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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 10期
玫瑰微球菌中 treZ基因在毕赤酵母中的表达研究
杨蕾蕾 袁其朋 李文进 孙新晓
(北京化工大学生命科学与技术学院 ,北京 100029)
　　摘 　要 : 　首次将玫瑰微球菌中麦芽寡糖基海藻糖水解酶 (MTHase) treZ基因序列连接到表达载体 pP ICZαA中 ,通过电
转化法将构建好的表达载体分别转入巴斯德毕赤酵母 GS115和 KM71菌株中。利用含有 Zeocin的 YPD平板筛选到阳性转化
子 ,并经 PCR、SDS2PAGE电泳以及 W estern blot最终验证海藻糖水解酶基因 treZ已经整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上 ,并
且得到了预期的表达。
关键词 : 　MTHase 毕赤酵母 pP ICZαA 分泌表达
Secretory Expression of Maltooligosyltrehalose Trehalohydrolase
P ich ia pastoris from M icrococcus roseus QS412
Yang Leilei Yuan Q ipeng L i W enjin Sun Xinxiao
( College of L ife Science and Technology, B eijing University of Chem ical Technology, B eijing 100029)
　　Abstrac t: 　The gene treZ from M icrococcus roseus QS412, encoding maltooligosyl trehalose trehalohy2drolase (MTHase) , was
cloned and inserted into pP ICZαA, then transformed into P ichia pastoris GS115 and KM71 strains. PCR was used to verify the successful
integration into the gemone of P ich ia pastoris. After induction with 0. 5% methanol, recombinant p rotein was detected by SDS2PAGE and
W estern blotting. W estern blotting showed that the MTHase gene has been successfully exp ressed in strain KM71.
Key wo rds: 　MTHase Pich ia pastoris pP ICZαA Secrotory Exp ression
收稿日期 : 2009205226
基金项目 :国家自然科学基金 (2376007)
作者简介 :杨蕾蕾 (19852) ,女 ,硕士生 ,研究方向 :基因工程药物 ; E2mail: losyang@1631com
通讯作者 :袁其朋 ,教授 ,博士生导师 ; E2mail: yuanqp@mail. buct. edu. cn
　　海藻糖是一种普遍存在于生物体体内 (不包括
哺乳动物 )的二糖。海藻糖在科学界具有“生命之
糖 ”的美誉 ,它不仅是能源和碳源的储备物 ,还能作
为应急代谢物 ,赋予动物、植物和微生物等抵抗营养
缺乏、高温、低温、干燥、高渗透压、有毒物质等恶劣
环境的能力。目前海藻糖被广泛应用于细胞、组织
器官、食品、化妆品和药物制剂保藏等领域 [ 1, 2 ]。
1994年日本首次以淀粉为底物 ,利用麦芽寡糖基海
藻糖合成酶 ( maltooligosyl trehalose synthase, MT2
Sase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶 (maltooligosyl tre2
