全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第5期
收稿日期:2008-03-17
基金项目:国家自然科学基金(30671454)、教育部“新世纪优秀人才支持计划”(NCET-04-0905)、高等学校全国百篇优秀博士学位论文作者
专项基金(200253)、四川省重点实验室项目(2006ZD004)
作者简介:刘玲梅(1982-),女,成都人,在读硕士研究生;研究方向:植物生物技术在果树上的应用;Tel:0835-2882293,E-mail:spmg@yeah.net
通讯作者:汤浩茹(1963-),男,教授、博士生导师;主要从事果树遗传育种与生物技术研究;Tel:0835-2882515,E-mail:htang@sicau.edu.cn
离体培养植株在长期的继代培养过程中往往
会发生生理和遗传的变化,这些变化及其内在联系
在很早的研究中就被人们所关注。Murashige[1]曾经
就用植株“衰老”(senescence)来解释他们所观察到
的烟草在长期培养过程中,器官发生能力逐渐下降
的现象,并认为植株“衰老”是由变异引起。Barba[2]
则认为营养(培养基)和培养时间对离体培养材料
器官发生能力有更重要的影响。因此,对于长期培
养物形态发生潜力的丧失逐步形成了遗传说、生理
说和竞争说 3种学说,但是对于其内在机理尚不清
楚,仍是目前争论的焦点问题。
当前对于长期继代还没有一个准确的定义,因
不同的材料要求不同的培养条件和继代频率。一般
以腋芽、茎尖或不定芽为继代材料更容易保持着旺
盛的增殖能力,较少出现再生能力丧失问题。Rishi[3]
将茎尖继代保存长达 6~8年的姜作为长期继代材
料研究,发现其仍然保持着根茎发生和茎尖再生的
能力。而绝大多数丧失再生能力的问题出现在细胞
培育或愈伤组织继代中。李书平[4]就将每隔 20d继
代一次,共继代 5次的“铁春 2号”春小麦幼穗为外
植体的愈伤组织作为长期继代材料,研究继代次数
对愈伤组织分化能力的影响。刘福平[5]在镜检长期
继代后完全丧失分化能力的球根海棠愈伤组织时,
用的是继代半年的愈伤组织细胞。薛美凤[6]提出,
棉花胚性愈伤组织的继代时间不宜超过 1.5年,文
晓鹏[7]认为刺梨愈伤组织的继代数应控制在 10代
以内。综合大量参考文献,发现多数材料在继代 1
年以上(以 4周继代 1次计算,继代 13次),培养物
的形态发生能力和遗传稳定性等都将会有较大程
度的变化。因此,可将继代时间超过 1年,或继代次
试管苗长期继代培养中的形态发生能力与遗传稳定性
刘玲梅 汤浩茹 刘娟
(四川农业大学园艺系 园艺植物生物技术研究室,雅安 625014)
摘 要: 在植物组织培养过程中,继代培养是其中的重要环节,而长期继代则是种质资源离体保存的必要手段。综
述了长期继代培养对植物试管苗形态发生能力和遗传稳定性的影响,探讨了继代培养过程中影响培养物形态发生能力
和遗传稳定性的主要因素。
关键词: 试管苗 长期继代 形态发生能力 体细胞无性系变异
MorphogeneticCapacityandGeneticStabilityofTissueinvitro
CulturesinLong-term Subculturing
LiuLingmeiTangHaoru LiuJuan
(SichuanAgriculturalUniversityColegeofForestryandHorticulture,Yaan625014)
Abstract: Subcultureisanimportantprocesforthetisuecultureandlong-termsubcultureisanesentialmethod
forconservationofgermplasm invitro.Efectsoflong-term subculturetomorphogeneticcapacityoftisueofcultured
shootsandgeneticstability,weresummarizedinthispaper.Themainfactorsthatinfluencemorphogeneticcapacityand
thegeneticstabilityintheprocesofsubculture,werealsodiscused.
