全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
一株耐热脂肪酶产生菌的筛选及酶学性质研究
赵春雷 1 闫丽娟1 谢振荣1 高润池 1 李俊 1, 2, 3 唐湘华 1, 2, 3 黄遵锡 1, 2, 3
( 1云南师范大学生命科学学院,昆明 650092; 2云南师范大学酶工程重点实验室,昆明 650092;
3生物能源持续开发利用教育部工程研究中心,昆明 650092 )
摘 要: 从云南省富油地采取了 60份土样中, 利用透明圈法筛选出一株耐热脂肪酶产生菌。对其酶学性质和发酵条件
进行了研究,酶学性质表明, 该酶最适作用温度为 50 ,最适 pH6. 0,在 pH 3. 0- 8. 0范围内稳定,在 60 保温 60m in酶活还保
留 70% ; 70 保温 60 m in残余 50% ; 具有良好的热稳定性; 不同金属离子有不同的作用, Ca+ , K +对酶有激活作用, Fe3+、
Pb2+、M n2、Cu2+、A l3+、Zn2+对酶活有抑制作用。 EDTA对酶影响不大。产酶最佳条件为: MgSO4 7H 2O 0. 05 g, K2HPO4
0. 1 g, C aCO3 0. 25 g,可溶性淀粉 2. 5 g,大豆粉 2. 5 g,装液量 50 mL。这株细菌通过培养基优化酶活达到 20. 3 U /mL。
关键词: 脂肪酶产生菌 产酶条件 酶学性质
The Screening of Thermostable L ipaseproducing Bacterium and
Study on Properties of L ipase
Zhao Chunlei
1
Yan L ijuan
1
X ie Zhenrong
1
Gao Runchi
1
L i Jun
1, 2, 3
Tang X ianghua
1, 2, 3
Huang Zunxi
1, 2, 3
(
1
College of L ife Sciences, Yunnan N ormal University, Kunm ing 650092;
2
The K ey Lab of Enzym eEngineering YunnanN ormal University,
Kunm ing 650092;
3
Eng ineering Research Center of Sustainab leD evelopm ent and Utilization of BiomassEnergy,
M inistry of Education, Kunm ing 650092)
Abstrac:t F rom 60 o ilrich so il sam ples in Yunnan prov ince, a therm ostab le lipaseproduc ing bacter ium w as sc reened by us ing a
transparent circlem ethod. The nature of its enzym atic and fe rm entation conditions w as studied. Enzym atic properties showed tha t the en
zym e optim al temperature is 50 , optimum pH6. 0, the lipase ac tiv ity is stable at pH 3. 0- 8. 0, and enzym atic ac tiv ity re ta ined 70% at
60 for 60 m inutes. The res idua l is 50% a t 70 for 60 m inutes. D ifferent m eta l ions show ed d iverse e ffects on the lipase activ ities,
Ca+ , K + increased lipase activ ities, w he reas Fe3+ , Pb2+ , M n2+ , Cu2+ , A l3+ , Zn2+ can inh ibit the enzym e activ ity. EDTA effect on the
enzyme little b it. Optimum cond itions fo r enzym e production: M gSO 4 7H2O 0. 05 g, K 2H PO4 0. 1 g, CaCO30. 25 g, solub le starch 2. 5 g,
soybean pow de r 2. 5 g, liqu id vo lum e 50 mL. This stra in o f bac teria o f enzym atic activ ity can achieve 20. 3 U /m l through the m edium
optim ization.
