全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 10 期
丝状真菌中的 RNA干扰及其应用技术
王绍文1，2 刘刚1 邢苗1，2 田生礼1
(1深圳大学生命科学学院 深圳市微生物基因工程重点实验室，深圳 518060;
2华南农业大学生命科学学院，广州 510642)
摘 要: RNA干扰是真核生物中相对保守的一种基因转录后表达调控机制，它通过双链 RNA 介导细胞内 mRNA 发生
特异性降解或翻译抑制，从而调控靶基因的表达。对丝状真菌中 RNA 压制和减数分裂沉默等现象的研究表明，与动、植物一
样，丝状真菌中也存在 RNA干扰现象。通过对 RNA压制缺失突变株和减数分裂沉默缺失突变株的一系列分子生物学研究，
获得了与之密切相关的一系列蛋白，而这些蛋白在结构和功能上与动、植物 RNA 干扰途径的蛋白高度相似，这些结果证明了
丝状真菌中的 RNA存在干扰现象。RNA干扰技术作为丝状真菌分子生物学研究或遗传改造的工具具有特殊的意义，因为丝
状真菌具有多核和发生非同源重组频率高的特点，难以用基因敲除手段进行改造。系统地介绍丝状真菌中的 RNA 干扰途径
以及使用 RNA干扰对真菌进行遗传改造的方法。
关键词: RNA干扰 RNA压制 减数分裂沉默 siRNA 丝状真菌
Advances in Filamentous Fungal RNA Interference and
Its Application Technology
Wang Shaowen1，2 Liu Gang1 Xing Miao1，2 Tian Shengli1
(1Shenzhen Key Laboratory of Microbial Genetic Engineering，College of Life Sciences，Shenzhen University，Shenzhen 518060;
2College of Life Sciences，South China Agriculture University，Guangzhou 510642)
Abstract: RNA interference is a relative conversed mechanism for post-transcriptional regulation of gene expression in eu-
karyotes． It regulates the expression of target genes through specific degradation or post-transcriptional gene silencing mediated by doub-
le stranded RNA． Besides animal or plant cells，RNA interference also has been found in filamentous fungi． Several proteins depend on
quelling or meiotic silencing have been found through comprehensively molecular study on the quelling deficient and meiotic silencing
deficient mutants of filamentous fungi，and these proteins are highly similar to the RNA interference pathway protein． These researches
demonstrate that RNA interference works in filamentous fungi． It has special significance to employ RNA interference as a tool for mo-
lecular biology research and genetic manipulation of filamentous fungi，for these microbes generally consist of multinuclear hyphae，and
in which the frequency of non-homologous recombination is much higher than homologous recombination． This review summarized the re-
cent advances in RNA interference research and its application technology in filamentous fungi．
Key words: RNA interference Quelling Meiotic silencing Small interference RNA Filamentous fungus
收稿日期:2011-03-09
基金项目:国家自然科学基金项目(31070044)
作者简介:王绍文，男，硕士，研究方向:应用微生物学及分子生物学;E-mail:wangsw915918@ 163． com
通讯作者:邢苗，男，博士，教授，研究方向:细胞生物学;E-mail:xingmiao@ szu． edu． cn
