全 文 ：第７卷第５期
２００９年９月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．５
Ｓｅｐ．２００９
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１７６２－３６７８．２００９．０５．００４
收稿日期：２００８－１２－３０
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）资助项目（２００７ＡＡ０２Ｚ２２６）
作者简介：孙 鹏（１９８４—），男，湖北老河口人，硕士研究生，研究方向：生物催化；倪 晔（联系人），副教授，Ｅｍａｉｌ：ｙｎｉ＠ｊｉａｎｇｎａｎｅｄｕｃｎ
羰基还原酶产生菌 ＳＷ ２０２６的产酶条件及其
不对称催化还原４′氯苯乙酮
孙 鹏，张 文，倪 晔，郑 璞，孙志浩
（江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 ２１４１２２）
摘 要：以４′氯苯乙酮为模型底物，对筛选得到的ＣａｎｄｉｄａｋｒｕｓｅｉＳＷ２０２６的羰基还原酶产酶条件进行研究。结果
表明：适宜的发酵培养基组成为甘油５０ｇ／Ｌ，玉米浆２０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４４ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ１５ｇ／Ｌ；适宜的培养条件
为温度３０℃，初始ｐＨ６，摇床转速２００ｒ／ｍｉｎ，发酵周期 ４８ｈ。在产酶发酵条件下培养的湿细胞对４′氯苯乙酮进
行不对称还原反应，产物（Ｓ）４′氯 α 苯乙醇的产率最高达８８５６％，ｅｅ值稳定在８７％左右。
关键词：不对称还原；４′氯苯乙酮；芳香酮；产酶条件
中图分类号：Ｑ５５４＋．９ 文献标志码：ＴＱ０３３ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０５－００１９－０６
Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆ４′ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅｂｙ
ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｃａｒｂｏｎｙｌｒｅｄｕｃｔａｓｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｓｔｒａｉｎＣａｎｄｉｄａｋｒｕｓｅｉＳＷ ２０２６
ＳＵＮＰｅｎｇ，ＺＨＡＮＧＷｅｎ，ＮＩＹｅ，ＺＨＥＮＧＰｕ，ＳＵＮＺｈｉｈａｏ
（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，
ＳｃｈｏｏｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＪｉａｎｇｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆ４′ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅｔｏｉｔｓｃｏｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｃｈｉｒａｌａｌｃｏｈｏｌｉｎｔｈｅａ
ｑｕｅｏｕｓｐｈａｓｅｗａｓｃｈｏｓｅｎａｓｔｈｅｍｏｄｅｌｒｅａｃｔｉｏｎｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｎｔｈｅａｓｙｍ
ｍｅｔｒｉｃｒｅｄｕｃｔｉｏｎ．ＣａｎｄｉｄａｋｒｕｓｅｉＳＷ２０２６ｓｈｏｗｅｄｈｉｇｈｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙｔｏａｓｅｒｉｅｓｏｆｈａｌｏｇｅｎａｔｅｄａｒｏ
ｍａｔｉｃｋｅｔｏｎｅｓ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅ：ｇｌｙｃｅｒｏｌ５０ｇ／Ｌ，ｃｏｒｎｓｔｅｅｐｌｉｑｕｏｒ２０ｇ／Ｌ，
４ｇ／ＬＫＨ２ＰＯ４，１５ｇ／ＬＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，ｉｎｉｔｉａｌｐＨ６，３０℃，ｒｏｔａｔｉｏｎｓｐｅｅｄ２００ｒ／ｍｉｎ，ａｎｄｆｅｒｍｅｎｔａ
