全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2009年第 1期
收稿日期：2008-06-10
基金项目：博士基金（20040219）
作者简介：柴晓杰（1963-），女，教授，博士，研究方向：植物基因工程；Tel：0411-84789884，E-mail：cxj63@126.com
轮状病毒（rotavirus，RV）于 1973 年由澳大利亚
学者 Bishop 发现，属呼肠孤病毒科，与呼肠孤病毒
一样有着特殊的形态。 迄今为止，根据 VP6 的特异
性，轮状病毒已被分为 7 个组。 与疫苗研制有关的
最重要的轮状病毒抗原成分是它们的表面结构蛋
白。 外壳蛋白 VP4 和 VP7 均可诱导产生中和抗体，
在动物模型中抗 VP4 和抗 VP7 抗体可分别独立地
抵御轮状病毒感染 [1]。 轮状病毒感染可引起多种幼
龄畜禽及儿童腹泻，给社会带来了巨大损失 ，引起
了人们的普遍关注和高度重视。由于目前世界上对
轮状病毒感染没有有效治疗药物，使用疫苗进行预
防成为唯一手段。而转基因植物疫苗又以其独具的
特色-可食（饲）性，展现了诱人的潜在开发价值。利
用转基因植物生产食用疫苗，无需经过传统医用疫
苗和重组疫苗复杂而严格的加工过程，即将经遗传
技术处理过的食用疫苗种子直接提供给人（动物）食
用，以根除致命性的疾病 [2，3]。 为此，利用轮状病毒
VP7 基因成功地构建了植物表达载体，为植物基因
工程疫苗的研究与开发奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种和质粒 菌种为大肠杆菌菌株 DH5α；
质粒由南京军事医学研究所朱进博士提供；pMD18-
Tvector 购自 TaKaRa 公司；改良的 pBI121 由本室保
存。
1.1.2 培养基 LB 培养基。
1.1.3 酶及生化试剂 Taq 酶及限制性内切酶、溶
菌酶 、T4 DNA 连接酶 、DNA Marker DL2000 购自
TaKaRa 公司，其他试剂均为国产分析纯产品。
1.1.4 引物 PCR 引物由 TaKaRa 公司合成。
1.2 方法
1.2.1 PCR 扩增 人工合成引物为 P1：5′-CGGGA
轮状病毒 VP7基因的克隆及其植物表达载体的构建
柴晓杰 靳非 王宇航 王晓庆
（大连水产学院生命科学与技术学院，大连 116023）
摘 要： 应用聚合酶链式反应技术（PCR）扩增了轮状病毒 VP7 基因，并将其克隆到 pMD18-Tvector 载体上，对重
组子进行 PCR检测和限制性内切酶分析，并测定了 DNA全序列。结果表明，克隆片段全长为 981 bp。将轮状病毒 VP7基
因定向的克隆到植物表达载体 pBI121启动子下游，构建了植物表达载体。
关键词： 轮状病毒 PCR 克隆 植物表达载体
Cloning and Construction of Plant Expression Vector Containing
Rotavirus VP7 Gene
Chai Xiaojie Jin Fei Wang Yuhang Wang Xiaoqing
（School of Life Science and Technology，Dalian Fisheries University，Dalian 116023）
Abstract： Rotavirus VP7 gene was obtained by PCR techinque and cloned into pMD18-Tvector. The
recombinant clone was detected by PCR technique and analyzed by the restriction enzyme. A full length of cDNA
gene was sequenced. The results showed that the length of the clone sequence was 981bp. Rotavirus VP7 gene was
cloned into promoter downstream of plant expression vector pBI121 in orientation.
