgG2 和 IgG3 型重链抗体
(HCAb) ，约占血清中抗体总量的一半［2］。该重链抗
体缺失轻链和 CH1 恒定区，其重链可变区(VHH)直
接通过铰链与 Fc结构域连接。虽然缺失轻链，HCAb
却可正常识别和结合抗原，与抗原结合的亲和力达到
纳摩尔(nmol)级，与 scFv亲和力相当。
通过对骆驼 VHH 胚系基因序列分析发现，
VHH与人源 VH 基因Ⅲ家族序列具有较高的同源
性［6］。传统抗体的 VH 和 VL 区通过疏水作用形成
稳定结构，而重链抗体则通过选择性突变 VHH 胚
系基因中几个功能位点，使其形成较高的亲水性表
面，可在缺失 VL 条件下保持结构稳定［7］。比较人
类和骆驼 IgG 重链可变区发现，在框架 FR2 区的氨
基酸组成中，有 4 个氨基酸显著不同。这 4 个氨基
酸在 VH 和 VHH 中分别是 V42F 或 V42Y，G49E，
L50R和 W52G(数字代表氨基酸序列位点，数字前
面的单字母代表 VH 中的氨基酸，数字后面代表
VHH同样位点中的氨基酸)。VH 区中的这几个氨
基酸通常与 VL 中对应氨基酸发生相互作用，这些
氨基酸在进化中是相当保守的［8］。研究发现，将来
自人体的 VH3 单域片段中上述氨基酸位点进行突
变(G49E，L50R 和 W52G) ，在大肠杆菌中表达的
VH3 重组蛋白的水溶性和稳定性有显著改善。另
有研究发现骆驼重链抗体 CDR3 区较传统抗体相应
区域要长，如溶菌酶特异的 VHH 单域抗体的 CDR3
区有 24 个氨基酸残基，而鼠源 VH抗体的相应区域
仅有 7 个氨基酸［9］。较长的 CDR3 与相邻的 CDR1
或 CDR2 由二硫键连接成环来稳定构象。由于重链
抗体的 CDR3 较长，可形成稳定的大凸环结构，深入
具有裂缝凹陷结构的抗原内部，如酶的活性位点［10］，
病毒与宿主细胞结合位点等。而传统抗体 Fab 片段
及单链抗体 scFv 通常只能识别位于抗原表面的位
点。因此 VHH单域具有更加广泛的抗原结合力。
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2010 年第 6 期 苏幼红等:骆驼来源单域抗体在免疫治疗中的研究进展
2 骆驼 VHH 单域抗体的克隆表达及其生
化特性
迄今为止，抗原特异的 VHH单域抗体，主要通过
PCR从未免疫或免疫骆驼的外周血淋巴细胞中扩增
获得可变区基因，并克隆至噬菌体展示载体，以固相
化特定抗原筛选噬菌体文库获得。但来源于未免疫
库的单域抗体与抗原的亲和力较弱［9，11］，因此许多研
究组都通过构建免疫库筛选获得高抗原亲和力单域
抗体。筛选出的 VHH单域抗体与传统抗体相比，在
大肠杆菌中较易表达和纯化，并因具有较高的可溶性
和稳定性，可在酵母，植物或哺乳动物细胞等表达系
统中进行稳定表达［9］，生产成本极大降低。
另外，克隆表达获得的 VHH 抗体与传统抗体
和单链抗体 scFv 相比，具有诸多优势。如水溶性
强、耐热性高和耐受变性剂的处理等。由于不需要
像 scFv 那样的一段人工合成的接头连接，并且在
FR2 区保守序列中含有几个具有亲水性的氨基酸，
使得 VHH单域抗体具有水溶性好的特点。试验表
明，原核表达的 VHH 抗体在高达 10 mg /mL 浓度
时，仍不发生聚集，具有良好的可溶性。
对迄今得到的 VHH单域抗体的稳定性分析表明
这些抗体都相当稳定。Ghahroudi［7］将 4 种 VHH 抗
体在 37℃放置 1周，结果其中的 3种抗体的抗原结合
活性 100%，1种活性为 80%，表明 VHH抗体在室温
下保存相当稳定。有研究者将纯化的抗溶菌酶或 β-
内酰胺酶 VHH抗体与小鼠血清在 37℃孵育 24 h后，
