全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
黑曲霉植酸酶 phyAm基因结构延伸突变改善
酶的热稳定性
余鳗游 1 李春梅 1 陈惠 2 吴琦 2
( 1四川农业大学农学院,雅安 625014; 2四川农业大学生命科学与理学院,雅安 625014)
摘 要 : 将来源于黑曲霉 N25的植酸酶基因 phyAm重组于大肠杆菌表达载体 pET30b( + ), 导入大肠杆菌 BL21( DE3)。
构建的工程菌 BL21pET30bFphyAm, 实现了植酸酶的融合表达, 表达产物的植酸酶活性为 419. 4 U /mL。 SDSPAGE分析表
明, pET30bFphyAm经 IPTG诱导 3 h后, 表达产物达到最高表达量, 占细胞可溶性总蛋白量的 10. 47% , 分子量为 5264 kD。
该表达系统可作为研究黑曲霉植酸酶体外改良的工具。
关键词: 黑曲霉 phyAm基因 延伸突变 大肠杆菌 热稳定性
Improving Thermostability ofA. niger Phytase by E longationMutation
YuM anyou1 L iChunme i1 Chen Hu i2 Wu Q i2
(
1
College of Agricultural, S ichuan Agricultural University, Yaan 625014;
2
College of Biology and Science, Sichuan Agricultural University, Yaan 625014)
Abstrac:t The phy tase gene phyAm acquired from A sp erg illus nig er N25 w as recom b ined in to E. coli expression vector pET30b
( + ), and transform ed intoE. co li BL21( DE3). The gene eng ineering bac terium BL21pET30bF phyAm ach ieved fusion expression,
and its activity reached to 419. 4 U /mL. The resu lts of SDSPAGE showed the expression arrived at the peak va lue after induced 3 h by
IPTG at 30 , and its y ie ld cam e to 10. 47% o f the to ta l so luble pro tein o f ce l,l and its m o lecularw e ightw as 52 64 kD. The expres
sion system can be used as in vitro studies o fA sp erg illus nig er phy tase improved too ls.
Key words: A spergullus n iger Phy tase gene E longation muta tion E scher ichia coli Therm ostab ility
收稿日期: 20100617
作者简介:余鳗游,本科在读,研究方向:微生物酶工程; Em a i:l jiangmy518@ 163. com
通讯作者:陈惠,女,教授,研究方向:微生物酶工程; Ema i:l ch enhu@i s icau. edu. cn
植酸酶 ( phytase)是催化植酸 (肌醇六磷酸 )及
植酸盐水解成肌醇与磷酸 (或磷酸盐 )的一类酶的
总称,主要用于饲料工业和食品工业。它通过水解
作用提高饲料中磷的利用率,通过螯合作用提高微
量元素的利用率,从而减少对环境的污染。同时,促
进生长发育,提高动物生长性能,消除植物性饲料或
食品中植酸的抗营养作用。但是, 生物提取的植酸