Key words： Rotavirus PCR Clone Plant expression vector
2009年第 1期
TCCATGTATGGTATTGAATATACCAC-3′；P2：5′-CCG
AGCTCCTATACTCTATAATAAAACGCAGC-3′； 在 50
μl 的反应体系中，dNTP 4.0 μl， 引物各 50 pmol/L，
模板 DNA 0.1 μg，Taq 酶 0.5 μl （2.5U），10×Buffer
5.0 μl，MgCl2 4.0 μl，以 ddH2O 补足 50 μl。 PCR 扩
增条件：94℃预变性 5 min；94℃变性 30 s，55℃复性
30 s，72℃延伸 2 min，30 个循环；72℃延伸 10 min。
1.2.2 PCR 产物的克隆 、 鉴定及序列分析 将
PCR 产物回收后， 按 3：1 比例与克隆载体 pMD18-
Tvector 连接。 按 Maniatis[4]方法制备感受态细胞，将
连接产物转入大肠杆菌 DH5α，并在附加 100 μg/ml
的氨苄青霉素的 LB 固体培养基上选择培养。 挑取
白斑用碱裂解法提取质粒 DNA， 用限制性内切酶
酶切鉴定，得到重组克隆 pMDVP7，其中插入约 1 kb
的目的基因。 序列测定由大连 TaKaRa 公司完成。
1.2.3 植物表达载体的构建 将含有目的基因的
重组质粒 （pMDVP7）和 pBI121 经 BamHⅠ和 SacⅠ
酶切，T4 DNA 连接酶连接， 得到重组质粒 pBIVP7。
转化大肠杆菌 DH5α，在含 50 μg/ml 的卡那霉素的
LB 固体培养基上筛选重组子。 提取阳性克隆的质
粒，经 PCR 检测和酶切鉴定，得到重组克隆。
2 结果与分析
2.1 PCR 扩增产物的克隆及筛选
PCR 扩增产物在 1.0%琼脂糖凝胶上电泳 ，得
到约 1 kb，特异性强，单一的扩增带。 结果（图 1）与
预期一致。扩增产物回收后与载体连接转化到大肠
杆菌 DH5α 中，筛选出 8 个阳性克隆，经 PCR 检测
和酶切鉴定，得到一条约 1 kb 的插入片段，说明该
目的基因插入在载体上 ， 其片段大小与预期一致
（图 2）。
2.2 DNA 序列分析
经过 DNA 全自动测序仪， 测定得到的序列为
981 bp 的目的片段与已发表的人源 VP7 基因序列
有 68 个核苷酸的差异，同源性为 92%（图 3）。
图 1 PCR 产物的电泳分析
M.DNA Marker DL2000；a,b,c,d.PCR 产物；e.对照组
图 2 重组克隆的酶切鉴定
M.DNA Marker DL2000；a,b．BamH I+ Hind Ш 酶切产物
1 atgtatggta ttgaatatac cacaattcta atctttctga tatcaatcat tctactcaac tatatattaa aatcagtgac ccgaataatg
91 gactacatta tatatagatt tttgttgatt tctgtagcat tatttgcctt aactaaagct cagaactatg gacttaatat accaataaca
181ggatcaatgg atactgtata ttccaactct actcaagaag gagtatttct aacatccaca ttatgtttgt attatccaac
261tgaagcaagc actcaaatca gtgatggtga atggaaagac tcattatcac aaatgtttct tacaaaaggt tggccaacag
341gatcaatcta ttttaaagag tactcaaata ttgttgattt ttccgttgac ccacaattat attgtgatta cagcttagta ctaatgaagt
431atgatcaaaa tcttgaatta gatatgtcag aattagctg atttgatattg aatgaatggt tatgtaatcc aatggatata acattatatt
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601caaacgttag gaataggttg tcaaacaacg aatgtagatt catttgaaac agttgctgag aatgaaaaat tagttatagt
681ggatgtcgtt gatgggataa atcataaaat aaatttgaca actacgacat gtactattcg aaattgtaag aagttaggtc
761caagagagaa tgtggctgta atacaagttg gtggctctaa tgtgttagac ataacagcgg atccaacgac taatccacaa
841attgagagaa tgatgagagt gaattggaaa agatggtggc aagtattcta tactatagta gattatatta atcagattgt
921acaggtaatg tccaaaagat caagatcatt aaattctgct gcgttttatt atagagtata g
图 3 目的片段的核苷酸序列
981bp
981bp
柴晓杰等：轮状病毒 VP7基因的克隆及其植物表达载体的构建 81
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
2.3 轮状病毒 VP7 基因植物表达载体的构建
将筛选出的 5 个重组克隆， 进一步酶切鉴定，
电泳图谱（图 4），表明酶切片段大小与理伦值一致。
说明目的基因的插入位置和方向都正确。
3 结论与讨论
根据已发表的序列设计 1 对引物，采用优化的
PCR 体系扩增出轮状病毒 VP7 基因， 序列测定结
果表明，该基因片段全长 981 bp，与人源 VP7 基因
序列同源性为 92%。
将目的基因插入到 35S 启动子的下游，构建成
表达质粒 pBIVP7。 经限制性内切酶酶切鉴定插入
方向和片段大小都正确，证明已成功构建了植物表
达载体。
在克隆了轮状病毒 VP7 基因的基础上，构建了
植物表达载体，为今后进行遗传转化利用转基因植
物生产基因工程疫苗奠定了基础。 目前，在转基因
植物中成功表达的有乙型肝炎表面抗原（HbsAg） [5~
7]、不耐热的肠毒素 B 亚单位 （LT-B）、诺沃克病毒
外壳蛋白 （NVCP）、流感病毒血凝素和艾滋病病毒
抗原、口蹄疫病毒抗原和鼻病毒抗原、疟疾抗原、鸡
传染性支气管炎病毒的 S1 蛋白等 10 多种疫苗 [8~13]。
表达产物均能诱导机体产生特异性的抗体，具有良
好的免疫原性。研究表明用植物生产疫苗是完全可
行的。 但需要指出的是，转基因植物可饲疫苗的研
究还处在刚刚起步阶段， 许多问题尚需深入研究。
如外源蛋白的表达水平、表达部位及增强转基因植
物可饲疫苗的免疫原性的问题。
参考文献
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图 4 阳性克隆酶切鉴定
M.DNA Marker DL2000；a,b.BamHΙ+ SacΙ 酶切产物
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