发现其抗原结合活性没有损失。除此，VHH还表现
了较高的热稳定性［12］。Van der Linden 比较了鼠单
抗和 VHH抗体在高达 90℃高温长时间处理的抗原
结合活性，发现所有常规抗体在 90℃处理后都丧失
了活性，而 VHH抗体却都保持了较高的活性。除了
具有热稳定性外，VHH 抗体对于蛋白变性剂，如尿
素、盐酸胍和乳酸胺等也表现出较高的耐受性。
VHH的这些特点以及较强的组织渗透力等特
点［13］，使单域抗体可适用于多种生物技术和治疗方
面的应用。而且将单域抗体与其它蛋白或肽进行融
合表达，经适当修饰后可用于诊断和治疗［14］。如
VHH融合荧光蛋白获得荧光探针以追踪细胞内的
靶抗原［11，15］。如果将两个相同的 VHH 抗体用一个
连接肽串联克隆，获得的双价抗体具有很高的抗原
结合活性。而将 VHH 与另一抗原特异的 VHH 串
联克隆，例如血清白蛋白，不仅可以显著提高抗体靶
向性，还可延长抗体的体内半衰期［16］。此外，由于
单域抗体在不同环境中都具有高稳定性和折叠能
力，可通过基因重组将前导序列切除，与其它信号靶
序列融合，将 VHH抗体定位于胞内介质［17］，或叶绿
体［18］，内质网［19］等胞内泡。而且鉴于 VHH 与人
VH3 序列同源，可通过基因工程改造对骆驼 VHH
抗体进行人源化修饰，以降低单域抗体作为治疗药
物的免疫原性。
3 VHH单域抗体在免疫治疗中的研究进展
自从传统的 TNF-α 中和抗体在治疗风湿性关
节炎和其他炎症疾病中取得显著成效后，研究者们
一直致力于寻找基于抗体的免疫治疗药物。目前已
有多种抗体药物获准上市，特别是一些用于自身免
疫疾病和癌症免疫治疗的单抗类药物［20］。例如，抗
CD20 抗体(Ritux-Rituximab) ，在风湿性关节炎症，
系统性红斑狼疮和其它一些自身免疫疾病治疗中显
示出良好的成效，而抗表皮生长因子受体 ErbB-1 和
ErbB-2 的抗体(cetuximab and trastuzumab)也已用
于临床治疗结直肠癌和乳腺癌。但是，传统治疗性
抗体的生产成本预算普遍较高，不利于抗体的临床
推广应用。因此，分子量小，易操作的 VHH 单域抗
体，在免疫治疗应用中与传统抗体相比显示出巨大
优势。特别是作为各种细胞表面蛋白和胞内外蛋白
的靶标，介导治疗性药物对各种疾病模型的治疗研
究中都显示出较好的疗效。
3 1 抑制白细胞胞外酶活性
白细胞可分泌多种胞外酶，这些酶在细胞通路，
炎症和凋亡中起着重要作用。如 ADP 核糖转移酶
(ARTs) ，通过转译后修饰其它细胞表面蛋白功能;
肽酶(CD 10)可介导细胞因子和细胞粘附分子的脱
落和粘附。因此寻找这些胞外酶的活性抑制剂，可
用于有效调节免疫功能。一般用于抑制白细胞胞外
酶活性的物质主要有小分子抑制剂和抗体，但小分
子化学物质缺乏特异性，而 VHH 单域抗体具有结
合酶活性中心的特点，可用于阻断这些酶的活性。
ART2 2 是一种细胞表面蛋白酶，可识别受损
细胞释放的 NAD，通过 ADP-核糖基化胞内 P2X7 受
体介导 NAD 诱导的未成熟 T 细胞死亡［21］。Koch-
92
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
Nolte 等［22］从美洲驼免疫抗体库中筛选出了
ART2 2 特异的 4 种 VHH 抗体，其中有 3 种具有
ART2 2 酶抑制活性。静脉注射具有 ART2 2 抑制
活性的 VHH，可在小鼠体内产生抑制 T细胞表面由
NAD介导的细胞杀伤作用。将该单域抗体与小鼠
IgG1 的 Fc 端融合形成的嵌合抗体可显著延长
ART2 2 酶抑制效应的时间。与 ART2 2 类似的其
它白细胞胞外酶也具有凹陷的活性位点，如 CD38，