halose trehalohy2drolase,MTHase)双酶体系合成海藻
糖 ,并于 1995年将该方法应用于大规模的工业化生
产 ,使海藻糖的价格大幅度降低 [ 3 ]。本实验室已从
玫瑰微球菌中克隆到编码 MTHase的基因 treZ ,并研
究了该基因在 E. coli BL21的胞内表达 [ 4 ]。
由于原核表达系统表达的蛋白易形成包涵体 ,
且缺乏翻译后修饰。而毕赤酵母表达系统具有强启
动子 ,且存在翻译后修饰系统 ,适合外源基因的高水
平诱导表达 [ 5 ]。本实验构建了 MTHase ( GenBank登
录号 DQ017668)基因的毕赤酵母表达载体 ,对该原
核基因在毕赤酵母中的分泌表达进行了研究 ,为该
酶的高效表达研究提供了基础。
1 材料与方法
111 菌株和质粒
大肠杆菌 DH5α菌株、玫瑰微球菌 QS412、毕赤
酵母菌株 Pich ia pastoris GS115及 KM71菌株、质粒
pMD182T、pP ICZαA均为本实验室保存。
112 工具酶和试剂
T4 DNA连接酶、各种限制性内切酶、DNA聚合
酶、DNA Marker均购于 TaKaRa公司 (大连 )。6 ×his
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
标签抗体购于 Novagen公司 , HRP标记的羊抗鼠 IgG
二抗购自北京博奥森生物技术有限公司。DNA纯化
试剂盒、质粒提取试剂盒购于 Omega公司。酵母基
因组提取试剂盒购于天根公司。蛋白标准分子量购
于 B io2Rad公司。LB培养基、YPD培养基、2 ×YT培
养基、BMGY培养基、BMMY培养基的配制均按照 In2
vitrogen公司毕赤酵母操作手册进行。其他化学试剂
为国产和进口分析纯试剂。
113　treZ基因的克隆及毕赤酵母表达载体的构建
11311　玫瑰微球菌基因组的提取及 treZ基因的扩
增 根据本实验室已经克隆、测序得到的 MTHase
酶基因序列 ,设计引物 (引物由 Invitrogen公司合
成 )由扩增目的基因 :
正向引物 P1: 5′2AAGGAATTCATGAACACCCGCG2
AGCACCT23′(EcoR I)
反向引物 P2: 5′2TGCTCTAGAGTAGCGCACCACG2
GCGG23′(Xba I)
其中正向引物的 5′端引入了 EcoR I位点 ,反向
引物引入了 Xba I位点。以瑰微球菌 QS412的基因
组 DNA为模板 ,进行 PCR反应。该基因 GC含量高
达 72% ,获得单一的特异条带比较困难 ,经优化得
到最佳反应条件 :采用 touch down以及 hot start模
式 , 94℃ 4 m in; 94℃ 30 s, 67℃ 30 s, 72℃ 2 m in 12
个循环 ,每个循环降 015℃; 94℃ 35 s, 61℃ 30 s,
72℃ 2 m in, 18个循环 ;最后 72℃延伸 10 m in。
扩增产物经纯化后连接到 pMD182T载体 ,电转
化大肠杆菌 DH5α,进行蓝白筛选 ,挑取阳性菌落 ,
进行菌落 PCR及测序验证 [ 6 ]。
11312 重组质粒 pP ICZαA2MTH的构建 pMD 182
MTHase质粒用 EcoR I及 X ba I双酶消化 ,胶回收
MTHase基因片段与相同酶切的 pP ICZαA连接 ,并
转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞 ,挑取单菌落 ,小量
提质粒 , PCR及酶切鉴定。
11313 重组质粒 pP ICZαA2MTH的转化 将提纯的
pP ICZαA2MTH质粒用 B stX I,酶切线性化后 ,分别电
转化毕赤酵母 GS115和 KM71感受态细胞 ,涂布于含
有 Zeocin的 YPDS平板 , 30℃培养 4～6 d,筛选到阳
性转化子。提取基因组 ,以 P1和 P2为引物进行 PCR
鉴定 ,同时以转化过空载体的菌株作为对照。
11314 高拷贝转化子的筛选 由于 Zeocin对单拷
贝插入的酵母工程菌工作浓度为 100μg/m l。因此
