全 文 ：荧光假单孢菌 !"#$%&’&()" *+$&,#"-#(-# !"#$
产脂肪酶条件的优化
逄淑召!，王 群"，王 智#，郭慧云!!
（!$ 吉林大学 生命科学学院，长春 !#%%"#；"$ 大连美罗大药厂 科研所，大连 !!&%"’；
#$ 吉林大学 分子酶学工程教育部重点实验室，长春 !#%%"#）
摘 要：对荧光假单孢菌 !"#$%&’&()" *+$&,#"-#(-# ’(&#产脂肪酶条件进行了筛选。该菌株的最适产酶条件如下（.) /）：
!*淀粉作为碳源；"*酵母抽提物作为氮源；%$%#*+," -./·01".；%$"*诱导物，水 ! 2；31 0$%；培养温度为 "4 5。
关键词：荧光假单孢菌；脂肪酶；产酶条件；正交试验法
中图分类号：6(#($!!’ 文献标识码：7 文章编号：!&0" 8 #&04（"%%/）%! 8 %%&" 8 %/
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:0; <,342：!"#$%&’&()" *+$&,#"-#(-#；IE3@PJ；3OAX=LEC, LACXEQEAC；3OA3JO QJPQ
脂肪酶是指能在油水界面水解脂肪的酶，它在
食品、轻化工和医药等领域已有广泛的应用。近年
来，随着非水酶学的发展，脂肪酶在这个全新的领域
被人们重视起来［! ] /］。目前，已发现假单孢菌［’］、曲
霉［&］、青霉［0］、微球菌［4，(］等多种微生物可产脂肪酶，
其中假单孢菌所产生的脂肪酶在一些重要光学活性
化合物的拆分与合成时具有极高的立体选择专一
性。从本世纪五十年代起美、英、法等科学家就开始
致力于微生物脂肪酶的研究，并已取得了利用微生
物脂肪酶进行去污剂的工业化生产等一系列成果。
但是，由于脂肪酶的不稳定性、底物水不溶性、以及
提纯困难等问题，致使在很长一段时间内对微生物
脂肪酶的研究进展缓慢。近年来，随着细胞工程、基
因工程等技术的兴起，才取得长足的进步。本文对
产脂肪酶荧光假单孢菌进行了产酶条件的优化，用
正交法找出了影响因素的最佳配比并据此找到其最
适产酶条件。
= 材料和方法
!$! 材 料
橄榄油（北京芳草医药研制公司）；聚乙烯醇（上
! 收稿日期："%%#>!">%#
作者简介：逄淑召（!(04>），男，硕士研究生，研究方向：生物科学与技术。
联系人：郭慧云，YJI：%/#!>4(/%/4/，W>R@EI：,SJV[ "%%/
·&"·
生 物 加 工 过 程
H第 "卷第 !期
"%%/年 "月
万方数据
海化学试剂采购供应站）；三丁酸甘油酯（天津巨能
化学有限公司）；荧光假单孢菌 !"#$%&’&()" *+$&,#"-
.#(.# !"#$（吉林大学分子酶学工程教育部重点实验
室保存）。
%&’ 分离筛选
将荧光假单孢菌 !"#$%&’&()" *+$&,#".#(.# !"#$
菌种在斜面培养基上进行活化，在三丁酸甘油酯平
板培养基上进行筛选，找到产酶能力高者进行涂平
板操作，进一步找到产透明圈大的菌株进行产酶条
件优化。
%&$ 酶活的测定
发酵液中脂肪酶酶活的测定采用经典的聚乙烯
醇橄榄油乳化液方法［(］。酶活力单位的定义：)* +，
,- (&!条件下，以每分钟产生 %!./0脂肪酸所需的
酶量定义为 %个活力单位（!./0·.12
3 %·.03%）。
! 结果与讨论
’&% 通气量对 !"#$%&’&()" *+$&,#".#(.# !"#$产酶的
影响
固定摇瓶的装载量，通过改变发酵过程中摇床
的转速可以实现发酵过程中的不同通气量，由此探
讨通气量对产酶的影响，结果见图 %。
图 % 摇床转数对酶活的影响
4156 % 7889:;< /8 <=125 >9?’< @/;A;9 <,99? /2 B1,A<9 ,@/?C:125 8@/.