酶应用到饲料中成本昂贵, 并且由于植酸酶的热不
稳定性不能完全满足饲料加工、贮藏、使用的要求,
限制了植酸酶在饲料中的推广和应用 [ 1- 6]。
酶结构延伸突变是蛋白质工程研究的一种新方
法,通过在酶蛋白的 C末端增加一段肽段来扩展蛋
白质一级结构, 从而改变酶蛋白高级结构 [ 7]。吴琦
等 [ 8]利用延伸突变的方法有效地提高了芽孢杆菌
植酸酶的热稳定性。本研究旨在对黑曲霉植酸酶进
行定点突变的同时,采用结构延伸突变的手段对重
组酵母 PPNPm 8的植酸酶基因 phyAm进行结构延
伸突变,即在植酸酶的 C末端增加一段肽段, 对该
酶结构与功能关系作进一步的探讨。
1 材料与方法
11 材料
111 菌株与质粒 供试大肠杆菌 JM 109, 大肠杆
菌表达载体 pET30b ( + ) ,均由四川农业大学生物
化学与分子生物学研究室提供; 含有黑曲霉 N 25植
酸酶 phyA基因的 pUC18phyAm, 为四川农业大学生
物化学与分子生物学研究室构建; pUC18T载体购
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
自北京赛百胜生物工程有限公司。
112 主要试剂与仪器 限制性内切酶, T4 DNA
连接酶, dNTP均购自宝生物工程 (大连 )有限公司;
氨苄青霉素,卡拉霉素为成都天泰生命科技有限公
司进口分装; IPTG, Xga l购自北京赛百胜生物工程
有限公司; Taq p lus DNA聚合酶购自上海生物工程
有限公司; DNA纯化试剂盒购自华舜生物公司; 植
酸钠购自美国 S igma公司。其余试剂为国产分
析纯。
113 培养基 LB液体培养基: 1%蛋白胨, 05%
酵母抽提物, 1% NaC,l pH7. 0。
114 植酸酶活性测定溶液 超声波裂解液: 50
mmo l /L TrisHC l pH8. 0, 10%甘油。底物溶液: 8. 4
g /L植酸钠 (肌醇六磷酸十二钠 ) , 0. 20 mo l/L HAc
N aAc pH46。终点显色液: 100 g /L钼酸铵存贮液,
235 g /L钒酸铵存贮液, 65%硝酸,蒸馏水按 55
337比例混合。磷酸盐标准液: 将 0. 6214 g
KH2 PO4溶于重蒸水, 定容于 500 mL 容量瓶中, 即
为 9 mmo l/L的磷酸盐母液。制作标准曲线时,用重
蒸水将母液稀释为浓度为 225 mo l/L, 45 mol /L, 90
mo l/L, 180 mo l /L的磷酸盐溶液。
115 植酸酶纯化缓冲液 亲和树脂缓冲液; 1
Extract/w atch bu ffer: 50mmo l/L TrisHC ,l 300 mmo l/
L N aC ,l pH7. 0;含 5mmo l/L咪唑的 1 W ash buffer:
50 mmo l/L T risHC,l 300mmo l/L NaC ,l 5 mmo l/L咪
唑, pH7. 0; 1 E lu tion buffer: 50 mmo l/L TrisHC ,l
300mmo l /L N aC ,l 150mmo l /L咪唑, pH7. 0。
116 主要仪器 PCR仪 ( B iom etra ), DYY恒
压恒流电泳仪 ( B ioRad ), UVP 凝胶成像仪 ( B io
Rad), 电穿孔仪: BTX E lectro cell M an ipu lator, 600
( G entronics, Inc. , BTX Instrument D iv ision, San
D irgo, CA ) , M ini涡旋振荡器等。CSS200型超声波
粉碎仪 (山东济宁无线电仪器厂 )等。HH. S112型
电热恒温水浴锅 (温度可调,精度为 0. 1 )。
12 植酸酶 phyAm基因的融合表达片段的克隆
121 引物设计 根据所得 pUC18phyAm序列及
pET30b( + )载体酶切位点序列, 应用 DNAMAN软
件设计出下面的植酸酶 phyAm基因表达片段的 PCR