ｔｉｏｎｔｉｍｅ４８ｈＡｆｔｅｒｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，ｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆ（Ｓ）４′ｃｈｌｏｒｏαｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌａｌｃｏｈｏｌｗａｓｉｍｐｒｏｖｅｄｔｏ
８８５６％ ａｎｄｅｅｗａｓｉｍｐｒｏｖｅｄｔｏ８７％
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｒｅｄｕｃｔｉｏｎ；４ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ；ａｒｏｍａｔｉｃｋｅｔｏｎｅ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
手性芳香醇是多种芳香醇胺类合成药，如 Ｉｓｏ
ｐｒｏｔｅｒｎｏｌ（异丙去肾上腺素）、Ｐｈｅｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ（苯肾上
腺素）、新的抗抑郁药物 Ｔｏｍｏｘｅｔｉｎｅ（托莫西汀）、
Ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅ（氟西汀）和平喘药 Ｓａｌｂｕｔａｒｎｏｌ（沙丁胺
醇）等药物的重要中间体［１－３］。由于其在新药研发
中的巨大潜力，手性芳香醇已成为研究的热点。目
前，获得高光学纯度的芳香醇的主要途径是：化学
不对称还原，脂肪酶选择性拆分及生物法不对称还
原等。利用全细胞对手性芳香酮进行不对称还原
具有反应条件温和、成本低、环境好等优点，而且与
酶法还原相比，不需添加价格昂贵的辅酶，只需添
加少量辅底物即可实现辅酶再生。因此，利用全细
胞进行不对称还原由于其独特的优势而受到越来
越多研究者的重视［４－６］。
由于细胞中的酶系复杂多样，因此在整体细胞
催化的还原反应中存在产物光学纯度较低，副产物
较多等问题，从而导致产物分离纯化困难、底物利
用率低。通过产酶菌株筛选、发酵产酶条件优化，
可以有效地提高菌体细胞的立体选择性和产
率［７－１１］。本文对假丝酵母 ＣａｎｄｉｄａｋｒｕｓｅｉＳＷ２０２６
的羰基还原酶产酶条件进行优化，并考察该菌株对
一系列卤代芳香酮底物的反应的产物收率和对映
体过量值的影响。
１ 材料和方法
１１ 菌株
所用菌株均为工业生物技术教育部重点实验
室保藏菌株。
１２ 材料与试剂
４′氯苯乙酮、４′溴苯乙酮购自安徽广德科苑
化工有限公司；α 氯苯乙酮、α 溴苯乙酮购自江苏
常州市江南医药原料厂；４′氨基苯乙酮购自集团上
海化学试剂公司。外消旋醇由硼氢化钠还原制得，
其他试剂均为市售分析纯试剂。
１３ 培养基
斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基（以麦芽粉配
成１０°的麦芽汁加２％的琼脂制成）。
初始发酵培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖 ５０，酵母膏 ２０，
ＫＨ２ＰＯ４４，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ１５。ｐＨ６０。
１４ 菌种培养
斜面培养：３０℃培养４８ｈ。
种子培养：将培养好的斜面接入装液１００ｍＬ的
５００ｍＬ三角瓶中，于３０℃、１８０ｒ／ｍｉｎ下培养２４ｈ。
发酵培养：将培养２４ｈ后的种子以１０％的接种
量转接入装１００ｍＬ发酵液的５００ｍＬ三角瓶中，于
３０℃、１８０ｒ／ｍｉｎ下发酵４８ｈ。
１５ 吸光度的测定
取１ｍＬ发酵液用蒸馏水稀释至１００ｍＬ，在波
长６６０ｎｍ下测定其ＯＤ值，即为ＯＤ６６０。
１６ 水相不对称还原
取５０ｍＬ发酵液，离心分离菌体，以 Ｎａ２ＨＰＯ４
ＮａＨ２ＰＯ４缓冲液（０１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７０）洗涤，悬浮于
１０ｍＬ同一缓冲液中，加入底物５０ｍｇ，在３０℃、１８０
ｒ／ｍｉｎ下反应２４ｈ。
１７ 芳香酮羰基还原酶酶活测定
取５０ｍＬ发酵液，离心分离菌体，以磷酸盐缓冲
液（０１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７０）洗涤，悬浮于１０ｍＬ同一缓
冲液中，加入 ５ｇ／Ｌ４′氯苯乙酮，在 ３０℃、１８０
ｒ／ｍｉｎ下反应１ｈ，用１０ｍＬ氯仿萃取，用无水ＭｇＳＯ４
干燥，过滤后用氯仿定容至１０ｍＬ，气相色谱分析产
物的生成量，并计算每升发酵液中细胞的酶活。
芳香酮羰基还原酶酶活定义：３０℃下，每分钟
催化４′氯苯乙酮生成１μｍｏｌ（Ｓ） ４′氯 α 苯乙
醇所需要的酶量即为１个酶活单位（Ｕ）。
１８ 产物分析