CD39 等都是潜在的治疗性靶标。克隆获得具有这
些胞外酶阻抑效应的单域抗体，可用于一些自身免
疫和炎症疾病的治疗。
3 2 中和细胞因子和可溶性蛋白
近年来，传统抗体中和细胞因子，对风湿性关节
炎，牛皮癣和其它一些慢性炎症疾病的治疗取得了
很好的疗效。这些抗体的成功应用提出了从骆驼体
内发展出更小的细胞因子中和单域抗体的需求。
Coppieters［16］研究组以人源 TNF-α 和鼠源 TNF-α
免疫美洲驼，分离获得具有中和 TNF-α 作用的
VHH单域抗体，并将两个 TNF-α 特异的 VHH 融
合，获得双价单域抗体，可增强 100 倍以上的 TNF-α
中和活性。该双价单域抗体与传统的 TNF-α 中和
抗体 infliximab和 adalimumab 相比，中和效率较高。
若再融合一个血清白蛋白特异的 VHH，将显著延长
中和抗体的血清半衰期，目前这些多价 VHH 中和
抗体正处于临床试用中［23］。
同样，针对细胞分泌的其它可溶性功能蛋白的
单域抗体，也可用于治疗由相应蛋白所引起的功能
紊乱病症。淀粉样病变是一种因可溶性蛋白异常聚
集成淀粉样纤维引发的病症，与多种年龄相关疾病
的发生相关，如淀粉样 Aβ 多肽在胞外以不可溶的
方式累积聚集可引发 Alzheimer老年痴呆症。Lafaye
等［24］从免疫抗体库筛选获得的 Aβ 特异的 VHH
(V31-1) ，可抑制淀粉样纤维形成并保护神经元细
胞免受由 Aβ 多肽引起的神经毒害作用。另外，研
究表明从美洲驼免疫库中分离的人血清白蛋白和
IgG特异的单域抗体，可有效清除血清中相应蛋白，
这对患有系统性红斑狼疮(SLE)等自体抗体水平过
高的病患有重要的治疗意义［25］。
3 3 靶向胞内抗原
一般情况下，蛋白无法穿透细胞膜进入胞内，因
此抗体很难接触到胞内抗原。目前，使单域抗体与
胞内靶抗原结合采用的策略主要有两种:一种是将
单域抗体与介导跨膜转运相关的蛋白信号肽融合;
另一种是以携带有单域抗体编码序列的载体转染细
胞，在细胞内与胞内靶标蛋白进行共表达。由于单
域抗体在不同细胞环境内，包括胞质，核内，内质网
等都可进行正常的折叠，因此基于细胞转染的策略
更适合其靶向胞内抗原。
Bax是 Bcl-2 家族蛋白成员，与早期细胞凋亡有
关，如肌萎缩症中神经元的死亡。Gueorguieva［17］研
究组将携带有 Bax特异 VHH 单域抗体编码序列的
表达载体稳定转染细胞后，显示出较强的抗氧化性
并明显降低由 H2O2引起的细胞毒性。多聚腺苷酸
结合蛋白 1(PABN1)过表达或其编码基因三联密码
子重复延伸，会引起 PABN1 在骨骼肌细胞核内成纤
维样聚集，导致肌营养不良症(OPMD)。将 PABN1
特异的 VHH单域抗体与核定位信号序列及绿色荧
光蛋白融合，转染 HeLa 细胞后可进行稳定表达并
定位于细胞核，有效阻断共表达的 PABN1 纤维样聚
集［26］。在果蝇的 OPMD 模型试验中，PABN1 特异
抗体的内源性表达可有效抑制肌肉萎缩，并最终治
愈。这些研究都说明了单域抗体在靶向胞内外蛋白
应用中有广阔的前景。
3 4 肿瘤靶向免疫诊断和治疗
早期诊断和治疗效果监控一直是癌症诊断的主
要难题。为了在体内快速而准确地检测肿瘤所在位
置，理想的显影剂应具备良好的组织渗透性，高抗原
亲和力，并能使正常组织受放射损伤降到最低。
Cortez-Retamoz等［27］以小分子量的 VHH 单域抗体
构建的显影剂，显示出良好的组织穿透力和亲和力，
对正常组织几乎没有损伤。除了可作为潜在的影像
剂，单域抗体还可用于病理诊断检测。例如，不同构
象的前列腺特异抗原(PSA)的产生与各种前列腺疾
病有关。前列腺癌早期诊断检测主要通过检测血液
中各种构象的 PSA。近期，有研究者通过获得不同