刘刚，男，博士，教授，研究方向:应用微生物学及分子生物学;E-mail:zjuliug@ szu． edu． cn
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是真核生
物中相对保守的基因沉默机制。它通过内源或外源
双链 RNA(dsRNA)介导细胞内 mRNA 发生特异性
降解或翻译的抑制，从而导致靶基因的表达沉默，并
产生相应的功能表型缺失［1］。RNAi 途径可分为 3
个步骤［2］: (1)外源导入或者细胞内表达的长链
dsRNA(正义链和反义链转录产物之间碱基互补或
自身形成茎环结构)被核糖核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ) ，即
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
Dicer，加工成为小分子双链 RNA; (2)小分子双链
RNA解链，其中一条整合到 RNA 诱导的沉默复合
体(RISC)中; (3)RISC 搜索潜在的靶 RNA，整合
到 RISC 的单链 RNA(ssRNA) ，即引导链(guiding
strand) ，介导 RISC 中内切核酸酶(Argonaute 蛋
白)切割与引导链同源的 mRNA。丝状真菌中也
存在 RNAi途径，随着研究工作的深入开展，RNAi
技术已成为对丝状真菌进行遗传改造的一种新的
手段。由于 RNAi 具有序列特异性而非位点相关
性的特点，相对于基因敲除而言，它在多核、易发
生非同源重组的丝状真菌中应用具有特殊的
优势［3，4］。
1 丝状真菌中与 RNAi 相关的基因沉默
现象
1. 1 RNA压制(quelling)
Romano和 Machino［5］将粗糙脉孢菌(Neurospo-
ra crassa)内源基因 al-1 的同源片段转入该微生物
后，发现 al-1 基因的表达受到抑制，他们将这种现
象称为 RNA压制(quelling)。随后，研究者获得了
一系列 quelling 功能缺失(quelling-deficient，qde)
的 N． crassa 突变菌株，对这些突变株的研究证明
了 quelling 途径与小干扰 RNA(small interfering
RNA，siRNA)相关。其中，qde-1 突变株不能合成
正常的依赖 RNA 的 RNA 聚合酶(RNA-dependent
RNA polymerase，RdRP) ，而 RdRP为其他真核生物
的 RNAi所必需［6］，表明 RdRP 和某种 RNA 分子
参与了 quelling 途径［7］。此外，qde-2 基因编码一
个含有 piwi-PAZ 结构域(PPD 或 Argonaute)的蛋
白［8］，该蛋白是真核生物 RNA 沉默途径中一个必
要的保守组分。以上关于 Neurospora中 quelling 途
径的研究结果为阐明丝状真菌的 RNA沉默机制奠
定了基础。
1. 2 非配对 DNA诱导的减数分裂沉默现象
非配对 DNA 诱导的减数分裂沉默(meiotic si-
lencing by unpaired DNA，MSUD)是在 N． crassa 中发
现的另外一种的 RNA 干扰现象［9］。N． crassa 在营
养生长期为单倍体，当两种不同交配型(mating
type)的单倍体细胞核融合形成合子时，会形成不稳
定的二倍体。二倍体合子经过减数分裂后(其间有
同源染色体配对)再进行有丝分裂，形成含有 8 个
单倍体子囊孢子的子囊。当子囊孢子成熟基因
(asm-1)与等位基因配对时，其功能可正常发挥，
子囊孢子成熟。当 asm-1 基因为不配对状态时，其
表达被沉默，影响子囊孢子成熟。若细胞中存在
非配对的 asm-1 基因，除该基因自身的表达被沉默
外，基因组中该基因其他拷贝(甚至是已配对的等
位基因)的表达也被沉默，表明可能存在可移动的
反式作用分子参与 MSUD 途径［9］。MSUD 可通过
绿色荧光蛋白等报告基因观察，将 GFP 与组蛋白
H1 形成融合蛋白(H1-GFP) ，若两个亲本均含相
同的 H1-GFP，则杂合体在任何阶段都表达 GFP。
若将 H1-GFP 亲本与野生型亲本(不含 H1-GFP)
杂交，则所形成的二倍体在减数分裂期不能表
达 GFP［10］。
通过紫外线诱变后筛选 MSUD 缺陷突变株，
以及通过对 RNAi 相关蛋白的序列保守性分析和
缺失突变菌株的功能鉴定，在 N． crassa 中获得了
与 MSUD相关的蛋白，如 SAD-1、SAD-2、SMS-2 和
DCL-1 等［11 － 13］。在这些蛋白的突变株中 MSUD现
象缺失，而无一例外，这些蛋白的结构都与高等真
核生物 RNAi 途径的某种功能蛋白的序列相似。
SAD-1 的序列与其他生物的 RdRPs 的序列具有相
似性，SMS-2 与 Argonaute 蛋白具有结构相似性，
DCL-1 与 Dicer的结构相似，SAD-2 为 SAD-1 的辅
助蛋白，它引导 SAD-1 定位到核周区域(perinu-
clear region)［11 － 13］。根据这些蛋白的功能，可归
纳出 MSUD 的可能作用机制:非配对 DNA 中的
基因由目前尚不清楚的机制被转录为异常的
RNA(aRNA) ，在 SAD-1 的作用下 aRNA 转变为