气相色谱分析：美国 ＶＡＲＩＡＮ的 ＣＰ３９００，配置
Ｓｔａｒ工作站，氢火焰离子检测器。
反应物和产物浓度的测定：采用 ＶＡＲＩＡＮＣＰ
ＷＡＸ５２ＣＢ极性色谱柱（３０ｍ×０２５ｍｍ×０２５
μｍ），分析条件为气化室温度２７０℃，检测器温度
２７０℃，柱温１００℃保留２ｍｉｎ，以１０℃ ／ｍｉｎ升温至
２４０℃维持２ｍｉｎ，载气为Ｈ２，流量为２０ｍＬ／ｍｉｎ，分
流比１∶５０。
产物对映体过量值的测定：用手性色谱柱 ＣＰ
ＣｈｉｒａｓｉｌＤｅｘＣＢ（２５ｍ×０２５ｍｍ×０２５μｍ）分离，
分析条件同反应物质量浓度测定条件。
产率 ＝ｎ（生成产物）ｎ（初始底物）×１００％
ｅ．ｅ．值 ＝
ＡＳ－ＡＲ
ＡＳ＋ＡＲ
×１００％
式中：ＡＳ为Ｓ构型产物的峰面积；ＡＲ为 Ｒ构型产物
的峰面积。
２ 结果与讨论
２１ Ｃ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ ２０２６发酵产酶条件的研究
２１１ Ｃ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ２０２６发酵产酶培养基成分的
优化
按材料与方法中设定的初始发酵培养基配方
条件，进行 Ｃ源、Ｎ源、无机盐等培养基组分优化
研究。
１）发酵产酶培养基Ｃ源的确定
用无Ｃ源发酵培养基，按５０ｇ／Ｌ的质量浓度分
别添加乳糖、甘油、蔗糖、菊糖、木糖、葡萄糖、果糖、麦
芽糖，发酵４８ｈ，测定细胞生物量，结果如图１所示。
０２ 生 物 加 工 过 程 第７卷
图１ Ｃ源对Ｃ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ ２０２６细胞生长的影响
Ｆｉｇ．１ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｓｏｎｃｅｌ
ｇｒｏｗｔｈｏｆＣ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ ２０２６
由图１可知：适合菌株生长的 Ｃ源主要是甘
油、葡萄糖、果糖。对３种适合菌种生长的 Ｃ源进
行了复筛，考察Ｃ源对比酶活和产物ｅｅ值的影响，
结果以甘油为 Ｃ源时比酶活最高，而 ３种 Ｃ源对
ｅｅ值几乎没有影响，结果见表１。
表１ Ｃ源对比酶活和ｅｅ值的影响
Ｔａｂｌｅ１ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｓｏｎｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄ
ｅｅｖａｌｕｅｓ
Ｃ源 ｅｅ／％ 比酶活／（Ｕ·Ｌ－１）
果糖 ８９２１±１７５ １９７±００４
甘油 ８７２６±２８０ ２５４±００３
葡萄糖 ８７７１±３２２ ２０９±０１１
２）发酵产酶培养基Ｎ源的确定
用无Ｎ源的发酵培养基，按２０ｇ／Ｌ质量浓度分
别添加酵母膏、蛋白胨、尿素、玉米浆（粉）、脱脂豆
粉、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＮａＮＯ３，发酵４８ｈ，测菌
体浓度，同时测定菌体酶活和ｅｅ值，结果见表２。
表２ Ｎ源对Ｃ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ ２０２６发酵产酶的影响
Ｔａｂｌｅ２ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓｏｎｃａｒｂｏｎｙｌｒｅｄｕｃｔａｓｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＣ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ ２０２６
Ｎ源 ＯＤ６６０ ｅｅ／％ 比酶活／（Ｕ·Ｌ－１）
酵母膏 ０３１２±００４０ ８２３０±１７０ １７１±００３
蛋白胨 ０３０６±０００５ ８７１４±２４６ ２２７±００６
尿素 ０２６１±００２３ ８３７６±０８５ １８４±００４
玉米浆 ０３２３±００１０ ８６７６±２３３ ２７２±０１３
脱脂豆粉 ０２６８±００４７ ８３４２±１５９ １９７±００５
ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４ ０２３２±００１２ ８５４１±０４２ ２０６±００６
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０１７７±００２０ ９０６２±２３７ １９０±００６
ＮａＮＯ３ ０１５１±００２１ ８７４６±１０８ １５２±００２
由表２可知：以（ＮＨ４）２ＳＯ４作为 Ｎ源时，ｅｅ值