Key words: L ipaseproduc ing stra ins Enzyme produc ing condition L ipase properties
收稿日期: 20091103
基金项目:国家 ! 863∀计划项目 ( 2008AA02Z202 )
作者简介:赵春雷,男,硕士在读,主要从事酶工程研究; Em a i:l aod ia6742@ yahoo. com. cn
通讯作者:黄遵锡,男,博士,教授,博士生导师,主要从事发酵工程和酶工程研究; Em ai:l huangzunx@i 163. com
脂肪酶 ( L ipase, E. C. 3. 1. 1. 3)又叫三酰基甘油
酰基水解酶,是指分解或合成高级脂肪酸与丙三醇
形成的甘油三酸酯酯键的酶 [ 1 ] ,其可在油水界面或
水不溶性系统中催化酯交换、酸解、水解、胺解、转
酯、醇解、酯化等化学反应,具有立体选择性、化学选
择性、底物专一性和位点选择性等特点 [ 2] , 因此可
被应用于:洗涤、制革、食品、生物化工、造纸、医药、
环保等行业 [ 3]。脂肪酶按照来源不同可分为动物
脂肪酶、植物脂肪酶、微生物脂肪酶。人们早在一百
多年就对脂肪酶有所研究, 但是对微生物脂肪酶则
是 20世纪初才开始探索 [ 4]。微生物脂肪酶分布很
广, 据估计, 细菌有 28个属、放线菌 4个属、酵母菌
10个属、其它真菌 23个属共计达 65个属的微生物
产脂肪酶 [ 5]。
2010年第 2期 赵春雷等:一株耐热脂肪酶产生菌的筛选及酶学性质研究
鉴于脂肪酶在工业生产中的得到的广泛应用,
本研究对脂肪酶产生菌株进行了筛选, 优化了其产
酶条件, 为脂肪酶基因的克隆并高效表达奠定了
基础。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌种 从大理剑川, 寻甸, 昆明的油脂化工
厂,肉联厂, 熟肉制品加工厂植物油厂, 奶牛厂及田
园采集土样 60份。
1. 1. 2 培养基 ( 1)初筛培养基 (% ) K2HPO4
0. 2 g; M gSO4 0. 05 g; PVA 乳化液 2 mL; 酵母粉
0. 2 g;蛋白胨 1 g;琼脂 2. 7 g;水加至 100mL; pH自
然。灭好菌后冷却到 60 加 1 mL灭过菌的罗丹明
B。 ( 2)发酵培养基 (% ):橄榄油 1 g; (NH4 ) 2SO 4 0.
2 g; M gSO4 7H2O 0. 05 g; K2HPO4 0. 1 g; 酵母膏 0.
2 g;水加至 100 mL; pH自然。 ( 3)种子培养基 (% )
与发酵培养基相同。
1. 2 方法
1. 2. 1 初筛 将土样 1 g于 10 mL无菌水中振荡
得悬液,静置 30m in, 将悬浮液用无菌水梯度稀释,
涂布于初筛平板。倒置于 37 温箱培养过夜, 产生
的水解圈越大酶活越高 [ 6] , 按水解圈产生的大小选
择菌株。
1. 2. 2 复筛 用接种环挑取初筛培养基中水解圈
较大的菌落于发酵培养基中, 37 下旋转式摇床以
150 r /m in振荡培养, 测定酶活。
1. 2. 3 脂肪酶活力测定 参见施巧琴法 [ 7]进行脂
肪酶活性测定。酶活力的计算公式:
脂肪酶活力 ( U /mL ) = ( V1 - V2 ) # 0. 05 #
1 000 /15
式中 V1是试料溶液滴定值; V2是对照滴定值;
0. 05标准 N aOH摩尔量 (mo l/L )
2 结果与分析
2. 1 菌株筛选
对 60份土样进行了大量的分离筛选工作, 筛选
分离到了 414株分解 PVA乳化液的菌株, 结果表明
菌株 LQ 37产酶能力最强,可达到 15 U /mL。
2. 2 菌株产酶条件优化
2. 2. 1 培养基中碳源优化 碳源是培养基的重要
组成部分,是给菌体提供生命活动所需要的能量以
及构成菌体的细胞和代谢产物的物质基础。以发酵
培养基为基础,氮源为大豆粉 2 g的添加量,考察可
溶性淀粉,玉米粉, 糊精,蔗糖,葡萄糖, 橄榄油,对菌
体产酶的影响。加入各种单一碳源 1. 5 g,结果见图
1。可知可溶性淀粉更有利于产酶。
图 1 碳源对产酶的影响
最佳碳源确定后,由于所加碳源的量对菌体产
酶也是有影响的, 因此将可溶性淀粉添加量设置为
0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5 g 5个梯度,检验不同的碳源