双链 RNA(dsRNA) ，在 DCL-1 的作用下，dsRNA
被切割成小 RNA，小 RNA 结合在由 SMS-2 形成
的 RISC 复合体上，引起特异基因 mRNA 的表达
沉默(图 1)。
1. 3 真菌中的小 RNA
小 RNA(miRNA)是由含发夹结构的单链 RNA
前体经 Dicer剪切而产生的短的双链 RNA 分子，在
动物、植物和藻类中广泛存在［14 － 17］。以往通常认为
真菌中不存在 miRNA，但最近研究者通过生物信息
学手段辅助 QPCR 检测、以及对 QDE-2 相关的小
RNA分析，在 N． crassa中找到了一系列 miRNA［18］。
87
2011 年第 10 期 王绍文等:丝状真菌中的 RNA干扰及其应用技术
通过功能分析和结构鉴定，表明真菌中的 miRNA具
有与高等生物 miRNA相似的特征，如由具有茎环结
构的 RNA 前体加工而成、能使内源的靶基因沉默
等。除 N． crassa 外，在其他丝状真菌中尚未发现
miRNA的报道。在真菌中是否普遍存在 miRNA，其
具体的生理功能如何等，这些问题尚有待于深入
研究。
在减数分裂过程中，非配对 DNA 片段(unpaired DNA)
经一种未知机制转录为非正常 RNA(aRNA) ，在 SAD-1
的作用下 aRNA为模板合成 dsRNA，后者经 DCL-1 切割
成 siRNA后结合到 RISC上
图 1 N． crassa中MSUD的可能模型
2 丝状真菌中 RNA干扰的生物学功能
小分子非编码 RNA 在真核细胞中参与多种生
理功能，如调控内源基因的表达，抵抗病毒，使转座
子失活，形成异染色质及维持生殖细胞基因组稳定
性等。
高等真核生物的 RNAi 途径参与了转座子沉
默过程，而真菌的 RNA 沉默途径也具有同样的作
用。最近的研究发现，构巢曲霉和栗疫病真菌
(Cryphonectria parasitica)的 RNAi途径与抗病毒防
御机制有关［19，20］。病毒感染 N． crassa 和 C． para-
sitica 后，这两种真菌中 RNAi 途径相关蛋白基因
的表达量增加［21］。因此，RNAi 途径可能是真核
生物抵抗病毒和转座子感染的一种天然防御机
制，该机制可能起源于真核生物进化过程的古老
时期。
高等真核生物的 miRNA途径参与代谢、细胞凋
亡、细胞分化、发育和感染应激反应等多种生理功
能。有研究表明真菌中也存在类似的 miRNA调节机
制，如在 N． crassa 中发现了与 miRNA相似的小 RNA
(miRNA)［18］，某些真菌的 Dicer缺失突变株在发育上
有明显的缺陷。稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)中编
码 Dicer 的基因被破坏后，其菌丝体在营养生长期
出现异常的形态［22］;而 N． crassa 的 dcl-1 纯合突变
株缺失繁殖能力［23］。尽管真菌发育过程的分子机
制尚不清楚，但以上的结果说明除了抵抗病毒和转
座子感染外，真菌的 Dicer 蛋白可能还具有其他的
生物学功能。
3 丝状真菌的 RNA干扰方案
3. 1 转化方法
尽管通过外源导入的双链 RNA 可以实现对目
的基因表达的沉默［24］，但这种表型只是瞬时的，不
能稳定遗传。理想的方法是将能使真菌自主合成
双链 RNA 的表达盒转入真菌中。为提高转化效
率，在对真菌遗传改造之前有必要设计合适的转
化方法。
首次成功转化酿酒酵母是采用原生质体介导的
转化方法(protoplast-mediated transformation，PMT) ，
随后，该方法被应用于一些丝状真菌的转化［25］。但
与酿酒酵母相比，PMT 对于丝状真菌的转化效率较
低。为了提高丝状真菌的转化效率，其他的转化方
法被逐步应用到丝状真菌的转化中，如电穿孔、基因
枪和根癌农杆菌介导的转化(Agrobacterium tumefa-
ciens-mediated transformation，AMT)［25，26］。这些方法
对于难以制备原生质体或原生质体再生效率低的
真菌菌株较为有效。表 1 总结了这四种转化方法
的主要特征［27］。有研究表明，有些真菌在利用
PMT、电穿孔和基因枪进行转化时，转化效率非常
低，而采用 AMT 则获得较高的转化效率。另一方
面，采用 AMT 转化黑曲霉的效率很低，甚至无法
获得转化子［26］。因此，对于不同的真菌菌种，需要
探索最合适、效率较高的转化方法，并对转化条件
进行优化。
97
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
表 1 四种常用的丝状真菌转化方法
方法 原理 优点 缺点
PMT
利用溶壁酶制备原生质体;加入 PEG 使
原生质体摄入 DNA
可利用多种受体细胞(萌发或成熟的孢
子、菌丝组织)
溶壁酶批次影响转化效率;需要原生
质体再生
AMT
通过根癌农杆菌的侵染机制使目的
DNA整合到真菌基因组
可利用多种受体细胞(萌发或成熟的孢
子、菌丝体) ;同源重组频率高
共培养条件影响转化效率;比其它方
法更耗费时间
电穿孔
局部电脉冲使细胞膜发生短暂的可逆通
透性，从而转入目的 DNA
可利用多种受体细胞(萌发或成熟的孢
子) ;简单廉价
需要制备原生质体
基因枪
目的 DNA 包裹的金属颗粒(钨、金)被