!"#$%&’&()" *+$&,#".#(.# !"#$ <;@A12
由图 % 可以看出，在发酵过程中转速取 ’**
@D.12为宜。
’&’ 不同碳源对 !"#$%&’&()" *+$&,#".#(.# !"#$产酶
的影响
碳是构成微生物细胞结构和代谢产物中碳骨架
来源的重要营养物质。在产酶基本培养基上加入酵
母抽提物作为固定的氮源，选取了几种比较常见的
碳源，研究了不同碳源对产酶的影响。结果如表 %。
表 % 不同碳源对 !"#$%&’&()" *+$&,#".#(.# !"#$产酶的影响
EA>B9 % 7889:;< /8 ?1889@92; :A@>/2 8@/. !"#$%&’&()" *+$&,#".#(.# !"$ <;@A12
不同碳源（’F，/D 0） 酶活D（!./0·.12
3 %·.03 %）
糊 精 *&"
蔗 糖 %&#
葡萄糖! )&’!
淀 粉 G&*
麦芽糖 ’&(!
!：葡萄糖作碳源的质量浓度为 %F。
由表 %可见，淀粉和葡萄糖都比较适合于作为
!"#$%&’&()" *+$&,#".#(.# !"#$ 培养的碳源。考虑成
本，选用淀粉为 !"#$%&’&()" *+$&,#".#(.# !"#$培养的
碳源为宜。
’&$ 不同氮源对 !"#$%&’&()" *+$&,#".#(.# !"#$产酶
的影响
氮同碳一样是构成微生物细胞结构和代谢产物
中含氮物质的重要营养物质。在产酶培养基中以淀
粉为碳源，比较了几种常见的无机氮和几种有机氮
对产酶的影响，结果如表 ’。
表 ’ 不同氮源对 !"#$%&’&()" *+$&,#".#(.# !"#$产酶的影响
EA>B9 ’ 7889:;< /8 ?1889@92; 21;@/592 8@/. !"#$%&’&()" *+$&,#".#(.# !"$ <;@A12
不同氮源（’F，/D 0） 酶活D（!./0·.12
3 %·.03 %）
酵母抽提物 %(&*
玉米浸出液 G&’
蛋白胨 !&*
牛肉膏 "&’!
尿素 %&(!
H-)IB *&*
（H-)）’ JK) %&*
HAHK$ %&)
H-)HK$ $&’
由表 ’可知，有机氮源明显优于无机氮源，其中
以酵母抽提物为最佳，所以实验选取酵母抽提物作
为 !"#$%&’&()" *+$&,#".#(.# !"#$培养的氮源。
’&) 金属离子对 !"#$%&’&()" *+$&,#".#(.# !"#$产酶
的影响
以酵母抽提物作为氮源，以淀粉为碳源，在培养
基中加入不同金属离子，检测金属离子对 !"#$%&-
’&()" *+$&,#".#(.# !"#$产酶的影响，以不加任何金属
’**)年 ’月 逄淑召等：荧光假单胞菌 !"#$%&’&()" *+$&,#".#(.# !"#$产脂肪酶条件的优化 ·#$·
万方数据
离子的发酵条件作为空白对照组，结果如表 !。
表 ! 不同金属离子对 !"#$%&’&()" *+$&,#"-#(-# "#$!产酶的影响
%&’() ! *++),-. /+ 01++)2)3- 4)-&( 1/3. /3 (15&.) 52/06,137 +2/4
!"#$%&’&()" *+$&,#"-#(-# "#! .-2&13
不同金属离子（89，.: /） 相对酶活:9
空白 8;;
<&= > 8;"
?> 88@
A7= > 8!!
B3= > C@
A3= > @=
<6= > D"
E(! > $#
F)= > C!
F)! > $"
G1> #=
由表 !可知，?>、<&= >、A7= >对产酶有一定的促
进作用，以 ?>、A7= >促进效果较为明显。故实验选
取 ?>、A7= >作为培养基的成分，以促进菌株产酶。
=H" 荧光假单孢菌 !"#$%&’&()" *+$&,#"-#(-# "#$!产
酶条件优化的正交试验
为进一步确定荧光假单孢菌 !"#$%&’&()" *+$&0
,#"-#(-# "#$!较优的发酵培养条件，在前面各个单因
素实验的基础上，固定摇床转速，考察 $个因素（E：
酵母抽提物；I：温度；<：5J；K：A7=BLD·CJ=L:7；*：淀
粉；F：诱导剂），每个因素均取 !个水平（各因素水平
的具体条件见表 D），选用正交表 G8@（= M !C）进行试
验，将 $个因素依次安排在正交表 G8@（= M !C）的 =、
!、"、$、C、@列，指标为酶活（!4/G·413
N 8·4GN 8）。8@
次试验的结果依次为：8@H;，8!H=，8CH"，8;H=，@H!，
"H$，8!H@，8=H;，8"HD，8!HC，8$H=，8DH;，8;HD，CH"，
"H;，8;HD，88H;，8=H!。对试验结果用极差分析法进
行统计分析，结果见表 "。
表 D 因素水平表
%&’() D F&,-/2. &30 ()O)(.
