全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 1期
利用基因工程改良植物类胡萝卜素的合成
马敬 1, 2 姜娜娜 3 王兴军1, 2
( 1山东师范大学生命科学学院,济南 250014; 2山东省农业科学院高新技术研究中心山东省作物与畜禽品种改良生物技术重点实验室
农业部黄淮海作物遗传改良与生物技术重点开放实验室,济南 250100; 3山东现代职业学院,济南 250100 )
摘 要: 类胡萝卜素 ( ca ro teno ids)是植物体内存在的一类重要天然色素物质的总称, 其生物功能广泛。类胡萝卜素是
人类饮食结构中重要的组成部分,并且在医药、化妆品及食品与饲料工业等方面扮演着重要的角色。类胡萝卜素还是一些维
生素合成的前体, 具有多种保健功能, 可以提高人体免疫力, 并具有抗癌的功效。目前有大量关于提高植物体内类胡萝卜素
含量及定向改变其种类的研究,对类胡萝卜素代谢途径及其调控的理解是这些研究的基础。主要阐述植物天然类胡萝卜素
的生物合成及利用基因工程对类胡萝卜素改良的研究进展。
关键词: 类胡萝卜素 生物合成 基因克隆 基因工程
Study of Improving P lant Carotenoids Synthesis by Genetic Engineering
M a Jing1, 2 JiangNana3 W ang X ing jun1, 2
(
1
College of L ife Science, Shandong N ormal University, J inan 250014;
2
H ighT ech Research Center, Shandong A cademy
of A gricultural Science, K ey Laboratory of Crop Genetic Imp rovem ent and B io technology,H uanghuaihai,M inistry
of Agriculture, K ey Laboratory for Genetic Imp rovement of Crop, Animal and Poultry of Shandong
Province, J inan 250100;
3
ShandongM odern Vocational Co llege, Jinan 250100)
Abstrac:t Caro teno ids a re the most w idespread g roup of p igm ents found in nature and have a range o f d iverse functions. Carote
no ids are a lso important com ponent in hum an dietary and p lay im po rtant ro les in m edicine, cosme tics, food and feed. M any caroteno ids
are vitam in precurso rs. They have functions for hum an health, such as improving hum an immunity and anticancer activ ity. Curren tly,
there are a large number of stud ies on im provem ent of ca rotenoid content and directiona l change o f caro teno id types, w hich requ irs un
derstand ing of caroteno id b iosynthesis and regu lation o f the pathw ay. Th is paper summarized the advance o f caroteno id synthesis, gene
clon ing and geneticm odifica tion.