加速后进入细胞
细胞不需要前处理 需要特殊的仪器
PMT表示原生质体介导的转化;AMT表示农杆菌介导的转化
3. 2 转化的筛选标记
目前已有多种抗生素抗性基因用于真菌的筛
选，其中潮霉素 B 抗性基因(hph)在很多真菌筛选
过程效果较好，因而被广泛应用于丝状真菌的筛选
系统。其他用于真菌的抗生素筛选标记包括腐草霉
素(phleomycin)、磺酰脲素(sulfonylurea)、毕拉草
(bialophos)、萎锈灵(carboxin)、杀稻瘟素(blastici-
din S)和苯菌灵(benomyl)等［25，28，29］。
除了抗生素抗性基因外，营养缺陷型标记也可
用于真菌转化的筛选，如 pyrG(酿酒酵母 ura3 的同
源基因，编码乳清酸苷-5-脱羧酶)。pyrG 的缺陷型
菌株在不含尿嘧啶的培养基中不能生长，但原养型
的可以。另外，pyrG 的营养缺陷型菌株对 5-氟-乳
清酸(5FOA)不敏感，而 pyrG 原养型原生质体可被
5FOA杀死。利用以上原理，已成功实现多个基因
连续转化酵母的例子［30］，而且该筛选系统也已被成
功应用于丝状真菌的遗传改造［31］。使用营养缺陷
型标记筛选的缺点是转化受体必需为缺陷型突
变株。
3. 3 双链 RNA的生成策略
将内源性目的基因片段的反义链转入 Neuros-
pora 后，产生沉默转化子的效率通常较低［5］，而利
用双链 RNA 表达载体能有效地诱导 RNA 沉默现
象。使真菌自主产生双链 RNA 的策略之一是转入
发夹结构 RNA(hairpin RNA，hpRNA)表达载体。当
载体同时含有目的基因片段及其反向重复序列(in-
verted repeat) ，且反向重复序列之间有一段间隔序
列(spacer)时，就形成发夹结构 RNA(hpRNA)。在
植物中的研究发现，hpRNA 的双链茎部分可以是目
的基因的 5非翻译区(5UTR)、编码区或 3非翻译
区(3UTR) ，大小为 400 － 800 nt(核苷酸) ，最小可
至 98 nt。当 spacer 序列含有内含子时(ihpRNA) ，
目的基因的沉默效率(沉默转化子占全部转化子的
比例)大幅度提高(66% － 100%) ，平均沉默效率为
90%;而无内含子 spacer序列的 hpRNA的沉默效率
为 48% － 69%［32，33］。ihpRNA 高效诱导 RNA 沉默
的原因可能是剪接小体复合体在加工内含子过程中
促进 hpRNA形成双链结构，或者内含子的剪接促进
dsRNA从细胞核转运到细胞质，从而与 Dicer 相互
作用［33］。Liu等［34］首先利用 hpRNA 表达载体诱导
担子菌类病原真菌 Cryptococcus neoformans 的 RNA
沉默现象。最近几年，以绿色荧光蛋白基因和红色
荧光蛋白基因为报告基因，在植物病原真菌 M．
oryzae、Venturia inaequalis、Colletotrichum lagenarium
及模式丝状真菌 N． crassa中建立了 RNA干扰方法，
并利用 RNAi 研究这些真菌某些重要基因的功
能［28，35 － 37］。为了方便利用 PCR 克隆方法构建 ih-
pRNA表达载体，Nakayashiki 等［37］设计了用于子囊
真菌的通用 ihp 表达载体 pSilent-1。目前，hpRNA
或 ihpRNA表达载体已成为高效诱导真菌 RNA 沉
默的技术平台，利用此平台研究者能够方便、有效地
探索真菌的基因功能。
使真菌自主产生双链 RNA 的第二种策略是利
用双向启动子系统，使目的基因片段位于两个方向
相反的启动子之间，目的基因片段发生转录后，其正
义链和反义链 RNA在细胞中形成 dsRNA(图 2)［3］。
08
2011 年第 10 期 王绍文等:丝状真菌中的 RNA干扰及其应用技术
这类载体的构建只需要一步非定向克隆，可以快速
地与目的基因片段的 PCR产物连接。据报道，这类
RNAi载体在荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsula-
tum)中诱导 eGFP 的表达沉默程度较低(平均抑制
程度为 35%)［38］。利用以上策略，Nguyen 等［39］构
建了含有 trpC 和 gpd 启动子的载体 pSilent-Dual1
(pSD1)。pSD1 转入 M． oryzae 后，诱导目的基因的
沉默程度比 ihpRNA表达载体诱导的沉默程度低。
在双向启动子系统中，通过与绿色荧光蛋白(GFP)基因
的共沉默，筛选靶基因沉默转化子，靶基因片段的 PCR
产物与 GFP基因干扰序列共同插入到沉默载体中，转入
表达 GFP的真菌细胞后，在双向启动子作用下，转录的嵌
合型 RNA(chimeric RNA)形成 dsRNA。利用与 GFP基因
共沉默关系，在荧光显微镜下筛选靶基因沉默转化子
图 2 高通量 RNAi的双向启动子系统
4 RNAi技术的优势与局限性
4. 1 RNAi对基因表达的不完全抑制
与基因敲除技术相比，RNAi在丝状真菌的基因
功能研究中具有一定优势，同时也存在一定局限性。
首先，基因敲除可以使目的基因的表达被 100%抑
制，而 RNAi 只产生部分抑制。然而，从另一角度
看，这也是 RNAi的优势。例如，某些看家基因难以
用基因敲除研究，利用 RNAi 使这些基因部分沉默，
研究相关表型的变化从而推断这些基因的功能。此