引物, 在上游引物 5端引入一个 Nd e位点和 E coR
,在下游引物 5端引入一个H ind 位点。表达产
物 C端将融合表达 pET30b ( + )载体质粒上的 13
氨基酸残基, Lys Leu A la A la A la Leu G lu H is6。引
物由上海生物工程有限公司合成。
上游引物: 5GT CATATG GAATTC ctggcagtccccgcctc3
N de E coR
下游引物: 5CT AAGCTT agcaaaacactccgcc3
H in d
122 植酸酶基因 PCR扩增反应 以 pUC18phy
A
m质粒为模板, 加入引物、dNTP等,最后加入 DNA
聚合酶,按下列参数进行 PCR: 94 变性 30 s, 55
退火 30 s, 72 延伸 5 m in, 30个循环后, 增加延伸
10m in。 PCR扩增产物经 0. 8%琼脂糖凝胶电泳检
测后备用。
123 植酸酶 phyAm基因表达片段的克隆及鉴定
PCR扩增产物经 DNA回收试剂盒纯化后, 与
pUC18T载体进行连接反应。按 分子克隆试验指
南的方法, 采用氯化钙法制备大肠杆菌 JM 109感
受态细胞,进行连接产物转化、阳性克隆菌株筛选及
其电泳鉴定,获得含有 pUC18phyAm阳性菌株。
13 植酸酶 phyAm基因 pET30b( + )融合表达载
体的构建
131 植酸酶 phyAm基因融合表达片段的获得
采用质粒提取试剂盒, 从 123获得的含有重组质
粒的大肠杆菌中抽提出含有植酸酶 phyAm基因融合
表达片段 的重组质 粒 pUC18phyAm。然 后将
pUC18phyAm和 pET30b( + )质粒 DNA分别用 Nde
/H ind 双酶切, 以相应 PCR产物作对照, 0. 8%
琼脂糖凝胶电泳检测。从凝胶上回收与 PCR产物
一样大小的片段,用 DNA胶回收试剂盒进行纯化,
回收产物于 - 20 保存备用。
132 pET30b( + )载体质粒的处理 同法, 将从
大肠杆菌中抽提到的 pET30b( + )载体质粒用 Nde
+H ind 双酶切, 并以 Nde和 H in d 单酶切以
及未酶切的质粒作对照, 点样电泳检查是否酶切完
全。将酶切完全的载体质粒用 0. 8%琼脂糖凝胶电
泳、回收、纯化,回收产物于 - 20 保存备用。
133 连接反应及转化 反应体系 ( 10. 0 L )组
成: 双酶切段 DNA 40 L; 双酶切 pET30b( + )载
体 DNA 10 L; T4 DNA连接酶液 40 L。将反
222
2010年第 10期 余鳗游等 :黑曲霉植酸酶 phyAm基因结构延伸突变改善酶的热稳定性
应管置于 16 孵育过夜。同时设立以下对照: ( 1)
单酶切 pET30b ( + )的连接; ( 2 )双酶切 pET30b
( + )的连接; ( 3)双酶切表达片段的连接。将 10
L连接产物全部用于转化大肠杆菌 JM 109感受态
细胞, 转化后的细胞悬液铺于卡拉霉素 LB平板,
37 过夜培养。
134 阳性克隆菌株的筛选及鉴定 含有插入片
段重组质粒的阳性克隆, 应在含卡拉霉素的 LB平
板上正常生长, 呈白色菌落。单酶切 pET30b ( + )
自连的转化组,也有白色菌落生长,但数量远远大于
重组质粒组,而双酶切 pET30b( + )连接转化组和
双酶切表达片段连接转化组均无菌落生长。
采用质粒提取试剂盒抽提筛选到的阳性克隆菌
株质粒 DNA,并进行 Nde和H ind 的单酶切和双
酶切分析,以 pET30b( + )空载体和相应 PCR产物
作对照, 0. 8%琼脂糖电泳鉴定。筛选获得植酸酶
phyA
m基因融合 ( pET30bFphyAm )表达阳性转
化子。
14 植酸酶 phyAm基因的融合表达载体 pET30b
FphyA
m在大肠杆菌中的诱导表达
将 pET30bFphyAm表达质粒转入大肠杆菌 BL21
( DE3)中。接种 10mL LB液体培养基 (含 Kana 80
g /mL),过夜培养。按 1%接种量接种 50 mL LB液