可使用 Zeocin浓度梯度筛选含有高拷贝的阳性克
隆 :用灭菌牙签挑取筛选得到的阳性克隆 ,分别点在
不同 Zeocin浓度的平板上 ,并做好标记 , 30℃培养
箱中培养 3 d。能在高浓度平板上良好生长的菌株
则应该有高拷贝插入。
11315　GS115菌株转化子表型的筛选 将 YPDS
长出的 GS115 若干单菌 ,以及对照 ( GS115 /H IS+
Muts Ablum in及 GS115 /H IS+ Mut+β2gal)用灭菌牙
签转接到 MDH和 MMH平板上 (先在 MMH平板上
点 ) , 30℃孵育 2 d。在 MDH和 MMH平板上均能正
常生长的菌株为 Mut+表型。
114　重组菌株的诱导表达
11411　生长曲线的测定 分别挑取 GS115以及
KM71阳性转化子单菌落 ,接种到 YPD液体培养基
中 , 30℃ 250 r/m in培养至 OD为 110。以 2%接种
量转接至 BMGY培养基 , 30℃ 250 r/m in培养 ,每隔
4 h取 1次样 ,测定 OD600 ,并绘制生长曲线。
11412　总蛋白测定 配制一系列梯度浓度的 BSA
蛋白溶液 ,浓度分别为 5、10、15、20、25μg /m l,制作
标准曲线。
取经甲醇诱导不同时间的发酵液上清 100μl,
加入 1 m l考马斯亮蓝蛋白染液 ,静置 15 m in后测定
595处的吸光度。
11413 诱导表达 经 PCR验证的重组菌株按照
Invitrogen毕赤酵母操作手册在 BMGY培养基中培养
后转接到 BMMY培养基中。每 24 h加入 100 m l/L
的甲醇至终浓度 015%进行诱导。
115　蛋白的检测
用 100%三氯乙酸以及丙酮处理发酵液 ,得到
浓缩发酵液样品。取 50μl样品与 10μl 6 ×SDS2
PAGE上样缓冲液混合 ,煮沸 10 m in, 12 000 g室温
离心 1 m in,取 10μl上清进行 SDS2PAGE[ 7 ]。
收集诱导一定时间的酵母细胞 ,按照 Invitrogen毕
赤酵母操作手册提供的方法进行破碎 ,取 10μl与
10μl 6 ×SDS2PAGE上样缓冲液混合 ,煮沸 10 min,
12 000 g室温离心 1 min,取 10μl上清进行 SDS2PAGE。
116　W estern blot分析检测 [ 8 ]
SDS2PAGE电泳结束后 ,将聚丙烯酰胺凝胶上的
蛋白条带通过半干电转仪转移到 PVDF膜上。以 2
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mA /cm2转移约 2 h后 ,用 5%脱脂奶粉室温封闭 1 h,
以鼠源 H is标签抗体为一抗 (1∶800稀释 ) ,辣根过氧
化物酶标记的羊抗鼠 IgG为二抗 (1∶1 000稀释 )进行
W estern blot,最后用 DAB显色液避光显色。
2 结果与讨论
211 表达载体的构建
21111　玫瑰微球菌 QS412基因组的提取及目的基
因的克隆 从图 1可见 ,总 DNA 的提取无明显降
解 ,经 DNA紫外吸收检测表明 , A260 /A280比值在 118
左右。这两个检测指标显示所提取的 DNA纯度较
高 ,符合 PCR扩增目的基因的要求。
图 1　玫瑰微球菌基因组电泳图
以玫瑰微球菌 QS412基因组为模板 ,由前述优
化条件扩增得到约 119 kb的目的条带 ,见图 2。胶
回收后与 pMD182T连接得到 pMD182MTH质粒 ,转
化大肠杆菌 DH5α,挑选阳性克隆进行菌落 PCR以
及测序验证结果正确。
图 2　菌落 PCR验证
21112 表达载体 pPICZαA2MTH的构建 将 pMD182
MTH用 EcoR I和 X ba I双酶切 ,回收小片段 ,与经
相同酶切的 pP ICZαA载体连接构建得到如图 3所
示的表达载体。
图 3　pP ICZα2MTH质粒的构建
21113　pP ICZαA2MTH 重组入酵母染色体的 PCR
验证 从抗性平板上分别挑取 GS115及 KM71的单
菌落 ,经 YPD液体培养基培养 48 h,提取基因组 ,以
P1, P2为引物进行 PCR鉴定 ,见图 4。
图 4　阳性转化子基因组 PCR验证