水平
因 素
E
:7
I
:P
<
:5J
K
:7
*
:7
F
:7
8 =H; !; CH; ;H;" =H; ;H=
= 8H" =@ CH" ;H8 8H" ;H"
! !H; != @H; ;H;! 8H; ;H@
表 " 试验结果的计算表
%&’() " %Q) 2).6(-. /+ -Q) 52/5)2 -).-
计算项 E I < K * F
18 #=H$ C8H; C"H@ C!HD C!H$ C8H@
1= DCH; C=H! C=H; $DH@ $=H! $@HC
1! CDH# C8H= $$HC C$H! C@H$ CDH;
28 R 18 :$ 8"HD!! 88H@!! 8=H$!! 8=H=!! 8=H=$C 88H#$C
2= R 1= :$ CH@!! 8=H;"; 8=H;;; 8;H@;; 8;H!@! 88HD";
2! R 1! :$ 8=HD@! 88H@$C 88H88C 8=HC8C 8!H8;; 8=H!!!
3 CH$;; ;H=8C 8H"8$ 8H#8C =HC8C ;H@@!
根据表 "中 S值的大小可知，因素的显著性顺
序为：酵母抽提物 T淀粉 T A7= > T 5J T诱导剂 T温
度；根据 24值的大小可知，各因素的优水平组合为：
E8*!K!<8F! I=；因为因素 F、I的 3 值小，是非显著
因素，从节约原材料和能源的角度来考虑，F（诱导
剂）取第 8水平即 ;H= 7，I取 =@ P。
正交试验结果表明，荧光假单孢菌 !"#$%&’&()"
*+$&,#"-#(-# "#$!的最佳培养基组成为：酵母抽提物 =
7，淀粉 8H; 7，A7=BLD·CJ=L ;H;! 7，诱导物 ;H= 7，水
8 G，5J CH;，培养温度为 =@ P。
! 结 论
荧光假单孢菌 !"#$%&’&() *+$&,#"-#(-# "#$!的最
优产酶条件为：摇床转速 =;; 2:413，培养温度 =@ P；
最佳培养基组成为：酵母抽提物 = 7，淀粉 8H; 7，
A7=BLD·CJ=L ;H;! 7，诱导物 ;H= 7，水 8 G，5J C。
（注：文中培养基中的物质的添加量均为每 8;;
7培养基中的量）
·$D· 生物加工过程 第 =卷第 8期
万方数据
参考文献：
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最适条件研究［#］" 工业微生物，!OO,，%,（!）：%+(%,"
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微生物，!OO,，%,（+）：!-(!’"
［’］ 陈守文，徐 柔，章克昌，等 " 微球菌的脂肪酶合成调节［#］" 微
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学性质［#］" 吉林大学自然科学学报，!OOO，（)）：O!(O)"
（上接第 ),页）
对照样品，说明实验条件下的冻融处理对多糖的提
取作用不大。而微波处理的样品，其提取过程可能
会对多糖有破坏作用。
表 ) 不同的多糖提取方法的提取效果比较
./EF1 ) D86G/03>8B 8A G8FI>/99:/03C1> 1P=0/9=38B 1AA19=>
8A C3AA101B= 61=:8C>
处理方法
对照
（不处理）
酶法 冻融 研磨
微波
（!次）
微波
（%次）
多糖量Q（6MQ62） +")& )"&) +"%, )"&’ %"+’ %"&&
! 结 论
通过对牛肝菌在不同培养基中的发酵及产多糖
的研究，得到了适应于多糖生产的培养基成份：土豆
%&& 6MQ62，葡萄糖含量为 ,& 6MQ62，初始 GR为 -"- S
,"&。在此葡萄糖浓度和初始 GR为 ,"&条件下，%, T
!%- 0Q63B摇瓶培养 - C，多糖产量为 ,"* 6MQ62。用研
磨和添加酶等方法对菌丝进行破壁处理以释放胞内
多糖；与对照相比，酶法和研磨处理方法的多糖提取
量分别增加了 !’"’U和 %&U
用价格较低的糖蜜代替葡萄糖，增加多糖产量，
有利于降低成本，充分利用资源。
参考文献：
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!OO)$
%&&)年 %月 逄淑召等：荧光假单胞菌 !"#$%&’&()" +,$&-#".#(.# -O,+产脂肪酶条件的优化 ·,-·
万方数据