最高但酶活偏低，而玉米浆作为 Ｎ源酶活最高。选
择（ＮＨ４）２ＳＯ４和玉米浆作为Ｎ源设计正交试验考察
两者相互作用，以确定一个最佳配比。
３）金属离子及磷酸盐对发酵产酶的影响
Ｐ是细胞的重要组成元素并参与 ＡＴＰ、ＮＡＤＰＨ
的合成，Ｋ＋具有调节细胞膜通透性而 Ｍｇ２＋是多种
醇脱氢酶的激活剂。因而，培养基中 Ｋ＋、Ｍｇ２＋对细
胞产酶都有重要的影响。通过添加不同质量浓度
的ＫＨ２ＰＯ４和ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，考察这些离子对羰基还
原酶酶活的影响（图２，图３）。
图２ ＫＨ２ＰＯ４对Ｃ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ ２０２６发酵产酶的影响
Ｆｉｇ．２ ＥｆｅｃｔｓｏｆＫＨ２ＰＯ４ｏｎｃａｒｂｏｎｙｌｒｅｄｕｃｔａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆＣ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ ２０２６
由图２可知：ＫＨ２ＰＯ４对细胞生物量及 ｅｅ值均
没有显著影响，在４ｇ／Ｌ时酶活最高。
由图３可知：Ｍｇ２＋对ｅｅ值的没有明显影响，但
对细胞生物量和酶活的影响显著，在添加１５ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ时酶活最大。
图３ Ｍｇ２＋对Ｃ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ ２０２６发酵产酶的影响
Ｆｉｇ．３ ＥｆｅｃｔｓｏｆＭｇ２＋ｏｎｃａｒｂｏｎｙｌｒｅｄｕｃｔａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆＣ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ ２０２６
４）发酵产酶培养基组分的正交试验
通过培养基正交实验考察Ｃ、Ｎ源及金属离子的
１２ 第５期 孙 鹏等：羰基还原酶产生菌 ＳＷ２０２６的产酶条件及其不对称催化还原４′氯苯乙酮
交互影响并确定其最适添加质量浓度。设计了四因素 三水平正交试验，ＫＨ２ＰＯ４为４ｇ／Ｌ。结果见表３。
表３ 培养基组分四因素三水平正交试验结果
Ｔａｂｌｅ３ ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＬ９（３
４）ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌａｒｒａｙｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｏｎｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ
因素
Ａ
ρ（甘油）
Ｂ
ρ（玉米浆）
Ｃ
ρ（（ＮＨ４）２ＳＯ４）
Ｄ
ρ（ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ）
比酶活／
（Ｕ·Ｌ－１）
１（４０ｇ／Ｌ） １（１０ｇ／Ｌ） １（０ｇ／Ｌ） １（０７５ｇ／Ｌ） ２３９±００７
１ ２（２０ｇ／Ｌ） ２（５ｇ／Ｌ） ２（１５ｇ／Ｌ） ２３１±００６
１ ３（３０ｇ／Ｌ） ３（１０ｇ／Ｌ） ３（２２５ｇ／Ｌ） １８７±００４
２（５０ｇ／Ｌ） １ ２ ３ ２１８±００４
２ ２ ３ １ ２２０±００２
２ ３ １ ２ ２７０±００１
３（６０ｇ／Ｌ） １ ３ ２ １９６±０２０
３ ２ １ ３ ２４２±０１４
３ ３ ２ １ ２４８±０１０
根据图４的正交试验结果，确定优化后的发酵
培养基配方：甘油 ５０ｇ／Ｌ，玉米浆 ２０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４·
７Ｈ２Ｏ１５ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４４ｇ／Ｌ。
图４ 培养基各因素对酶活影响的正交优化趋势
Ｆｉｇ．４ ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅＬ９（３
４）
ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌａｒｒａｙｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
２１２ 培养基初始 ｐＨ对 Ｃ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ２０２６发酵
