全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
毛细管电泳质谱联用技术及其在代谢组学研究中的应用
阳平
(浙江大学医学院附属第一医院药剂科,杭州 310003 )
摘 要: 毛细管电泳自 20世纪 80年代中后期迅速发展以来,是近几年分析化学领域中发展最为迅速的分离手段之一。
毛细管电泳与质谱的联用使得分析范围更广,灵敏度更高, 因此被广泛应用于生物样品的分析中。介绍了毛细管电泳质谱联
用常用的接口技术, 质量分析器及其在生物样品中的分离模式, 综述了近年来毛细管电泳质谱联用技术在代谢组学中
的应用。
关键词: 毛细管电泳 质谱 代谢组学 综述
Capillary Electrophoresis Coupled toM ass Spectrometry
and Its Application inMetabonom ics Study
Yang P ing
( The F irstAff iliatedH ospital of College of M edicine, Zhejiang University,H angzhou 310003)
Abstrac:t Cap illa ry e lectrophoresis( CE ), as a fast deve loped separation techno logy in analytical chem istry dom a in, has m ade
g reat prog ress in recent years. The com bina tion o f CE w ith m ass spectrom etry (M S) can prov idew ider ana ly tica l range and h igher sen
sitiv ity, so it was suitably applied to the analysis o f b io log ica l sam ples. This paper in troduced the comm on used inte rface techno logy of
CE /MS, them ass ana lyzers and its separation mode in b io logy samp les, and rev iew ed the app lication of online coupling techno logy in
m etabonom ics study.
Key words: Cap illary e lec trophoresis M ass spectrom etry M etabonom ics Rev iew
收稿日期: 20100222
作者简介:阳平,女,硕士研究生,研究方向:色谱及其联用技术用于生物样品的分析; Em ai:l aquaau rayang@ 126. com
代谢组学是以组群指标分析为基础, 高通量检
测和数据处理为手段, 信息建模与系统整合为目标
的系统生物学的一个分支,是继基因组学、转录组学
和蛋白质组学后系统生物学的另一重要研究领
域 [ 1, 2]。1999年, N icholson研究小组 [ 3]提出了代谢
组学的概念,并在疾病诊断、药物筛选等方面做了大
量有成效的工作。 2000年, 德国植物学家 F iehn
等 [ 4]通过对植物代谢物研究,认为代谢组学是定性
和定量分析单个细胞或单一类型细胞的代谢调控和
代谢流中所有低分子量代谢产物从而监测机体或活
细胞中化学变化的一门学科。
细胞内许多生命活动如细胞信号释放、能量传
递和细胞间通信等都是受代谢物调控的。疾病导致
机体病理生理的过程变化, 最终引起代谢产物发生
相应的改变,通过对某些代谢产物进行分析,并与正
常人的代谢产物比较,寻找疾病的生物标记物,这将
提供一种较好的疾病诊断方法。因此研究细胞的代
谢产物对了解人体的生理活动和诊断人类疾病有重
要的意义 [ 5]。
通常, 代谢组学研究的对象并非某些确定的代
谢产物,而是要获取尽可能多的代谢产物信息,并对
此定性定量 [ 6]。目前研究代谢组学的技术平台主
要是核磁共振技术和质谱及其联用技术,质谱具有
选择性高、检测限低等优点, 同时与气相、液相、毛细