外，结合诱导型启动子，利用 RNAi 可以在细胞发育
的特定时期抑制基因的表达［3］。
4. 2 RNAi作用的序列特异性
RNAi与基因敲除的第二个区别在于作用的方
式不同。基因敲除是位点特异性的，即只有当转入
的片段和目的基因具有同源性，而且与之发生同源
重组才有可能使目的基因敲除;而 RNAi 是序列特
异性的，只要在细胞质内具有和目的基因同源的
dsRNA序列，就可以在 Dicer、RISC 等的作用下是目
的基因的表达下调。由于基因家族成员的序列有高
度相似性，利用 RNAi的序列特异性特点，只需构建
一个载体就能够同时沉默这些家族成员，从而有效
地分析基因家族的功能［40］。与构建多基因敲除突
变菌株相比，RNAi 可以减轻突变菌株的筛选工作
量。即使是非同源基因，将这些基因的部分序列用
同一个 RNAi载体融合表达，就可以使这些基因发
生共沉默。
另外，丝状真菌中存在多核(同一细胞或原生
质体中存在多个核)或异核现象(同一细胞中存在
多个基因型不同的细胞核)现象，利用基因敲除技
术难以使核中所有的目的基因被敲除，效率较低。
而 RNAi是序列特异性的，只要在细胞质内具有和
目的基因同源的 dsRNA序列，就可以抑制目的基因
的表达。因此，通过 RNAi 途径可以作用于多核或
异核菌丝中的 mRNA。据报道，基因沉默现象可以
在异核的 N． crassa菌株的细胞核之间转移［41］。
在基因敲除过程中，转入的 DNA片段在真菌中
发生的重组有很多是非同源重组，从而使基因敲除
较难实现。在 A． nidulans和 N． crassa的野生型菌株
中，同源重组频率约为 0. 1% － 5%［42，43］。而序列特
异性的 RNAi可以解决真菌中同源重组频率低的问
题，研究表明，ihpRNA 表达载体介导的基因沉默效
率为 66% －100%［33］。
然而，RNAi作用的序列特异性特点可能会产生
较严重的问题，即脱靶效应(off-target effects) ，导致
非目的基因的表达发生变化。脱靶效应会引起假阴
性和假阳性结果，是目前 RNAi 研究所面临的主要
问题［44］。通过微阵列分析，人类细胞的脱靶效应可
能是通过 siRNA 或 miRNA 途径抑制或激活非目的
基因的表达［45］。在哺乳动物 RNAi 体系中，长链
dsRNA经 Dicer切割后产生一系列序列不同的 siR-
NA，使引起脱靶效应的某一类 siRNA的浓度相对较
低。因此在 RNAi 研究中，长链 dsRNA 比合成的
siRNA更能降低脱靶效应发生的机率。
5 结语
RNAi途径已在越来越多的丝状真菌中得到证
18
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
实。与基因敲除相比，RNAi 存在干扰效率稍低、有
脱靶效应等缺陷。然而，它在丝状真菌中的应用也
具有特殊的优势，如不受丝状真菌的多核现象、异核
现象和非同源重组频率高的干扰，特别是当需要使
多个基因的表达同时下调时，使用 RNA干扰比基因
敲除更加方便。针对丝状真菌 RNAi 的技术和工具
的积累已经比较丰富，如 pSilent-1［37］等。随着更多
先进方法的引入，应用 RNAi 不仅会促进后基因组
时代真菌基因功能的研究，而且可通过 RNAi 改良
工业丝状真菌的遗传性状，提高工业菌种的性能及
相应生化产品的生成效率。
参 考 文 献
［1］Fire A，Xu S，Montgomery MK，et al． Potent and specific genetic in-
terference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans． Na-
ture，1998，391(6669) :806-811．
［2］Tomari Y，Zamore PD． Machines for RNAi． Genes and Development，
2005，19(5) :517-529．
［3］Nakayashiki H，Nguyen QB． RNA interference:roles in fungal biolo-
gy． Current Opinion in Microbiology，2008，11(6) :494-502．
［4］ Janus D，Hoff B，Kuck U． Evidence for Dicer-dependent RNA inter-
ference in the industrial penicillin producer Penicillium chrysoge-
num． Microbiology，2009，155(Pt12) :3946-3956．
［5］Romano N，Macino G． Quelling:transient inactivation of gene expres-
sion in Neurospora crassa by transformation with homologous se-
quences． Molecular Microbiology，1992，6(22) :3343-3353．
［6］Cogoni C，Macino G． Gene silencing in Neurospora crasssa requires a