Key words: Caro teno ids B iosynthes is Gene c loning Gene eng inee ring
收稿日期: 20100809
基金项目:山东省优秀中青年科学家科研奖励基金项目 ( 2006BSC 02001 )
作者简介:马敬,女,硕士研究生,研究方向:植物发育生物学; Em ai:l w f_ jingj ing2008@ yahoo. com. cn
通讯作者:王兴军,男,博士,研究员,研究方向:植物发育生物学; Em ai:l xing junw@ hotm ai.l com
类胡萝卜素是一种重要的天然色素物质, 在植
物体内发挥重要的作用, 是一些植物激素 (如
ABA )、芳香物质及防御化合物等合成的前体 [ 1 ] ,在
调节植物的生长和发育过程中具有重要的作用;在
叶绿体的光合作用中, 类胡萝卜素是光合天线和反
应中心复合体不可缺少的结构成分, 具有吸收和传
递电子的能力;同时, 它可以保护叶绿素免受强光导
致的光破坏。由于类胡萝卜素分子结构中含有多个
共轭双键,它还具有猝灭单线态氧的能力 [ 2]。类胡
萝卜素是一种天然的食品添加剂和化妆品的着色
剂,具有安全无毒的优点。类胡萝卜素还是一些维
生素合成的前体, 如 胡萝卜素是维生素 A的前
体, 而维生素 A是人体生存所必须的一种营养素。
目前全球约有 1 /3国家的人口由于缺乏维生素 A
而引发各种健康隐患 [ 3]。
类胡萝卜素是人体不可缺少的一类物质, 但人
体不能自行合成类胡萝卜素,只能从外界摄取。类
胡萝卜素的制备主要有 3种途径: 直接从植物中提
取、微生物发酵 [ 4]和人工合成 [ 5]。几乎所有的植物
都能合成类胡萝卜素, 但是多数植物中含量有限。
2011年第 1期 马敬等 :利用基因工程改良植物类胡萝卜素的合成
微生物发酵的方法已广泛应用于类胡萝卜素的生
产,但产量仍有限。人工合成的类胡萝卜素也远远
不能满足于人们生产和生活的需要, 而且人工合成
的类胡萝卜素不完全具有天然类胡萝卜素所含有的
生理和药理功能。随着分子生物学和基因工程的发
展,对植物类胡萝卜素合成途径有了深入研究,利用
植物生物反应器来生产类胡萝卜素具有广范的应用
前景, 它不仅可以定向改变类胡萝卜素成分,还可以
大幅度的提高类胡萝卜素产量。
1 植物类胡萝卜素的来源与合成
植物类胡萝卜素是由 8个类异戊二烯单位缩合
而成的 C40四萜类色素, 广泛存在于高等植物中,
主要分布在叶片的叶绿体以及花和果实的有色体膜
中,由核编码的酶催化合成。在高等植物体中,类胡
萝卜素主要是在细胞的质体中通过类异戊二烯途径
合成。根据分子中是否含有氧原子,又可将类胡萝卜
素分为胡萝卜素 ( carotene)和叶黄素 ( xanthophy lls)
两大类,其中胡萝卜素是不含氧的类胡萝卜素的总
称,叶黄素是含氧的类胡萝卜素,分子中一般含有一
个或多个氧原子。
植物中还存在特殊的类胡萝卜素,如胭脂树橙,
其主要来源于胭脂树 (B ixa orelana L. )的种子, 胭
脂树橙广泛应用于天然食品的生产和化妆品着色
剂 [ 10] ;藏红花素可以用作食品添加剂, 并且具有降
血脂的功效, 主要在藏红花 ( Crocus sativu s L. )柱头
上合成 [ 11] ;辣椒红素和辣椒玉红素在食品、医药工
业上具有广泛的用途,是辣椒果实中的特征性色素,
花药黄质在辣椒红素 /辣椒玉红素合成酶 ( CCS)的
作用下生成辣椒红素,在 ZEP和 CCS的进一步催化
下生成辣椒玉红素,堇菜黄质可在 CCS催化下直接
转化成辣椒玉红素 [ 11 ] ; 叶黄素能够预防眼睛光损
伤,具有很高的药用价值, 万寿菊 (Tagetes erecta L. )
花瓣中,含有丰富的叶黄素 [ 12]。
类胡萝卜素的生物合成途径在 20世纪 50、60
年代就已经研究得比较清楚 (图 1) [ 6, 7] ,近年来,合
成途径中关键酶基因都已从不同植物中克隆, 这为
通过基因工程定向改变植物体中类胡萝卜素成分的
合成,满足人们生产或研究的需要创造了条件。植