Keywords: TisueculturedshootsLong-termsubculture Morphogeneticcapacity Somaticvariation
2008年第5期
数超过 13次的继代培养称为长期继代培养(long
termsubculture)。当材料的继代年限大于这一临界
值时,可将其作为长期继代培养物来研究。
1 长期继代与形态发生能力
在植物组织培养的早期研究中,许多学者就发
现长期继代培养会导致“驯化”(habituation)现象。
除了驯化以外,往往还会逐渐衰退(recession),具体
表现在生长不良,再生能力和增殖率下降,甚至丧
失形态发生能力。崔德才[8]报道,继代 20次的培养
材料(含愈伤组织),其再生能力下降 70%～80%。不
同植株之间保持分化潜力的时间不同,且差异很
大。有的材料长期继代仍可保持原来的再生能力和
增殖率,如葡萄离体繁殖 48～80代后增殖倍数并未
降低[9]。有的材料经过一段时间继代培养后才具有
分化再生能力,如苹果[10]。更多的材料是随继代次
数的增加,繁殖能力逐渐衰退,增殖系数和生根率
的下降,如梨 S系矮化砧[11]、叶毛枣[12]、杉木[13]、棉花[6]
和球根海棠[5]等。
1.1 增殖能力
高相富[14]研究指出,继代次数多少影响着试管
苗的增殖系数。多种植物组培苗起始培养初期,继
代增殖和生根能力较低,随继代次数的增加,繁殖
能力显著增加[15,16]。阎贤伟[17]认为,驯化嫩茎的增殖
倍数高于初代培养茎段嫩茎的增殖倍数。王玖瑞[15]
在枣的快繁中发现,多次继代的材料叶腋芽容易萌
发,且能发生丛芽。这可能是随着继代培养次数的
增多细胞分裂素在培养物基部积累和生长素与细
胞分裂素的比值降低的结果。但是,试管苗在同一
培养基上增殖系数不能随继代次数的增多而无限
扩大,而是在某一代或某几代达到顶峰之后,其增
殖系数呈下降趋势[12]。何水涛[18]发现,在苹果继代
过程中,某一阶段会出现有效新梢最多,成为新梢
均匀整齐的“代期”(临界期)。超过这一“代期”,新
梢增殖虽多,但有效新梢减少,生长不整齐。师校欣[19]
对培养 16、24和 56代乔纳金组培苗进行叶片离体
不定芽再生研究时发现,继代代数由 16代增加到
24代,其再生能力明显提高,增至 56代,差异不显
著。这在杏[20]、树莓[21]、萝卜[22]和姜[3]等的培养中也
得到证实。
1.2 生根能力
很早就有学者报道,一些树木器官或组织由成
熟状态转变为复幼状态时,其不定根发生能力提
高[23,24]。这在苹果[25,26]、葡萄[27]、枣[15]、梨枣[28]和杏[20]
等多种果树中被证实。试管内最有效的幼化措施就
是继代培养和激素处理。随继代次数的增加,新梢
内源 GA和 ABA水平及 IAA的羧化作用均降低,
同时外植体的微管束木质化也降低,而皮层产生花
青素的能力提高,新梢生根能力也相应的提高,处
于半木质化时生根率达到最高值,但随着继代次数
增多,生根率反而下降[26]。黄文江[29]对“Gisela”系甜
樱桃试管苗生根能力的研究发现,随继代次数的增
加试管苗的生根能力显著上升,继代 30次后其生
根率逐渐趋于稳定。杨晓霞[30]在对云南楤木组织培
养快速繁殖试验中发现,8～10代时,其生根率达到
最高峰,之后随着继代次数的增加,其生根率呈缓
慢下降趋势。毛叶枣生根生根试验也获得了同样的
结论[12]。在幼化过程中要使植株适应培养环境需要
几次继代甚至几年的时间,这主要决定于物种、成
熟度和外植体类型以及培养条件等。
1.3 体胚发生能力
Kochba[31]报道,每隔 4～5周继代一次的甜橙愈
伤组织,随继代次数的增加,胚状体发生能力减弱。
贺红[32]在研究胚性愈伤组织继代次数对体胚发生
的影响时进一步指出,继代 6次以内,胚性愈伤组
织具有旺盛产生体胚能力;继代至第 9次时,产生
体胚的能力明显下降;至第 12代时,不能产生胚状
体,这种情况同样发生在烟草中[33]。这可能是因为
愈伤组织中含有从外植体启动分裂时就包括进来
的成器官中心(分生组织),重复继代就逐渐消耗了
原有的与器官形成有关的这种特殊物质而不能形
成微管束,只能形成无组织的细胞团[34]。但是,赖钟
雄[35]发现,龙眼松的胚性愈伤组织继代培养 6代后
仍保持原有的强烈体细胞胚胎发生能力与生长势。
棉花胚性愈伤组织的体细胞胚发生能力也可以长
期保持[36~38]。有的植物出现形态发生能力丧失的现