管电泳等色谱分离技术有良好的兼容性,是代谢组
学研究的理想工具,具有广阔的发展前景。
毛细管电泳作为近年来发展较快的分析技术之
一, 分辨率较高,耗费的溶剂少,且成本较低,因此受
到广泛应用 [ 7]。当其跟高灵敏度的质谱检测器联
用时,可以得到较低的检测限。此外,质谱可以提供
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 8期
分子量而用于代谢产物的定性,多级质谱可以提供
结构碎片信息而用于代谢产物的结构鉴定。因此,
毛细管电泳质谱联用技术用于代谢组学的研究,应
用前景较为广阔 [ 8]。
1 毛细管电泳及其联用技术
1981年, Jo rgenson和 Lukacs首先提出在 75 m
内径毛细管柱内用高电压进行分离, 创立了现代毛
细管电泳。短短几年, 由于毛细管电泳符合了以生
物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质、
核苷酸乃至脱氧核糖核酸的分离分析要求, 因而得
到迅速的发展 [ 9]。
1. 1 毛细管电泳质谱联用接口技术
毛细管电泳统指以高压电场为驱动力, 毛细管为
分离通道,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上
的差异而实现分离的一类液相分离技术。质谱与毛
细管电泳的联用使得分析范围更广,灵敏度更高, 检
测限更低,因此得到了广泛的应用。目前, 成功地应
用于 CE /M S接口中的离子化技术有连续流快原子轰
击 ( cont inuousflow FAB, CFFAB )、离子喷雾 ( ions
pray, ISP)、电喷雾 ( electrospray, ESI)、大气压化学电
离 ( atmospheric pressure chem ical ionization, APCI)、基
质辅助激光解吸离子化 (matrixassisted laser deso rp
t ion ionization, MALD I)和等离子体解吸 ( plasma de
sorption ion izat ion, PD )离子化技术等。
其中电喷雾电离是最常用、最成熟的技术,一般
给出的是准分子离子信息,很少给出碎片离子,其最
大特点是产生多电荷离子, 使检测化合物的分子量
范围大大增加。 1987年 Sm ith等 [ 10]首次报道了毛
细管电泳和电喷雾质谱的联用技术, 为了获得稳定
的喷雾流和高效的离子化, 接口技术必须优化。目
前 CE /ESI /M S接口主要有 3种类型:同轴液体鞘流
接口 [ 11]、无鞘接口 [ 10, 12]和液体连接接口 [ 13]。
离子喷雾接口其离子源灵敏性高,灵活性好,特
别适用与电泳分离方法联用。到目前为止, 用于
CE /M S联用中的接口有两种类型: 液体连接型和同
轴包层液型。其自动化程度高,重复性较好。
快原子轰击是另一种被广泛使用的软电离技
术。M inard[ 14 ]等首先报道了 CE与 CF /FAB /M S的
联用技术。为获得稳定的 FAB离子束,研制了同轴
包层液接口和液体连接口。
APCI形成的是单电荷的准分子离子, 由于这种
软电离方式缺乏碎片离子产生,为得到进一步的结构
信息,需进行碰撞诱导断裂,通过对其中电压的调节,
可以控制分子离子在离子源内的断裂程度从而获得
结构信息。APC I更适用于分析极性较小的化合
物 [ 15] ,但是它选择性较差,不适用于定量分析 [ 16]。
PD和 MALD I均以脱机方式联用, 适用于分析
生物大分子。MALDI在蛋白质组学技术中应用较
多, 它可电离一些较难电离的生物大分子,而且没有
明显的碎片。质谱图中单电荷分子离子峰占多数,
因此适合多组分样品的分析。但是由于在监测低分
子代谢产物时会产生干扰, 所以不适用于代谢组学
的研究 [ 17]。
1. 2 质量分析器
用于定量分析的质量分析器中, 最常见的是四
级杆质量分析器, 包括单重四级杆质谱仪和三重四
级杆质谱仪。三重四级杆实现了质谱的串联, 分析
物通过第二个四级杆时被打成碎片, 在第三个四级
杆中被监测。但是,由于四级杆扫描速度有限,因此
当和快速分离技术,例如 CE联用时,不适用于分析
未知化合物。不过由于它们对目标分析物的定量分
析较灵敏,因此是毛细管电泳质谱联用中最常用的