添加量对菌株产酶的影响 (图 2)。结果显示, 可溶
性淀粉为 2. 0 g的时候酶活最高。
图 2 碳源添加量对产酶的影响
2. 2. 2 培养基中氮源的优化 氮源是构成菌体的
重要物质,也是菌体的蛋白质及氨基酸代谢产物的
重要来源,并且对菌体所产的酶的酶活有重大影响。
185
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
氮源一般有无机氮源和有机氮源, 以 1. 5 g可溶性
淀粉为碳源,分别选择牛肉膏蛋白胨、酵母浸粉、大
豆粉、硫酸铵、硝酸铵、尿素, 其试验结果如图 3。由
图 3可知,有机氮源比无机氮源有更有利于菌株产
酶,以大豆粉为最好。在确定了其最佳氮源后,选择
5个不同的氮源梯度来考察不同的氮源添加量对产
酶的影响。结果见图 4。可知大豆粉为 2. 5 g的时
候酶活最高。
2. 3 产脂肪酶条件参数优化
依据单因素试验结果, 本研究考察碳源、氮源、
装液量这 3个因子, 开展了三因素三水平的正交试
验,因素水平见表 1,试验结果见表 2。极差值 R的
大小决定各因素对试验影响的程度, 根据表 2的极
差分析,可得出试验因子的主次顺序如下: A (碳
源 ) > B(氮源 ) > C(装液量 )。且因素 A以水平 3
最好; 因素 B以水平 2最好; 因素 C以水平 1最
好;因此最优水平因素为 A 3B2C1,即 25 g可溶性
淀粉、25 g大豆粉、装液量为 50 mL时酶活最高,
达到 203 U /mL, 且碳源是影响此菌株产酶酶活
的最主要因素。
表 1 因素水平表
因素水平 淀粉 A( g) 大豆粉 B ( g) 装液量 C ( mL)
水平 1 1. 5 2 50
水平 2 2 2. 5 70
水平 3 2. 5 3 100
表 2 产酶培养基的正交试验
试验号 A B C 结果
1 1 1 1 13. 3
2 1 2 2 17. 3
3 1 3 3 16. 6
4 2 1 2 16. 3
5 2 2 3 14. 2
6 2 3 1 18
7 3 1 3 16. 5
8 3 2 1 20. 3
9 3 3 2 17
均值 k1
均值 k2
均值 k3
极差 R
15. 733
16. 167
17. 933
2. 2
15. 367
17. 267
17. 2
1. 9
17. 2
16. 867
15. 767
1. 433
2. 4 脂肪酶性质的研究
2. 4. 1 酶反应的最适温度 以 37 摇瓶培养 48 h
的发酵液作为酶源, 分别在 20- 90 下测定酶活。
图 5表明最适温度为 50 , 且在 40- 60 下仍有较
高活力。
2. 4. 2 酶的热稳定性 取 1mL酶液分别置于不同
温度的水浴锅水浴 1 h, 用未经处理的酶液作对照,
测定残留酶活力,恒温水浴控制温度在 40 、50 、
60 、70 、80 。其试验结果图 6。如图 6可知,
该酶在 60 以下有良好的热稳定性, 60 以上酶活
性急剧下降。
186
2010年第 2期 赵春雷等:一株耐热脂肪酶产生菌的筛选及酶学性质研究
2. 4. 3 酶反应的最适 pH 将底物与不同 pH 的缓
冲液混和,在最适温度下,测定酶活力。从图 7可知
此酶在 pH6. 0时有最大酶活,为中性酶。
2. 4. 4 酶的 pH稳定性 将酶液与不同梯度的 pH
缓冲液等体积混合,在常温下静置 60 m in,在 50 ,
pH6. 0下测定酶活。如图 8, 在 pH 4. 0- 7. 0范围
内,酶活力保持在 70%以上。
图 7 pH对酶活力的影响
图 8 脂肪酶的 pH稳定性
2. 4. 5 金属离子对酶活力的影响 将 11种金属离
子与酶液等体积混合,按常规测酶活,以未加金属离
子的酶液作对照。结果如图 9所示, Ca+ , K+ 对酶
活力有促进作用, Fe3 +、Pb2+、Mn2、Cu2+、A l3 +、
Zn
2+对酶活力有明显的抑制作用。EDTA对酶活力
影响不大。
图 9 金属离子对酶活力的影响
3 结论
通过发酵试验和正交试验确定了所筛菌株LQ37
最佳的发酵条件: M gSO4 7H 2O 0. 05 g, K 2HPO 4
0. 1 g, CaCO 3 0. 25 g , 可溶性淀粉 2. 5 g, 大豆粉
2. 5 g,装液量 50 mL。酶活力通过优化有了较大
提高。
现在工业上生产用的脂肪酶大多为中温脂肪
酶, 这类酶的最适作用温度在 30- 40 左右, 当温