物体内类胡萝卜素合成的第一个前体物质是异戊烯
焦磷酸 ( IPP),在质体中是由葡萄糖分子转化而来。
异戊烯焦磷酸在异戊烯焦磷酸异构酶 ( IPPI)的作用
下生成二甲基丙烯基二磷酸 ( DMAPP)。在= 牛儿
基= 牛儿基焦磷酸合成酶 ( GGPS)催化下, 二甲基
丙烯基二磷酸与 3个异戊烯焦磷酸分子缩合生成含
C20的= 牛儿基= 牛儿基焦磷酸 ( GGPP)。= 牛儿
基= 牛儿基焦磷酸合成酶是 GGPP合成过程中的限
速酶,该酶还在萜类物质的合成中起到重要作用。
两分子的= 牛儿基= 牛儿基焦磷酸在八氢番茄红素
合成酶 ( PSY )的作用下合成八氢番茄红素, 八氢番
茄红素是类胡萝卜素合成途径中第一个无色的类胡
萝卜素分子。= 牛儿基= 牛儿基焦磷酸是八氢番茄
红素生物合成的直接前体, 它同时也是赤霉素、植
醇、维生素 E等物质合成的前体。
八氢番茄红素在八氢番茄红素脱氢酶 ( PDS)和
胡萝卜素脱氢酶 ( ZDS )的作用下, 经过一系列的
脱氢反应、共轭双键延长, 直到形成链孢红素、番茄
红素。番茄红素是自然界 700多种类胡萝卜素中结
构最简单的色素, 目前对番茄红素的研究也相对最
为深入。番茄红素在成熟的番茄、西瓜、胡萝卜和葡
萄等果蔬的果实中含量较高, 在番茄果实中的含量
最高。番茄在成熟过程中其类胡萝卜素含量增加
10- 14倍,番茄红素的含量占总类胡萝卜素的 70%
左右 [ 8]。番茄中提取番茄红素是目前世界上生产
天然番茄红素的最主要的途径。番茄红素的分子式
是 C40H56,分子量为 536. 85,是一种不含氧的、有 11
个共轭双键的非环状胡萝卜素。通常番茄红素都是
反式结构,由于异构作用,植物体内也存在顺式异构
体 [ 9]。生物体中存在两种番茄红素环化酶: 番茄红
素 环化酶 ( LCYb)、番茄红素 环化酶 ( LCYe)。
LCYb催化对称的线性番茄红素分子在两端形成两
个 紫罗酮环, 生成具环的 胡萝卜素; 在 LCYe
和 LCYb两种酶共同作用下, 形成 1个 环和 1个
环的 胡萝卜素。 胡萝卜素和 胡萝卜素的
合成是类胡萝卜素合成途径中的重要分支点。
胡萝卜素在胡萝卜素 环羟化酶 ( BCH )和
胡萝卜素 环羟化酶 ( ECH )的共同作用下羟基化
生成叶黄体素。胡萝卜素在 BCH的作用下经羟基
化生成 隐黄素,最终生成玉米黄素 ( zeaxanthin), 玉
米黄素在玉米黄质环氧酶 ( ZEP)催化下可以生成堇
菜黄素 ( v io laxanth in)。 胡萝卜素还可以在 胡
9
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
萝卜素转酮酶 ( BKT )的作用下催化生成角黄素
( canthaxanthin) ,在 胡萝卜素羟化酶 ( CHY )的进
一步作用下角黄素被催化为虾青素 ( astaxanth in )。
不同类胡萝卜素的合成途径详见图 1。
IPP I.异戊烯焦磷酸异构酶; GGPS. = 牛儿基= 牛儿基焦磷酸合成酶; PSY.八氢番茄红素合成酶; PDS. 八氢番茄红素脱氢酶; ZDS.
胡萝卜素脱氢酶; CRT ISO.类胡萝卜素异构酶; LCD.番茄红素裂解双氧化酶; nBMT.降胭脂树素羧基甲基转移酶; LCYe.番茄红
素 环化酶; LCYb.番茄红素 环化酶; BCH.胡萝卜素 环羟化酶; ECH.类胡萝卜素 环羟化酶; ZCD.玉米黄素裂解双氧化酶;
ZEP.玉米黄素环氧酶; UDPGGT.尿嘧啶核苷二磷酸糖 (UDPG )葡萄糖基转移酶; BADH. 胭脂树素醛脱氢酶; BKT. 胡萝卜素转
酮酶; CCS.辣椒红素 /辣椒玉红素合成酶; NXS.新黄质合成酶
图 1 植物类胡萝卜素的生物合成途径 [ 6, 7]
2 植物类胡萝卜素合成途径中关键酶基因
的克隆与分析
目前植物类胡萝卜素合成途径中的关键酶基因
已相继从许多植物中克隆出来,为进一步了解类胡
萝卜素合成代谢调控以及利用基因工程改变修饰该
途径奠定了基础。
GGPS催化 GGPP的合成, 是类胡萝卜素合成途
径中的第一个关键酶。目前已从拟南芥、胡椒、烟