质量分析器 [ 11]。
除了四级杆质谱仪外,离子阱质谱仪也是和 CE
联用较多的质量分析器。离子阱质谱仪成本低, 灵
敏度较高,且可以实现质谱的串联,因此它比较适合
用于目标化合物的筛选和定性分析, 可以用于代谢
组学研究中生物标记物的鉴定。但是其重排反应可
能性较大,可能出现人为产物 [ 18] , 故离子阱质谱不
适合用做定量分析。
时间飞行质谱仪 ( time of f light m ass spectrom e
try, TOF /M S)可以获得未知化合物的精确分子量,
用于对化合物进行鉴定, 获得未知化合物的经验分
子式。它的高分辨率 [ 19]及高灵敏度 [ 20] , 使其受到
广泛的关注,因而被广泛地应用于生物标记物的定
性鉴定。TOF还具有扫描速率快,质谱数据信息大
的优点,因此非常适合代谢组学分析。
2 CE /MS在代谢组学中的应用
2. 1 CE /M S分离模式
在毛细管电泳中,所有的阳离子都向阴极移动,
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2010年第 8期 阳平:毛细管电泳质谱联用技术及其在代谢组学研究中的应用
而所有的阴离子都向阳极移动。根据其电泳速度的
不同所有的带电化合物都能在 CE /M S模式下分离。
在阳离子分析系统中,电泳时施加正向电压,被
分析化合物随着电渗流向阴极移动, 阳离子化合物
根据质荷比在熔融的石英毛细管中得到分离, 然后
由质谱检测定量。为了能够同时分析所有的阳离
子, Soga等 [ 21]使用 1 mol /L的甲酸 ( pH1. 8)作为缓
冲液分析氨基酸,在该 pH条件下, 所有氨基酸都带
正电荷,电泳时向阴极端迁移, 正好是电喷雾接口的
方向,可以用于质谱分析。在全扫描及质谱多反应
监测模式下,该试验条件可定量分析人体尿液中的
32种氨基酸。
在分离阴离子代谢产物电泳时施加负电压,
此时,毛细管的入口端是阴极, 出口端是阳极。而
CE /M S没有出口端的瓶子, 此时电渗流向阴极方向
移动, 则会导致断流, 通过使用阳离子涂层的毛细管
可以逆转电渗流而解决这一问题。 Soga等 [ 22]使用
50 mmo l/L醋酸铵 ( pH 9. 0 ) 作为缓冲液可以同时
定性定量分析 27种枯草杆菌的阴离子代谢产物。
在相同的分析系统中, 发现一些多价体阴离子化合
物,如辅酶 、黄素腺嘌呤二核苷酸和辅酶 A通过
离子交换作用在阳离子涂层的毛细管上形成严重的
吸附, 导致灵敏度大大下降, 因此在该分析系统中
CE /M S法使用的毛细管是不带电的涂层的毛细管。
但是由于电渗流向阴极方向移动, 经常会出现断流
现象。为了克服这一现象, 电泳时向毛细管入口端
施加空气压力可以阻止断流现象的产生 [ 23]。该方
法可用于定量分析枯草杆菌细胞中提取的 14种多
价体阴离子化合物如核苷酸及辅酶 A化合物等。
2. 2 CE /M S技术在代谢组学中的应用
CE /MS联用技术自 20世纪 80年代问世以来,
受到越来越多的关注。由于 CE /MS对极性化合物
有较好的分离能力, 因此被广泛用于生物样品的分
析中, 包括蛋白质、多肽和氨基酸等。
2. 2. 1 细菌提取物 对细菌提取物进行代谢产物
分析有助于了解细菌的能量吸收和生长过程。代谢
产物在代谢途径中尤为重要,而通常代谢途径中的
代谢产物都是极性化合物,因此 CE /M S非常适用于
代谢产物的分析。
R ichard Lee等 [ 24]采用 CE /ES I/ IT /M S法分析
了大肠杆菌发酵液中的氨基酸, 以便了解营养代谢
过程。通过进行在线预浓缩和毛细管内样品富集,
灵敏度提高了 50倍,大肠杆菌阳离子代谢物的检测
限达到纳摩尔级。Edw ards等 [ 25]采用 CE /M S法分
析了大肠杆菌提取物的阴离子代谢产物,采用无鞘
接口和全扫描模式, 灵敏度提高了 10倍,检测限可
达到纳摩尔级别,检测了 118种代谢产物。该方法
可被用于研究生物样品的代谢轮廓。
Soga等 [ 26]采用 CE /M S进行微生物代谢物分
析,可分析代谢途径生成的 352种代谢产物标准品,
并用 CE /MS分析了枯草芽孢杆菌提取物中的 1 692
种代谢物, 鉴定其中 150种, 对阳离子代谢物、阴离
子代谢物、核苷和乙酰辅酶 A分别采用不同的 CE /