　　结果表明阳性转化子菌落均能扩增出 119 kb
条带 ,对照菌落无条带 ,这表明 pP ICXαA2MTH已成
功整合到毕赤酵母染色体中。
21114 高拷贝转化子的筛选 采用 250, 500, 1 000
μg/m l的 Zeocin浓度梯度对阳性克隆筛选 ,最终在
1 000μg/m l浓度下得到若干个菌落 ,进行下一步表
达研究。
21115 重组菌株表型筛选 MDH和 MMH培养基
上的 GS115 菌落生长情况与对照 GS115 /H IS+
Mut+β2gal基本相同 ,说明它们都是 Mut+型的。
212 重组菌的诱导表达
21211 生长曲线 由图 5可以看出 , GS115重组
菌株大约在 12 h进入对数期 ,培养 30 h进入稳定
期。按照毕赤酵母操作手册 ,菌体 OD600达到 2～6
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时转接到诱导培养基上比较合适。因此 ,本试验
选择发酵 20 h离心收集菌体转接到 BMM Y培养
基中。
图 5　GS115生长曲线
由图 6可以看出 KM71重组菌株生长曲线跟
GS115基本相同 ,只是 KM71重组菌株均为 Muts型 ,
在诱导培养基中生长较慢 ,接种量应相对大一些 ,因
此选择在 25 h收集菌体转接到诱导培养基中。
图 6　KM 71生长曲线
21212 发酵液全蛋白测定 毕赤酵母菌株作为外
源蛋白的表达宿主具有自身分泌蛋白少的优点。因
此如果目的蛋白有表达的情况下 ,发酵液全蛋白的
浓度变化可以大致反映出目的蛋白的浓度变化 (图
7,图 8)。从图 8中可以看出 GS115重组菌株发酵
液中总蛋白含量随时间的变化趋势与对照基本相
同 ,这暗示外源基因在 GS115菌株中很可能没有
表达或表达量很少。而 KM71重组菌株发酵液中
总蛋白含量随发酵时间逐渐增加 ,而且明显高于
对照菌株 ,初步证明外源基因在 KM71菌株中得到
表达。从图 8中还可以看出 ,诱导 72 h后蛋白浓度
达到最大值 ,为了保证蛋白的最大表达量及较短的
发酵周期 ,甲醇诱导时间确定为 72 h。
21213 诱导表达 根据 Invitrogen公司毕赤酵母操
作手册确定发酵条件 : 28℃, 300 r/m in,培养 4 d,每 24
h添加甲醇终浓度为 015%。浓缩发酵液进行 SDS2
PAGE。目的蛋白的分子量经软件预测约为 73 kD。
电泳结果初步显示 , GS115阳性转化子经甲醇诱导 4
d的发酵液样品 ,以及细胞破碎上清样品并未有预期
大小的蛋白条带出现。而 KM71阳性转化子酵液样
品在 75 kD稍下方位置有明显条带 ,与预测大小一
致。可初步推断 ,MTHase蛋白在 KM71重组菌中有
分泌表达。KM71发酵液样品电泳结果如图 9。
图 9　表达蛋白的 SD S2PAGE电泳检测
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2009年第 10期 杨蕾蕾等 :玫瑰微球菌中 treZ基因在毕赤酵母中的表达研究
213 重组菌表达产物的 W estern blot分析
重组菌发酵液样品 W estern blot检测结果显示单
一条带 (图 10) ,进一步证明 MTHase蛋白在毕赤酵母
KM71菌株中成功分表达。GS115菌株样品中检测不
到条带 ,说明 MTHase在 GS115菌株中没有表达。
图 10　表达蛋白的 W estern blot验证
3 小结
本试验成功构建了 MTHase基因毕赤酵母分泌
表达载体 , SDS2PAGE显示外源蛋白在 KM71菌株
中成功表达 ,这是原核基因在真核系统中表达的又
一次比较成功尝试。但是 ,在 GS115菌株中未检测
到蛋白表达 ,分析原因可能是 GS115转化后得到
Mut+转化子 ,而 KM71菌株转化后得到的是 MutS转
化子 ,而 MTHase蛋白分子量比较大 ,含有二硫键 ,
空间结构较复杂。因此能快速利用甲醇生长的
Mut+转化子没有足够时间对该蛋白进行正确折叠 ,
导致表达失败。
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