protein homologous to RNA-dependent RNA polymerase． Nature，
1999，399(6732) :166-169．
［7］Cogoni C，Macino G． Post-transcriptional gene silencing across king-
doms． Current Opinion in Genetics and Development，2000，10(6) :
638-643．
［8］Catalanotto C，Azzalin G，Macino G，et al． Gene silencing in worms
and fungi． Nature，2000，404(6775) :245．
［9］ Shiu PK，Raju NB，Zickler D，et al． Meiotic silencing by unpaired
DNA． Cell，2001，107(7) :905-916．
［10］Freitag M，Hickey PC，Raju NB，et al． GFP as a tool to analyze the
organization，dynamics and function of nuclei and microtubules in
Neurospora crassa． Fungal Genetics and Biology，2004，41(10) ，
897-910．
［11］Bardiya N，Alexander WG，Perdue TE，et al． Characterization of in-
teractions between and among components of the meiotic silencing
by unpaired DNA machinery in Neurospora crassa using bimolecular
fluorescence complementation． Genetics，2008，178(1) :593-596．
［12］Lee DW，Pratt RJ，McLaughlin M，et al． An argonaute-like protein is
required for meiotic silencing． Genetics，2003，164(2) :821-828．
［13］Alexander WG，Raju NB，Xiao H，et al． DCL-1 colocalizes with oth-
er components of the MSUD machinery and is required for silen-
cing． Fungal Genetics and Biology，2008，45(5) :719-727．
［14］ Lee RC，Feinbaum RL，Ambros V． The C． elegans heterochronic
gene lin-R encodes small RNAs with antisense complementarity to
lin-14． Cell，1993，75(5) :843-854．
［15］ Llave C，Kasschau KD，Rector MA，et al． Endogenous and silen-
cing-associated small RNAs in plants． The Plant Cell，2002，14
(7) :1605-1619．
［16］Molnar A，Schwach F，Studholme DJ，et al． miRNAs control gene
expression in the single-cell alga Chlamydomonas reinhardtii． Na-
ture，2007，447(7148) :1126-1129．
［17］Grimson A，Srivastava M，Fahey B，et al． Early origins and evolution
of microRNAs and Piwi-interacting RNAs in animals． Nature，2008，
455(7217) :1193-1197．
［18］Lee HC，Li L，Gu W，et al． Diverse pathways generate MicroRNA-
like RNAs and dicer-independent small interfering RNAs in fungi．
Molecular Cell，2010，38(6) :803-814．
［19］Hammond TM，Andrewski MD，Roossinck MJ，et al． Aspergillus my-
coviruses are targets and suppressors of RNA silencing． Eukaryotic
Cell，2008，7(2) :350-357．
［20］ Segers GC，Zhang X，Deng F，et al． Evidence that RNA silencing
functions as an antiviral defense mechanism in fungi． Proc Natl
Acad Sci USA，2007，104(31) :12902-12906．