构象的 PSA特异单域抗体，用以检测相应构象的前
列腺抗原，以此诊断前列腺癌的病发阶段［28］。
由于单域抗体具有高抗原特异性和亲和力，可
用于靶向肿瘤特异抗原，将肿瘤治疗药物投放至病
灶，发挥有效的肿瘤杀伤作用。目前已研发出多种
03
2010 年第 6 期 苏幼红等:骆驼来源单域抗体在免疫治疗中的研究进展
抗肿瘤和肿瘤新生血管中过表达受体的特异 VHH
单域抗体。癌胚抗原(CEA)在上皮来源癌细胞中
高表达，而在成熟细胞中不表达或低水平表达。
CEA特异单域抗体与 β内酰胺酶融合，将 β 内酰胺
酶定位于肿瘤内部，通过催化 β 内酰胺类抗肿瘤前
药生成具有细胞毒性的药物，在原位杀伤肿瘤。这
种抗体依赖的酶前药治疗系统可引起特定的移植瘤
衰退或治愈，对癌症治疗具有很强的靶向性［29］。而
且单域抗体分子量小可在肾脏中被快速清除，对正
常组织和细胞的损伤较小。
4 VHH单域抗体在其它方面的应用
VHH单域抗体可特异识别病毒和其它致病微
生物的特殊结构蛋白，协助宿主抗感染免疫防御。
病毒的主要抗原决定簇一般位于较隐匿的缝隙结构
中，传统抗体很难识别，并且该结构在多种病毒中较
为保守，可共用相同的宿主细胞受体，而衣壳表面区
域的蛋白变异较快，因此病毒很容易逃脱宿主的免
疫防御系统。单域抗体可特异识别这些裂隙结构，
从骆驼抗体库中筛选获得的抗轮状病毒单域抗体，
可识别和中和多种轮状病毒株，在小鼠模型中，口服
给药可显著改善痢疾病症［30］。将该单域抗体与乳
酸杆菌表面蛋白融合，可表达于乳酸杆菌表面，以此
喂食小鼠可显著降低由轮状病毒引起的痢疾发病
率［31］。另外，由于多数寄生虫可通过虫体表面覆盖
的各类糖蛋白逃脱宿主免疫防御，单域抗体也可用
于寄生虫感染的诊断和治疗小分子特异单域抗体偶
联荧光染料后，可识别寄生虫表面糖蛋白并渗透进
入虫体，以此检测血液中的寄生虫感染［32］，若偶联
β内酰胺酶则可将头孢菌素等前药转化为毒性药物
杀死寄生虫。此外，多数细菌分泌可失活抗生素的
酶类，作为在抗生素治疗中的逃逸机制，具有酶封闭
效应单域抗体可有效抑制 β 内酰胺酶催化水解 β
内酰胺类抗生素［33］，因此可用于改善抗生素治疗效
果。除此之外，单域抗体还可用于中和细菌毒素，内
毒素和蛇蝎等有毒器官分泌的烈性毒素，以缓和一
些系统性毒害作用。
5 问题与展望
自从偶然发现骆驼中的重链抗体后，借助噬菌
体展示技术筛选获得抗原特异的单域抗体的应用研
究成为热点。大量的基础研究表明，来源于重链抗
体的单域抗体可有效用于研发诊断试剂及生物传感
器，具有巨大的诊断和治疗前景。但是单域抗体在
临床上的广泛应用仍要克服许多障碍。一方面，骆
驼和美洲驼的免疫较其它小型动物来说要麻烦且相
对费用较高，因此需要利用转基因小鼠表达骆驼化
抗体，作为更加经济的单域抗体来源［20］;另一方面，
为了使单域抗体进入胞内与靶标结合，需要进行体
内转染介导内源性单域抗体表达，这在人体组织较
难实现，至今为止在人体内转染成功的仅限于较易
获得的组织，如皮肤和肝脏，且转染效率较低。最受
关注的问题是单域抗体作为临床治疗性药物，长期
重复的临床使用会产生潜在的免疫原性。蛋白质的
免疫原性随着分子大小和复杂程度而增强，系统性
小剂量使用单域抗体一般不会产生中和抗体反应，
但多剂量重复使用融合双价或多价单域抗体将导致
较强的免疫原性产生，影响治疗效果。近期，有研究
者将骆驼单域抗体进行人源化改造，但是这种人源
化 VHH较骆驼单域抗体的免疫原性是否减小，仍
待证实［34］。尽管如此，对于单域抗体作为小分子治
疗抗体的研究仍会不断持续，相信在不久的将来能
够在各种疾病的临床治疗中发挥巨大功效。
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