体培养基 (含 K ana 80 g /mL), 37 , 200 r/m in摇振
培养至 OD600 = 0. 4 - 10,加入 IPTG, 使终浓度 10
mmo l/L IPTG,于 30 继续培养 5 h。培养结束后, 测
定细胞浓度。将培养液冰浴 20 m in, 然后于 4 ,
4 000 r/m in离心 5m in,收集菌体,用 T risHC l pH8. 0
缓冲液清洗 2次。将菌体重悬于 1 mL超声波裂解液
中,经超声波破碎, 300W, 工作 10 s,停 10 s,重复 10
次。将细菌裂解液于 4 , 16 000 r/m in离心 20m in,
分别保存上清和沉淀。对上清进行酶活测定。
15 诱导表达植酸酶的活性测定 [ 9]
将 14诱导培养液经 4 000 r /m in, 5 m in离心
后,收获上清, 将上清用乙酸缓冲液 ( 0. 25 mo l/L,
pH46)进行 100倍的稀释。反应体系为 0. 5 mL稀
释酶液,加 15mL乙酸缓冲液。按相同的顺序和间
隔向试验组加入 4 mL 8. 4 g /L植酸钠溶液, 对照组
加入 400 mL终点混合液。于 ( 37 0. 1) 的水浴
中反应 30m in后,立即向试验组加入 400mL终点
混合液,对照组加入 4mL 8. 4 g /L植酸钠溶液。反
应后在分光光度计 415 nm, 以标准磷为参照物, 测
吸光值,计算被测样品中植酸酶的酶活性。植酸酶
酶活单位 (U )定义为: 在一定条件下,每分钟释放 1
nmol无机磷所需酶量为 1U。
16 表达产物的 SDSPAGE分析
分别处理标准蛋白质和待测样品后, 加样并电
泳, 电压 160V, 电流 30mA, 时间 3- 4 h。用考马斯
亮蓝 R250染色液染色 4- 6 h后,脱色至出现清晰
蛋白带。
将在 30 对 pET30bFphyAm诱导培养 5 h, 诱
导物为 10 mmo l/L IPTG。每隔 1 h取样, 用 T ris
HC l pH8. 0缓冲液清洗 2次后 - 20 保存, SDS
PAGE电泳进行产酶时间的分析。
将 pET30bFphymA 30 诱导培养的细胞经超
声波破碎后, 分别收集裂解液上清和沉淀, SDS
PAGE电泳检测,进行表达蛋白的可溶性分析。
2 结果
21 黑曲霉植酸酶基因在大肠杆菌中的融合表达
211 植酸酶 phyAm基因融合表达片段的克隆
植酸酶 phyAm基因融合表达片段的 PCR及克隆结
果见图 1。由图 1可知, PCR产物大小均约 14 kb,
并获得了该植酸酶表达片段在 pUC18T载体中的
阳性克隆。
1pUC18phyAm /H ind ; 2. pUC18phyAm /N de +H ind ;
3. DL15000DNA M arker; 4.植酸酶融合表达片段的 PCR产
物和克隆; 5. 对照 (有引物无模板 ) ; 6. 对照 (无引物有模
板 )
图 1 植酸酶融合表达片段的 PCR产物和克隆
212 植酸酶 phyAm基因 pET30b( + )融合表达
载体的构建 植酸酶 phyAm基因融合表达 pET
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
30bFphyAm阳性转化子的鉴定结果见图 2, 其重组
质粒的物理图谱见图 3。由图 2可知,表达片段大
小约 14 kb, 并正确插入到了 pET30b( + )表达载
体中。由于融合表达片段消除了终止密码子, 其
对应的表达产物 C端将融合表达 pET30b( + )载
体质粒上的 13氨基酸残基, Lys Leu A la A la A la
Leu G luH is6。
1. DL 15000 DNA M aker; 2. pET30bphyAm /Nd e + H ind ;
3. pET30bphyAm /H ind
图 2 pET30bFphy Am 融合表达质粒的鉴定
图 3 融合表达质粒 pET30bFphyAm 物理图谱
213 植酸酶 phyAm基因融合表达质粒在大肠杆