M S系统平行进行分析, 这个结果提供的信息有助
于了解孢子的形成过程中代谢物的变化。
R ichard等 [ 27, 28 ]采用 CE /ESI /M S法测定了脑
膜炎奈瑟菌和流感杆菌中的脂多糖类成分。Lapa
inis等 [ 29]采用 CE /ESI /TOF /M S法分析了单细胞的
代谢轮廓, 检出限 < 50 nmol。Tanaka等 [ 30 ]使用聚
醚醚酮涂层的毛细管,采用 CE /M S法分析了浓缩酵
母提取物的有机酸, 碳水化合物及核苷酸等代谢
产物。
2. 2. 2 植物提取物 Sato等 [ 31 ]采用了 CE /M S法
分析了水稻生长过程中的代谢产物。通过分析水稻
叶子的提取物,定量了糖酵解途径中的 88种代谢产
物。CE /M S法可分析代谢产物中带电的化合物, 包
括氨基酸、胺类化合物以及嘌呤碱, 检测限可达到
0. 1- 1 mo l。
Edw ards等 [ 32]采用了 CE /M S法分析了染料木
樱提取物中的类黄酮和酚类化合物。 10m in内可检
测 26种植物代谢物,方法快速简便。
U chim iya等 [ 33]采用 CE /M S法测定了转基因
水稻叶片的糖酵解和三羧酸循环过程中产生的有
机酸、氨基酸和糖类等代谢产物。 Sato等 [ 34 ]采用
CE /M S法监测水稻 56种基本代谢产物 24 h内的
动态变化水平。Levandi等 [ 35]建立的 CE /TOF /M S
法分析了传统玉米和转基因玉米 27种主要代谢产
物, 数理统计结果表明, L肉碱和 L脯氨酸在转基因
玉米中过表达,可作为筛选转基因玉米的生物标记
物。Garc iaV illa lba等 [ 36 ]建立的 CE /TOF /MS法可
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 8期
同时分析 45种传统大豆和转基因大豆的主要代谢
产物, 试验结果表明两种类型的大豆都存在主要的
代谢产物,但是部分代谢产物的含量明显有所不同,
可作为筛选转基因大豆的生物标记物。H arada
等 [ 37]建立了 CE /ESI/M S法可同时分析糖基磷酸
盐、有机酸、核苷酸和辅酶 A等阴离子化合物。该
方法与传统检测阴离子方法不同的是入口端在阳
极,且用普通毛细管代替了特殊的阳离子聚合物涂
层的毛细管。
2. 2. 3 尿液 虽然 CE /M S被广泛应用于分析人体
尿液的内源性代谢产物, 但是至今为止少有文献报
道利用 CE /M S法全面分析人体尿液的代谢产物。
Benavente等 [ 38]报道了在低 pH的条件下,分别采用
阳离子和阴离子模式分析人体尿液的轮廓。
Peterson等 [ 39]建立了 CE /TOF /M S法用于分析
人体尿液中的儿茶酚胺和甲氧肾上腺素。为了抑制
电渗流和改善化合物的分离度,毛细管内壁采用聚
乙烯醇材料。使用该方法, 检测限可达到 0. 1 -
03 mo l。
M aybo roda等 [ 40] 采用 CE /TOF /M S法分析了
人体尿液中的氨基酸, 样品不需要经过预处理, 通
过在线 pH调节浓缩法, 检测限可达到纳摩尔级。
该方法被应用于分析健康人和骨关节炎病人的尿
液。通过主成分分析法, 筛选出生物标记物组
氨酸。
Ram autar等 [ 41]采用 CE /TOF /M S法分析人体
尿液中的氨基酸,使用的毛细管是非共价键结合的
双分子层 PB和 PVS涂层,此时在低 pH值条件下也
能产生很大的电渗流,使得分离速度加快。这种材
料制成的毛细管涂层被公认为可用于分离尿液中的
氨基酸,迁移时间重复性较好。通过使用 pH调节
在线富集法,检测限可达到 20- 300 nmol。该法被
应用于测定尿路感染病人的尿样中的氨基酸浓度,
然后与健康人的尿液相比较。数理统计结果表明包
括苯丙氨酸在内的几个化合物可作为筛选疾病的标
记物。
Presto E lgstoen等 [ 42]报道了一种利用尿液快速
筛选代谢疾病的方法,采用 CE /MS /M S法及多级反
应监测模式,鉴别出多种疾病的代谢产物。
B indila等 [ 43]建立了 CE /ESI/QTOF /M S法分离
和检测多聚糖,使用无鞘接口,无需复杂的样品制备
步骤。该法被应用于分离和检测 Sch ind ler病病人