产酶的影响
ｐＨ是影响细胞生长的一个重要因素而且对菌
体各种酶的活性有调节作用。考察初始 ｐＨ对产酶
的影响，结果见图５。由图５可知：培养基初始 ｐＨ
对ｅｅ值的影响不大，但对菌体的生长和酶活有明
显的影响：当初始ｐＨ在６０时，产酶和菌体生长都
达到最佳水平。
图５ 培养基初始ｐＨ对Ｃ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ ２０２６
发酵产酶的影响
Ｆｉｇ．５ ＥｆｅｃｔｓｏｆｐＨｏｎｃａｒｂｏｎｙｌｒｅｄｕｃｔａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ
Ｃ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ ２０２６
２１３ 温度对Ｃ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ２０２６发酵产酶的影响
温度是影响细胞生长和发酵产酶的一个重要
因素，发酵温度对细胞产量及羰基还原酶酶活的影
响的考察，结果见图６。由图６可知：细胞生物量和
酶活均在３０℃时最高，在２０～３５℃之间对转化产
物ｅｅ值影响不大，４０℃时产物ｅｅ值明显升高，但
２２ 生 物 加 工 过 程 第７卷
细胞生物量和酶活均严重下降。试验结果表明适
宜发酵温度为３０℃。
图６ 温度对Ｃ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ ２０２６发酵产酶的影响
Ｆｉｇ．６ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｃａｒｂｏｎｙｌｒｅｄｕｃｔａｓｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＣ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ ２０２６
２１４ 摇瓶转速对 Ｃ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ２０２６发酵产酶的
影响
摇瓶转速不仅影响发酵液中的溶氧，而且对发
酵过程的传质有着重要影响。摇瓶转速对Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ
ＳＷ２０２６发酵的细胞产量、氧化还原酶酶活及选择
性的影响，结果见图 ７。由图 ７可知：摇瓶转速在
２００ｒ／ｍｉｎ时，酶活最高，而转速对 ｅｅ值几乎没有
影响。
图７ 摇瓶转速对Ｃ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ ２０２６发酵产酶的影响
Ｆｉｇ．７ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｒｏｔａｔｉｏｎｓｐｅｅｄｏｎｃａｒｂｏｎｙｌｒｅｄｕｃｔａｓｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＣ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ ２０２６
２２ Ｃ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ ２０２６发酵产酶的时间进程
发酵时间对菌体产量及产酶都有一定影响，如
图８所示。Ｃ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ２０２６在经优化后的培养基
和优化后的培养条件下进行发酵培养。该菌大约
发酵４８ｈ时，比酶活达到最大（３Ｕ／Ｌ左右），延长
时间比酶活没有增加。
２３ Ｃ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ ２０２６全细胞不对称还原４′氯
苯乙酮反应
以优化后的发酵培养条件获得湿菌体催化
图８ Ｃ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ ２０２６生长及产酶时间曲线
Ｆｉｇ．８ Ｔｉｍｅｃｏｕｒｓｅｏｆｃｅｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｅｎｚｙｍｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＣａｎｄｉｄａｋｒｕｓｅｉＳＷ ２０２６
不对称还原４′氯苯乙酮反应。每隔一定时间取
样，测定其产率和 ｅｅ值，结果见图 ９。由图 ９可
知：前４ｈ，由于 Ｒ型产物质量浓度较低超出气相