菌中的诱导表达 在大肠杆菌 BL21( DE3)中,用 1
mmo l /L IPTG分别在 25 和 30 诱导培养 pET
30bFphyAm 5 h, 每隔 1 h取 1 mL诱导培养物离心
收集菌体收获菌体, 破碎后, 测定植酸酶活力, 得产
酶曲线 (图 4)。
图 4 pET30bFphyAm 表达植酸酶的产酶曲线
214 表达产物的 SDSPAGE 对菌体进行可溶性
蛋白 SDSPAGE分析,结果见图 5。在 IPTG诱导 1 h
后就有明显的蛋白表达, 诱导 3 h后, pET30bFphy
A
m在大肠杆菌中的表达产物即接近最高表达量,这
与细胞超声波破碎后的酶活测定数据相吻合,产酶为
419. 4 U /mL。经 B ioR ad凝胶成像系统 Quantity One
软件分析,融合植酸酶的表达量达到细胞可溶性总蛋
白的 10. 47%,表观分子量为 5264 kD。
1.无感受态细胞提取物; 2 - 6.在 IPTG分别诱导 1, 2,
3, 4, 5 h的细胞提取物;右箭头表示植酸酶条带位置;
7.蛋白质标记
图 5 融合表达产物的 SDSPAGE
215 表达产物的可溶性分析 在 30 诱导 pET
30bFphyAm表达蛋白的可溶性分析, 结果见图 6。
由图 6可知,黑曲霉植酸酶在大肠杆菌中融合表达
的可溶性植酸酶很低,多数以不溶性表达产物即包
涵体形式存在于细胞中, 这样的表达产物不具有生
物学活性,必须经过复性才能变成可溶的有活性的
蛋白。
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2010年第 10期 余鳗游等 :黑曲霉植酸酶 phyAm基因结构延伸突变改善酶的热稳定性
1. 蛋白质标记; 2. 30 下上清液细胞可溶性分析;
3. 30 下沉淀物细胞可溶性分析;箭头表示植酸酶
条带位置
图 6 pET30bFphyAm表达产物的可溶性分析
3 讨论
Ph iillippy等 ( 1997)将 A. niger植酸酶 phyA基
因在大肠杆菌中的表达产物为没有活性的胞内蛋
白,且未被糖基化,在体外溶解和重折叠后其活性只
有天然植酸酶活性的 1%。李弘剑等 [ 10]将来源于
A. n iger植酸酶基因导入大肠杆菌 JM 109中, 表达
出了分子质量为 52 kD的非糖基化胞内蛋白, 虽具
有降解植酸的能力,但植酸酶活性很低。陈惠等 [ 11]
将黑曲霉植酸酶 phyAm基因构建在 pET30b( + )载
体质粒上,通过特定引物设计, PCR扩增, 获得含有
pET30b( + )载体质粒上的 13氨基酸残基延伸突
变植酸酶基因 phyAe,并实现 phyAe基因在毕赤酵母
中有效表达。本研究将 A. niger N25植酸酶基因在
大肠杆菌中获得了有活性表达,但可溶性酶活性与
陈惠等的研究比较,仅为酵母表达酶活的 1%左右。
SDSPAGE分析表明, 融合植酸酶的表达量达到细
胞可溶性总蛋白的 10. 47% , 且多数以包涵体的形
式存在。表达产物的表观分子量为 5264 kD, 远小
于天然黑曲霉所产植酸酶的分子量 70. 2 kD。由于
在原核生物中表达真核基因,缺乏有效的后翻译修
饰,致使酶蛋白不能折叠成为有效的高级结构,导致
酶活性降低。然而, 由于大肠杆菌表达的非糖基化
的酶仍然具有降解植酸的活力。
目前已有多种类型的大肠杆菌表达系统, 如分
泌型、引导分泌型、胞内直接表达型、分子内伴侣协
助折叠型和高度稳定伴侣型等系统。同时, 这些系
统还在表达蛋白 N端和 C端提供了可供选择和方
便的融合蛋白标签。将植酸酶 phyAm基因在大肠杆
菌中表达,产物 C端将融合表达 pET30b ( + )载体
质粒上的 13氨基酸残基 ( Lys Leu A la A la A la Leu
G luH is6) ,其中的组氨酸标签有利于采用亲和层析
方法分离纯化植酸酶蛋白, 为植酸酶性质的研究奠
定可靠的基础。
参 考 文 献
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