度升高时,脂肪酶的酶活会明显降低, 酶活在 50
187
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
以上时很不稳定, 限制了脂肪酶的应用范围。最近
几年, 工业上对脂肪酶耐酸、耐碱、耐高温等特性提
出了新的要求,而且已经成为国内外脂肪酶研究的
一个重要方向。如去污剂工业中要求脂肪酶高温下
有良好的稳定性以及在表面活性剂的存在下发挥活
性 [ 8]。通过试验得知, 该菌株的最适反应温度为
50 ,但在 40- 60 下仍具有较高的酶活力, 具有
一定的温度耐受性。最适 pH 为 6. 0, 在 pH4. 0 -
7. 0内酶活力较为稳定,有一定的耐酸性。这些性质
表明该菌株具有较大开发的潜力, 并为脂肪酶基因
的克隆和高效基因工程菌的构建奠定了基础。
参 考 文 献
[ 1] 张树政.酶制剂工业 (下册 ) [M ]. 北京:科学出版社, 1998, 655
670.
[ 2] Davis BG, B oyer V. B iocatalys is and enzym es in organ ic synthes is.
Nat Prod Rep, 2001, 18( 6 ): 618640.
[ 3] 温建新,施碧红,吴伟斌,等.脂肪酶产生菌 Bac illu s subtilis FS321
的分离鉴定及其产酶条件的初步优化.食品与发酵工业, 2008,
34 ( 2) : 3741.
[ 4] 乔红群,徐虹,付闪雷,欧阳平凯.脂肪酶产生菌的筛选及其酶性
质.南京化工大学学报, 1998, 20 ( 1) : 13.
[ 5] E rich JK, Thorsten E. L ipases for b iotechnology. C urrent Op in ion in
B iotechnology, 2002, 13( 4 ): 390397.
[ 6] H ou CT, Johson T. S creen ing of l ipase act ivit ies w ith cu ltu res from
ARS cu lture col lect ion. Am O ilC hem Soc, 1992, 69: 10881097.
[ 7] 施巧琴. 碱性脂肪酶的研究. 微生物学通报, 1998, 8 ( 3 ):
108110.
[ 8] Sh arm a R, Son i SK, Vohra RM, et a.l Purification and characteriza
t ion of a therm o stab le alkaline lipase from a new th erm oph ilicBa cil
lus sp. RSJ21. Proc B ioch em, 2002, 37: 10751084.
科学出版社新书
中国裸子植物木材志
姜笑梅 等编著
9787030261380 158. 00 2009年 12月出版
内容简介: 本书介绍了裸子植物的定义、形态及结构特点,及其分类地位、分类系统, 世界
及中国范围内科、属、种的分布 ;裸子植物木材结构及其鉴定特征; 记载了中国 142种主要裸
子植物商品材 (隶 9科、38属 )的结构特征、物理力学性质及加工性能与用途。在国内首次以
国际木材解剖学家协会 ( IAWA )于 2004年发布的 ∃ IAWA针叶树材识别显微特征一览表%为
记载术语和代码。本书对每个树种均记载了木材名称、树木及分布、木材构造、木材物理力学
性质、加工性质和用途,每个树种均附有木材的显微结构照片, 部分树种附有地理分布图。此
外, 本书还将 IAWA出版的∃ IAWA针叶树材识别显微特征一览表%的中文翻译 (含图版 )列为
附录。
本书为中英对照版,可供广大木材贸易、加工、生产、科研和教学人员查阅使用, 也可供国
外有关专业人员参考使用。
欢迎各界人士邮购科学出版社各类图书 (免邮费 )
邮购地址: 北京东黄城根北街 16号 科学出版社 科学出版中心 生命科学分社 邮编: 100717
联系人: 李韶文 ( 010 64000849) 周文宇 ( 01064031535)
网上订购: www. dangdang. com www. joy. com www. amazon. cn www. be ifabook. com
更多精彩图书请登陆网站 http: / /www. lifescience. com. cn, 欢迎致电索要书目
188