［21］Choudhary S，Lee HC，Maiti M，et al． A double-stranded-RNA re-
sponse program important for RNA interference efficiency． Molecu-
lar and Cellular Biology，2007，27(11) :3995-4005．
［22］Kadotani N，Nakayashiki H，Tosa Y，et al． One of the two Dicer-like
proteins in the filamentous fungi Magnaporthe oryzae genome is re-
sponsible for hairpin RNA-triggered RNA silencing and related
small interfering RNA accumulation． Journal of Biological Chemis-
try，2004，279(43) :44467-44474．
［23］Turner JM，Mahadevaiah SK，Fernandez-Capetillo O，et al． Silencing
of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse． Nature Genetics，
2005，37(1) :41-47．
［24］Khatri M，Rajam MV． Targeting polyamines of Aspergillus nidulans
by siRNA specific to fungal ornithine decarboxylase gene． Medical
Mycology，2007，45(3) :211-220．
［25］Ruiz-Diez B． Strategies for the transformation of filamentous fungi．
Journal of Applied Microbiology，2002，92(2) :189-95．
［26］Michielse CB，Hooykaas PJ，van den Hondel CA，et al． Agrobacteri-
um mediated transformation as a tool for functional genomics in fun-
gi． Current Genetics，2005，48(1) :1-17．
［27］Meyer M． Genetic engineering of filamentous fungi-Progress，obsta-
cles and future trends． Biotechnology Advances，2008，26(2) :
177-185．
28
2011 年第 10 期 王绍文等:丝状真菌中的 RNA干扰及其应用技术
［28］Fitzgerald A，Van Kan JA，Plummer KM． Simultaneous silencing of
multiple genes in the apple scab fungus，Venturia inaequlis，by ex-
pression of RNA with chimeric inverted repeats． Fungal Genetics
and Biology，2004，41(10) :963-971．
［29］Wirsel SGR，Voegele RT，Banninger R，et al． Cloning of beta-tubu-
lin and succinate dehydrogenase genes from Uromyces fabae and es-
tablishing selection conditions for their use in transformation． Euro-
pean Journal of Plant Pathology，2004，110(5) :767-777．
［30］Alani E，Cao L，Kleckner N． A method for gene disruption that al-
lows repeated use of URA3 selection in the construction of multiply
disrupted yeast strains． Genetics，1987，116(4) :541-545．
［31］Hartl L，Seiboth B． Sequential gene deletions in Hypocrea jecorina
using a single blaster cassette． Curr Genet，2005，48(3) :204-211．
［32］ Smith NA，Singh SP，Wang M-B，et al． Total silencing by intron-
spliced hairpin RNAs． Nature，2000，407(6802) :319-320．
［33］Wesley SV，Helliwell CA，Smith NA，et al． Construct design for effi-