色谱检测的线性范围，使得 ｅｅ值的测定结果偏
高。从图 ２可以看出，转化 ２４ｈ后反应达到平
衡，反应２４ｈ产率达到８０％，ｅｅ值为８７％。
图９ 转化进程曲线
Ｆｉｇ．９ Ｔｉｍｅｃｏｕｒｓｅｏｆｔｈｅａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆ
４′ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅｂｙＣ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ ２０２６
２４ Ｃ．ｋｒｕｓｅｉＳＷ ２０２６全细胞对不同卤代芳香酮
的不对称还原反应
选择４′氯苯乙酮、α 氯苯乙酮、４′溴苯乙酮、
α 溴苯乙酮等４种卤代芳香酮和４′氨苯乙酮作为
反应底物，用发酵培养条件优化前后的全细胞进行
转化比较，结果如表４所示。优化后产率和 ｅｅ值
都有不同程度的提高，尤其以４′氯苯乙酮为底物
时，产率可提高２７％左右，ｅｅ值为８７％左右。同
时，苯乙酮上取代基的种类和位置不同，转化能力
和立体选择性上存在明显差别，甚至构型相反。对
于卤代芳香酮，该菌表现出较高的催化效率而对
４′氨基苯乙酮没有还原能力，这一结果与文献
［１２－１３］报道的结果吻合。
３２ 第５期 孙 鹏等：羰基还原酶产生菌 ＳＷ２０２６的产酶条件及其不对称催化还原４′氯苯乙酮
表４ 优化前后的培养条件对不同芳香酮还原效果的比较
Ｔａｂｌｅ４ Ｔｈｅｃｏｍｐａｒｉｓｉｏｎｏｆａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｒｅｄｕｃｔｉｏｎｂｙｙｅａｓｔｃｅｌｓａｔｄｉｆｅｒｅｎｔｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
底 物
优化后 优化前
产率／％ ｅｅ值／％ 构型 产率／％ ｅｅ值／％ 构型
４′氯苯乙酮 ８８５６±２７０ ８６９４±１９５ Ｓ ６０８３±３２７ ８５８４±０９６ Ｓ
α 氯苯乙酮 ２５１０±０６５ ８７４３±２０６ Ｒ ２９０５±１０４ ７８８４±１２１ Ｒ
４′溴苯乙酮 ２９７５±０５１ ７２３０±０７４ Ｓ １９５３±１３７ ７１０２±０７２ Ｓ
α 溴苯乙酮 ７５１７±１８３ ８１４０±０６９ Ｒ ８０２８±１０５ ７６５７±１２５ Ｒ
４′氨基苯乙酮 ０ － － ０ － －
注：转化条件为底物 ５０ｍｇ，湿菌体 ２ｇ（干质量 ０７ｇ），１０ｍＬＮａ２ＨＰＯ４ＮａＨ２ＰＯ４缓冲液（０１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７０），
温度３０℃，转速１８０ｒ／ｍｉｎ。
３ 结 论
通过对假丝酵母 ＣａｎｄｉｄａｋｒｕｓｅｉＳＷ２０２６发酵
产酶条件的优化，得到最佳发酵培养基：甘油
５０ｇ／Ｌ，玉米浆２０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４４ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ
１５ｇ／Ｌ。适宜的培养条件：发酵温度３０℃，培养
基初始 ｐＨ６，摇床转速为 ２００ｒ／ｍｉｎ，发酵时间
４８ｈ。用此产酶发酵条件培养的菌体对４′氯苯乙
酮进行不对称还原反应，产物（Ｓ） ４′氯 α 苯乙
醇的产率由优化前的６０８３％左右提高到８８５６％，
ｅｅ值稳定在８７％左右。
参考文献：
［１］ 张毅立，廖建，陈代谟，等．苯乙醇胺类药物的不对称合成［Ｊ］．
化学研究与应用，１９９９，１１（５）：４８０４８３．
ＺｈａｎｇＹｉｌｉ，ＬｉａｏＪｉａｎ，ＣｈｅｎＤａｉｍｏ，ｅｔａｌ．Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆ
ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅｓ［Ｊ］．ＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，
１９９９，１１（５）：４８０４８３．
［２］ ＹａｎｇＧＳ，ＯｕＺＭ，ＹａｏＳＪ，ｅｔａｌ．Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆ３ｃｈｌｏ
ｒｏｐｒｏｐｉｏｐｈｅｎｏｎｅｔｏ（Ｓ）３ｃｈｌｏｒｏ１ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｌｕｓｉｎｇｉｍｍｏ
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４２ 生 物 加 工 过 程 第７卷