草、甘草和银杏等植物中分离出 GGPS基因。在拟
南芥中发现至少有 5个不同基因编码的 GGPS,而其
中仅有 2个具有 GGPS的活性 [ 13]。
八氢番茄红素合成酶 ( PSY )催化第一个类胡萝
卜素八氢番茄红素的合成。R ay等 [ 14]从成熟的番
茄果实中克隆了该酶基因的 cDNA序列 ( pTOM 5)。
目前已从辣椒、拟南芥、黄水仙、水稻、柑橘、甜瓜和
西瓜等植物中分离出 PSY基因。研究发现,大多数
高等植物都表达单一的 PSY基因,但也有少数植物
如玉米、番茄、烟草和水稻等有两个 PSY基因 ( PSY1,
PSY2),在这几种植物中这两个 PSY基因间的相似
性都很高, 如在番茄中 PSY 1与 PSY2基因同源性
10
2011年第 1期 马敬等 :利用基因工程改良植物类胡萝卜素的合成
达 86%。
八氢番茄红素脱氢酶 ( PDS)催化八氢番茄红素
向 胡萝卜素的转化。目前已从玉米、水稻、黄水
仙、拟南芥、番茄、柑橘及烟草等植物中分离出 PDS
基因。研究发现,番茄果实成熟过程中, PDS基因表
达增强 10- 20倍,大量类胡萝卜素 (尤其是番茄红
素 )得到积累 [ 15]。烟草的 PDS基因编码 582个氨基
酸,蛋白序列与胡椒和番茄的相似性都非常高。
胡萝卜素脱氢酶 ( ZDS)催化 胡萝卜素向番
茄红素的转化, 也是类胡萝卜素合成途径中的限速
酶。目前已从辣椒、拟南芥、黄水仙、木瓜及小麦等植
物中分离出 ZDS基因,其 cDNA长 1. 8- 2. 3 kb,编码
558- 574个氨基酸 [ 16]。通过对许多植物的研究发现
PDS基因和 ZDS基因间具有 33% - 35% 的同
源性 [ 17]。
Isaacson
[ 18]和 Park等 [ 19]分别鉴定了番茄和拟南
芥的类胡萝卜素异构酶 ( CRTISO) ,发现该酶在大肠
杆菌中表达时具有转化多顺反式番茄红素到全顺反
式番茄红素的能力。植物类胡萝卜素异构酶缺乏脱
氢酶的活性, 却与细菌的八氢番茄红素脱氢酶
( CRT I)有同源性,在非光合细菌中由单一酶 ( CRTI)
来完成的脱氢和异构化反应在植物体中是由 PDS、
ZDS和 CRT ISO这 3种酶共同完成,这 3种酶催化的
产物分别是 9, 9二顺式胡萝卜素 ( 9, 9d icis
carotene)、7, 9, 7, 9四顺式番茄红素 ( 7, 9, 7, 9
tetracislycopene)和全反式番茄红素 ( a lltrans lyco
pene)。此外,还发现番茄中 CRT ISO在花和成熟的
果实中表达增强。
番茄红素 环化酶 ( LCYb)基因和番茄红素
环化酶 ( LCYe)基因等其他重要的基因也相继在
拟南芥、辣椒、番茄、烟草及黄水仙等植物中得到克
隆。番茄中 LCYb和 LCYe这两个酶基因结构比
较相似, 在 N端具有 FAD /NAD ( P)结合域 [ 20] , 且
LCYb与黄质合成酶 ( NSY )和辣椒红素 /辣椒玉红
素合成酶 ( CCS)结构也很相近 [ 21]。 Cunn ingham[ 22]
等发现拟南芥中 LCYb和 LCYe在结构上也较为
相似。
3 利用基因工程改良植物类胡萝卜素的研究
= 牛儿基= 牛儿基焦磷酸是许多途径共同的反
应前体,几种代谢途径的调控之间互相干扰。在番
茄中过量表达 PSY1基因时赤霉素的合成水平会下
降,并促进了类胡萝卜素的合成 [ 23]。利用基因枪的
方法将类胡萝卜素合成途径上的关键酶基因 Zmp
sy1、PacrtI、G llycb、G lbch和 ParacrWt 同时转入白色
玉米中,每个基因都分别带有不同的胚乳特异性启
动子,结果发现,所有的转基因植株都有正常的形态
发育,但在种子胚乳中导入不同基因的组合中呈现
出了不同的颜色表型,表达 Zmpsy1的转基因植株中
积累玉米黄质,胚乳呈现出明亮的黄色;表达 PacrtI
的转基因植株总类胡萝卜素没有明显的增加, 胚乳
产生类似于野生型的颜色表型; 表达 Zmpsy1和
PacrtI的转基因植株积累大量的番茄红素, 呈现出