象,而另一些植物的这种能力又能很好保持,其原
因还有待进一步研究。
2 长期继代与遗传稳定性
在继代培养过程中,植株的体细胞无性系变异
刘玲梅等:试管苗长期继代培养中的形态发生能力与遗传稳定性 23
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
(somaclonalvariation)广泛存在。这些变异有的是不
能遗传的变异即表观遗传变异(epigeneticvariation),
但大多数是可遗传变异[39]。变异既可表现在染色体
水平上,又可表现在分子水平上[40～44]。许多研究也
证实,愈伤组织长期培养会产生多倍体、非整倍体
或染色体断裂和重组或基因突变等情况[7,33]。有报
道指出,随着继代次数的增加,植株变异率明显提
高[14,45]。Kuznetsova[46]发现,长期培养(10年)的桃愈
伤组织变异率由 0.7%提高到了 10%。其中的原因
可能是随着培养时间的增加,变异逐渐表现出来,
还有可能是早期存在的变异随着继代不断累积,而
有些变异稳定且无法逆转(如矮化现象),或者是这
两种情况同时存在,这些都是导致在培养后期发现
较高变异率的原因。但是,并不是随着时间的增长,
染色体变异有无限增加的趋势[47,48]。张俊娥[49]发现
继代培养 4年的纽荷尔脐橙愈伤组织变异率已稳
定在一定的范围之内。她把这种现象解释为,多倍
体变异细胞在不断产生的同时也通过程序性细胞
死亡途径不断被淘汰。相反,有研究发现,长期继代
的材料依然能保持较好的遗传稳定性。杜国强[50]对
不同继代次数 (9～90代)的苹果组培苗进行同工
酶、超薄层等电聚胶电泳及 RAPD分析,未发现变
异。Martins[51]利用 RAPD和 ISSR对继代了 4年和 6
年的杏进行评价时就指出,植株培养的时间并不能
影响其遗传稳定性。Palomino[52]和 Mehmet[53]分别对
仙人掌和榛的研究也得出了相同结论。
一些外植体在培养初期具有的胚胎和器官发
生的潜力,经过长期继代培养后,其形态发生的能
力多会有所下降,甚至完全丧失,这种情况与体细
胞无性系变异有着很大关系。Custers[54]就在尼润属
植物育种中发现了大量影响增殖潜力的遗传变异。
但是关于遗传稳定性与植株的再生能力也有不同
报道,例如长期培养的柑桔愈伤组织芽和根的再生
能力都随着继代时间的增加而降低,但再生植株的
细胞学分析并未发现染色体变异[55]。Sareb[56]对黄
瓜的研究证明,长期悬浮培养后的胚胎发生能力丧
失与倍性水平并无关系。相反,一些植物中的变异
广泛存在,但并不影响其再生能力。张俊娥[57]证实
柑橘体细胞胚胎发生能力与愈伤组织 DNA含量的
增加及其继代时间相关性都不显著。Henry[58]对在
小麦的研究中发现,经过长期培养,尽管有 80%的
再生植株都拥有异常的染色体组,但是再生能力并
没有受到影响,进一步证实了一定范围的染色体组
变异并不能影响植株的再生。
3 长期继代的其他效应
继代培养所造成的试管苗玻璃化现象也普遍
存在,这种生理病症对于试管苗的质量、品质有着
较大的影响[59]。而且长期继代还会发生微生物污染,
严重影响试管苗的质量和利用价值。在甘蔗的长期
继代中,次生代谢物有逐渐减少的趋势[60]。雷基祥
[61]对不同继代刺梨株间的果实重量、可溶性固形物
和可滴定酸的含量、种子的百粒重等性状的研究发
现,继代繁殖数超过 30代,果实大小的整齐度明显
降低,而其它果实性状整齐度都很高。同时发现试
管繁殖刺梨的 1～2年生株发病率明显减少,发病程
度也显著轻微,分析其原因可能是由于定向的选择
不发病株进行继代繁殖提高了抗性的原故。
4 影响长期培养物形态发生能力和遗传稳
定性的因素
植株在长期继代过程中形态发生能力和遗传
稳定性受多种因素影响,其中最为关键的因素主要
有以下几个方面。
4.1 植株基因型
培养时间并不是影响植株遗传稳定性的惟一
参数,基因型对植物遗传变异的影响可能比培养时
间还要大[62,63]。这一点在通过利用体细胞无性系变
异对桃进行新品种培育中得到证实,得到的结果明
显依赖于试验选择的基因型[64]。在对香蕉的研究中
也发现离体培养导致的变异范围受品种的影响比
受培养环境的影响大[65]。基因组中存在不安定的部
分,这部分特别容易受影响而比其他部分表现出更
高频率的重排和突变。因此,体细胞无性系变异并
不是像通常认为的随机现象,在培养过程中由于生
长调节剂的存在,这些特殊位点比其他位点的变异