尿液中的 O糖基化的氨基酸和多肽。 Zam fir等 [ 44]
建立了 CE /ES I/QTOF /M S法分析糖类化合物,并将
此用于分析 Sch ind ler疾病病人尿液中的 O糖基化
和唾酸化的氨基酸。同样,使用无鞘接口,分离效率
高。他们建立的方法对研究糖生物学和糖组学有很
大的帮助。
W ang
[ 45]等建立的 CE /M S法可同时分析 19种
氨基酸,经过色谱质谱条件的优化和在线 pH 调节
富集法,检测限可达到 0. 008- 2. 377 g /mL。将该
方法用于分析正常人和膀胱癌患者的尿液, 数理统
计结果表明甲硫氨酸等 5种氨基酸含量在癌症患者
的尿液中显著下降。可从氨基酸代谢方面为膀胱癌
发病机制研究提供相关信息。
2. 2. 4 血浆和血清 Desiderio等 [ 46]研究建立了
CE /M S法快速测定人体血浆中的短链肉碱。血浆
先用乙睛沉淀蛋白,在质谱扫描模式下,血浆样品在
10m in内完成分析, 灵敏度和特异性均较高。检测
限在 0. 25到 1 mo l之间。日内日间重复性和精密
度较好,低浓度和高浓度的 RSD均小于 15%。Soga
等 [ 47]建立了 CE /TOF /M S法用于分析小鼠血浆和
肝脏提取物,建立的方法用于研究丙酮诱导肝脏毒
性前后的代谢轮廓, 从检测到的 1 859个色谱峰中
可以发现代谢谱的变化, 试验结果表明血清中的视
晶酸是肝脏谷胱甘肽缺乏症的指示剂,可以作为氧
化应激的生物标记物。
2. 2. 5 其它体液和组织 Soga[ 48]等用 CE /ES I/
TOF /MS法在阴离子模式下监测了多种阴离子代谢
产物如有机酸, 核苷酸及辅酶 A化合物, 检测限在
( 0. 8- 24) ! 10- 12mo,l并把该方法用于分析小鼠肝
脏中心代谢途径的代谢产物。
W eissinger
[ 49]等采用 CE /ESI/TOF /M S法分析了
人体尿液和血液中的多肽,并用于临床疾病诊断, 对
几类疾病和疾病不同阶段做了分型。M ischak等 [ 50]
建立了 CE /ES I/TOF /M S法分析人体脑脊液中的多
肽, 并应用于阿尔茨海默病患者的脑脊液多肽分析,
筛选出了 5个可能的生物标记物。
Lee等 [ 51]用 CE /ESI/M S法测定了谷胱甘肽的
代谢产物,谷胱甘肽不同的氧化程度可以评估细胞
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的氧化状态和抗氧化能力, 这有助于了解急慢性疾
病的发病机制。Chalcraft等 [ 52 ]建立的 CE /ESI/M S
法可用于测定干血斑提取物中的氨基酸, 酰基肉毒
碱及其立体异构体,通过在线的浓缩脱盐技术,该方
法可准确定量与先天性代谢缺陷疾病相关的 20种
不同的氨基酸和酰基肉毒碱生物标记物, 可用于新
生儿疾病的筛查,灵敏度较高。
W illems等 [ 53]综述了 CE /M S法分析核苷酸组
成的方法,包括核苷酸、修饰核苷、合成核苷酸、核苷
类似物和寡核苷酸。核苷酸在生化过程中起到重要
的作用,与生命活动和疾病的发生机制有关。因此,
研究核苷酸对研发抗病毒抗肿瘤药物研究有很大
的价值。
3 结论与展望
代谢组学的突破在于将传统的代谢途径扩展为
代谢网络的研究,通过非目标性地识别全部代谢物,
定性、定量它们在生物体系内的动力学变化,从而揭
示传统方法无法观测到的代谢网络中不同途径之间
的关系。近几年的研究都表明,代谢组学正处于蓬
勃的发展阶段 [ 54, 55] , 因此, 用于代谢产物的分析工
具也越来越受到重视, 主要包括和质谱联用的多种
色谱技术。
毛细管电泳作为一项高通量技术与质谱的联用
应该尽量能够提供代谢产物的信息, 包括结构鉴定
及定量分析。毛细管电泳的稳定性较差, 因此其分
析重现性和分辨率的提高对于生物样品的检测至关
重要, 且质谱仪的检测灵敏度和扫描速度的提高可
以做到复杂生物样品中的代谢产物的微量分析。此
外,由于 MS对 CE分离缓冲液的限制较多, 不是所
有的 CE分离模式都能与 MS联用,因此进一步研制
新型的与质谱相容性更好的接口装置也是值得研究
的重点。
参 考 文 献
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