橘红色的颜色表型;表达 Zmpsy1、PacrtI和 G llycb的
转基因植株积累 胡萝卜素, 呈现橘色的颜色表
型; 表达基因在 Zmpsy1、PacrtI、G lbch、ParacrWt ,
Zmpsy1、PacrtI、G llycb、ParacrWt 和 Zmpsy1、PacrtI、
G llycb、G lbch和 ParacrWt 时,转基因植株颜色表型
从橘色渐向红色转变,这主要是由于类胡萝卜素酮
的积累 [ 24]。
反义表达果实成熟相关基因 PSY1时,该基因表
达水平急剧下降,果实中类胡萝卜素的含量剧烈下
降,参与成熟果实红色形成的番茄红素含量几乎检测
不到,番茄果实呈黄色,而叶中各种类胡萝卜素的含
量不变 [ 25]。研究发现, PSY2主要在叶组织中表达。
L iu等 [ 26]发现在甜橙 ( C itrus sinensis [ L. ] Os
beck)品种 An liu的自发性芽突变体 Hong An
liu,果实中番茄红素含量比野生型中高 1 000倍以
上, 果实颜色由橘色变为红色,而突变体叶中类胡萝
卜素的含量与野生型几乎没有变化。突变体果实汁
囊中番茄红素的积累与其合成途径上游基因 ( PSY、
PDS、ZDS和 CRTISO )较野生型表达增加和下游基
因 ( LCYb)较野生型表达降低相一致。
Rosati等 [ 27 ]利用果实特异性启动子在番茄中
过量或反义表达 Lcyb基因, 结果发现, 过量表达的
转基因植株果实中的 胡萝卜素含量显著增加, 并
随着番茄红素和 胡萝卜素比值的不同, 果实分别
呈现出橘色、橘红色等不同的颜色表型。反义 RNA
表达的番茄果实中 LCYb基因的表达量降低了
50% ,番茄红素的含量几乎没有变化,并且所有的转
基因番茄叶中类胡萝卜素的成分都没有发生改变。
11
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
过量表达番茄红素 环化酶基因, 发现转基因番茄
中番茄红素向 胡萝卜素的转化加强,而且总类胡
萝卜素的含量也增加了 50%以上, 证明番茄红素
环化酶是番茄红素向 胡萝卜素转化的限速酶 [ 28 ]。
在辣椒成熟过程中,叶黄素的酯化反应加强,可
能是由叶黄素积累所诱导 [ 29 ]。植物 环羟化酶基
因 ( BCH )在果实成熟过程中有很高的表达水平,研
究发现,柑橘果实在柑橘皮和果实汁囊中 环羟化
酶基因的表达量均增加, 同时伴随 隐黄素和玉米
黄素大量合成 [ 30]。在拟南芥中过量表达 环羟化
酶基因 ( BCH )使叶黄素 ( xanthophy lls)的含量增加,
其它类胡萝卜素的含量没有明显的变化 [ 31]。反义
表达马铃薯玉米黄素环氧酶基因 ( ZEP)时,转基因
植株块茎中叶黄素及总类胡萝卜素的含量都有较大
幅度地提高 [ 32]。
Davu luri等 [ 33]用果实特异性启动子与 RNA i技
术抑制番茄果实中光敏色素调控基因 DET1的表
达,使该基因在果实中的转录大大降低,果实中类胡
萝卜素和类黄酮的含量大量增加, 而其他类胡萝卜
素成分含量没有发生明显的变化。最近的研究发
现,拟南芥叶中调控 PSY表达的转录因子 APETALA2
(RAP22) ,而 APETALA2的表达则受到了 m iRNA的
调控 [ 34, 35]。
4 展望
类胡萝卜素作为一种天然色素,在人们的生活中
扮演着重要的角色,目前已广泛应用于食品、制药和
化妆品着色等方面,市场需求日益增加。植物基因组
学和转基因技术的飞速发展,使利用基因工程定向改
变类胡萝卜素的种类和含量、改良作物品种、提高作
物附加值成为可能。利用生物反应器在植物中生产
类胡萝卜素能够尽可能地保持其生物活性,产量增
加,应用前景广阔。通过对合成途径上关键酶基因及
相关调控因子的研究,深入了解类胡萝卜素的生物合
成过程的调控及果实和其他有色体中总类胡萝卜素
积累的限制因素,将为人们利用基因工程改良作物中
类胡萝卜素的研究提供更多有价值的信息。
参 考 文 献
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