频率更高[66,67]。在香蕉的变异中,矮化现象就较普
遍,这种现象正好被该理论所解释。同一个品种,不
同倍性的愈伤组织其体细胞胚胎发生的能力也不
一样,如纽荷尔脐橙二倍体的愈伤组织体细胞胚胎
发生的能力较强,而四倍体和六倍体愈伤组织的体
细胞胚胎发生的能力较弱,而且随着倍性的提高,
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体细胞胚胎发生的能力似乎下降[68]。
4.2 外植体类型
有些植株具有体细胞多倍性(polysomaty)或嵌
合现象,多数情况下这种遗传差异在形态特征上表
现不出来,但如果用这种外植体诱导愈伤组织,随
后再生的植株就会发生性状分离[69],这种现象早在
西红柿的研究中就已发现[70]。另外,用分生组织(如
形成层、幼胚等)诱导愈伤组织比用高度分化的组
织或器官产生的变异要少,植株再生时体细胞胚发
生途径比器官发生途径产生的变异要少,来源于成
年植株的培养物要比来源于幼年植株的培养物变
异少[71]。
腋芽增殖被认为是最能保证后代遗传稳定性
的增殖方式,其简单可靠的特性使其成为最常用的
增殖途径[51]。芽的再生途径具有较高的遗传稳定性
在于成器官的分生组织已经形成,从而较少发生
遗传变异,而这种变异往往发生在离体培养条件
下的细胞分裂和分化过程中[72],其中背离器官形成
的分化被认为是引起体细胞无性系变异的关键过
程[73,74]。一般来讲,禾本科植物单倍体体细胞不易
再生,更难保持[75]。
外植体的数量也关系到变异率的多少。通常来
说,较小数量的外植体比大量采取的外植体经过数
代培养以后发现的变异率高[76]。Reuveni[77]就发现,
从单个外植体中获得的植株表现出 80%的变异率,
而来源于21个不同外植体的植株变异率只有8.4%。
4.3 培养条件
除了组织的自然倾向外,继代培养物体细胞的
核型变异还受其他因子的影响,其中最重要的是培
养基成分,这包括培养基的化学成分和物理状态[78]。
一般认为,培养基的组成,特别是激素的组成和含
量,对体细胞无性系变异有重大影响[79]。这种影响
主要是通过增加增殖率和减少不定芽的发生而直
接实现的[80]。高浓度的生长调节剂和周期性的继代
都能干扰培养物的遗传稳定性[71]。如 2,4-D能够提
高姊妹染色单体交换(SCE)频率。当用高浓度的
2,4-D作为除草剂时,还能明显提高转录,导致转
录增加的原因可能是改变了染色质结构,从而造成
基因组不稳定。Lina[81]发现乌脚绿竹在附加 0.1mg/
LTDZ的培养基中继代 6年后丧失了形成雄蕊的能
力,并且任何生长调节剂的处理都不能恢复形成雄
蕊的能力。
此外,Chakraborti[82]在对鱼腥草的研究中发现,
随着增殖芽丛数目的增加,芽的增殖率明显降低;
把芽丛数量减少到 3～4个芽进行培养时,能达到最
佳增殖率和增殖效果,并且能持续两年。
4.4 甲基化现象
许多研究发现,有些再生植株在形态表现出异
常,但是核苷酸序列并没有检测出变化。因此,更多关
注转向于一些外成因素的变化,例如甲基化现象[83],
并且往往都与植株的遗传稳定性一并进行研究。例
如,Peredo[84]利用 AFLP技术对连续继代的蛇麻草
的遗传稳定性进行评价时并没有发现多态性条带,
但利用 MSAP检测出了脱甲基化现象,并认为这种
变化是逐渐形成的。有人把甲基化现象看作是离体
培养导致的体细胞无性系变异[85],也有人把它看作
是基因表达水平上的外成变化,认为甲基化修饰是
一种后生遗传变异,其作用原理是阻止转录过程从
而控制体细胞胚胎基因表达[86]。郝玉金[69]在两种胚
状体发生能力不同的纽荷尔脐橙愈伤组织中没有
检测出 RAPD带型差异,但甲基化程度却有明显的
差异,表明继代培养过程中胚状体再生能力的丧
失,可能不是遗传变异造成,而是胚状体再生相关
基因发生甲基化修饰造成的。甲基化被认为是控制
不稳定因子蔓延的一种保护机制[87],植株在再生过
程中,植物细胞外成变化的发生并不受到细胞的限
制,并且还能通过分裂组织稳定下来[88]。
培养时间是影响继代植株再生能力与遗传稳
定性的一个重要原因。因此,要维持培养物长期再
生能力,同时保持其遗传完整性和稳定性,就必须
严格控制继代时间,更要注意植株基因型和外植体
类型的筛选,以达到长期继代目的。
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刘玲梅等:试管苗长期继代培养中的形态发生能力与遗传稳定性 27