cient，effective and high-throughput gene silencing in plants． The
Plant Journal，2001，27(6) :581-590．
［34］Liu H，Cottrell TR，Pierini LM，et al． 2002． RNA interference in the
pathogenic fungus Cryptococcus neoformans． Genetics，2002，160
(2) :463-470．
［35］Kadotani N，Nakayashiki H，Tosa Y，et al． RNA silencing in the
phytopathogenic fungus Magnaporthe oryzae． Molecular Plant-Mi-
crobe Interactions，2003，16(9) :769-776．
［36］Goldoni M，Azzalin G，Macino G，et al． Efficient gene silencing by
expression of double stranded RNA in Neurospora crassa． Fungal
Genetics and Biology，2004，41(11) :1016-1024．
［37］Nakayashiki H，Hanada S，Nguyen BQ，et al． RNA silencing as a
tool for exploring gene function in ascomycete fungi． Fungal Genet-
ics and Biology，2005，42(4) :275-283．
［38］Rappleye CA，Engle JT，Goldman WE． RNA interference in His-
toplasma capsulatum demonstrates a role for alpha-(1，3)-glucan in
virulence． Molecular Microbiology，2004，53(1) :153-165．
［39］Nguyen QB，Kadotani N，Kasahara S，et al． Systematic functional a-
nalysis of calciumsignalling proteins in the genome of the rice-blast
fungus，Magnaporthe oryzae，using a high-throughput RNA-silencing
system． Molecular Microbiology，2008，68(6) :1348-1365．
［40］ Zhao W，Fanning ML，Lane T． Efficient RNAi-based gene family
knockdown via set cover optimization． Artificial Intelligence in
Medicine，2005． 35(1-2) :61-73．
［41］ Cogoni C，Irelan JT，Schumacher M，et al． Transgene silencing of
the al-1 gene in vegetative cells of Neurospora is mediated by a cy-
toplasmic effector and does not depend on DNA － DNA interactions
or DNA methylation． EMBO Journal，1996，15(12) :3153-3163．
［42］Chaveroche MK，Ghigo JM，d＇Enfert C． A rapid method for efficient
gene replacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans．
Nucleic Acids Research，2000，28(22) :E97．
［43］Colot HV，Park G，Turner GE，et al． A highthroughput gene knock-
out procedure for Neurospora reveals functions for multiple tran-
scription factors． Proc Natl Acad Sci USA，2006，103 (27) :
10352-10357．
［44］Echeverri CJ，Beachy PA，Baum B，et al． Minimizing the risk of re-
porting false positives in large-scale RNAi screens． Nature Meth-
ods，2006，3(10) :777-779．
［45］ Jackson AL，Bartz SR，Schelter J，et al． Expression profiling reveals
off-target gene regulation by RNAi． Nature Biotechnology，2003，21
(6) :635-637．
(责任编辑 狄艳红)
38