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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 9 期
ApCl基因在毕赤酵母中的表达
江程记1，2 高建明2 刘巧莲2 代真真1，2 郑金龙2 易克贤2，3
(1海南大学农学院，海口 571101;2中国热带农业科学院热带生物技术研究所 农业部热带作物生物技术重点开放实验室，海口 571101;
3中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，儋州 571737)
摘 要: 为了研究 ApCl 基因的功能，应用基因重组技术将 ApCl 基因片段克隆入大肠埃希菌―酵母穿梭质粒
pGAPZαA，构建重组真核表达质粒 pGAPZαA-ApCl，电转化巴斯德毕赤酵母 GS115，Zeocin筛选出阳性克隆转化子。通过比较
转化空载体 pGAPZαA和重组载体 pGAPZαA-ApCl的不同菌株分别在含有高盐和高山梨醇浓度的液体培养基中生长情况，发
现毕赤酵母 GS115 在转化 ApCl 基因后其抗旱、抗盐能力显著提高(约 3 倍) ，进一步验证了 ApCl基因对提高生物抗逆能力有
显著作用，为将来分离该蛋白及进一步研究奠定基础。
关键词: ApCl基因 抗旱 抗盐 巴斯德毕赤酵母 生物抗逆
Inducible Expressing of ApCl Gene in Pichia pastoris
Jiang Chengji1，2 Gao Jianming2 Liu Qiaolian2 Dai Zhenzhen1，2 Zheng Jinlong2 Yi Kexian2，3
(1College of Agronomy，Hainan University，Haikou 571101;2Key Laboratory of Ministry of Agriculture for Tropical Crop Biotechnology，
Institute of Tropical Biosciences and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，
Haikou 571101;3 Institute of Environment and Plant Protection，CATAS，Danzhou 571737)
Abstract: For research ApCl gene function，the DNA ApCl gene sequence was subcloned into yeast shuttle expression vector
pGAPZαA，and the recombinant plasmid pGAPZαA-ApCl was constructed． Pichia pastoris GS115 was electrotransformed with
pGAPZαA and pGAPZαA-ApCl，and the postive transformants were selected in the medium of zeocin． Then，the two electrotransformed
yeasts with different vectors were cultured in two kinds of mediums that have high levels of salt and sorbitol． Compared to Pichia pastoris
GS115 with pGAPZαA，transgenic yeast with ApCl gene grows faster，about there times of the contrast． It is proved that ApCl gene is
significant to prove biology anti-adversity． The finding settles a favourable base to study and research ApCl protein．
Key words: ApCl gene Drought-resistance Salt-resistance Pichia pastoris Biology anti-adversity
收稿日期:2011-02-18
基金项目:农业部“948”项目(2010-Z6) ，中央级公益性科研院所基本科研业务费(ITBBZD0828) ，国家科技支撑计划(2007BAD48B06-05) ，海
南省自然科学基金项目(80510) ，国家麻类现代农业技术体系建设专项(nycytx-19)
作者简介:江程记，男，硕士研究生，研究方向:作物遗传育种;E-mail:jiang_80s@ 126． com
通讯作者:易克贤，男，研究员，博士生导师，研究方向:热带作物抗性育种;E-mail:Yikexian@ 21cn． com
喜旱莲子草(Alternanthera philoxeroides)又名水
花生，既可生长在水中，也可生长在旱地上，面对不同
的生境，其外在器官尤其是根的形态表现出较大的可
塑性［1］。喜旱莲子草也可以生长在 400 mmol /L 的
NaCl溶液中，表现出较强的抗盐性［2，3］。因其较好的
适应环境及无性繁殖能力，目前已在许多国家蔓延［4］。
为了阐明它的抗旱、抗盐机理，本研究采用差异显示
技术分离到一个受干旱、盐胁迫诱导表达的 ApCl基
因(GenBank 登录号:DQ985704)。该基因长 738
bp，生物信息学预测表明该基因编码 166 个氨基酸，
部分序列与隐地疫霉分泌的蛋白激发子 Cryptogein
基因有一定的同源性(31 /85)。将预测的二级结构
和高级结构分别进行比对，也可以看出它们之间有
一些相似性，例如均有 6 个 α螺旋，一个反平行的 β
折叠和一个 Ω-loop。但 Cryptogein 蛋白由 98 个氨
基酸组成，而推定的 ApCl 蛋白由 166 个氨基酸组
成，远多于 Cryptogein的 98 个(未发表资料)。Cryp-
togein蛋白已被法国申请专利，作为生物源蛋白农
药开发使用。为了进一步研究 ApCl基因功能，形成
我国自主的知识产权，本研究将其导入酵母菌体内，
2011 年第 9 期 江程记等:ApCl基因在毕赤酵母中的表达
观察其对酵母菌抗渗透性的影响，以期为将来分离
该蛋白及进一步研究奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
限制性内切酶 EcoR I、Xba I 和 Bln I，Taq DNA
聚合酶、2 × PCR Mastermix、T4连接酶及 DNA Marker
均为 TaKaRa公司产品;Zeocin 为 Invitrogen 公司产
品;Gel Extraction Mini Kit(胶回收试剂盒)为上海华
舜生物技术有限公司产品。
含有 ApCl 基因的重组质粒 pUC57-ApCl 及大
肠杆菌受体菌 DH5α由本实验室保存。大肠埃希菌
―酵母穿梭质粒 pGAPZαA 及毕赤酵母 GS115 由中
国热带农业科学院热带生物技术研究所周鹏课题组
惠赠。
1． 2 方法
1． 2． 1 重组酵母穿梭质粒 pGAPZαA-ApCl 的构建
及鉴定 用 EcoR I 和 Xba I 双酶切重组质粒
pUC57-ApCl，酶切产物经 1． 2%琼脂糖凝胶电泳，回
收 453 bp 片段。待双酶切表达载体 pGAPZαA 后，
回收酶切产物大片段并与 ApCl基因连接，连接后转
入大肠杆菌 DH5α，Zeocin 筛选出阳性克隆子，提取
质粒后进行 PCR、酶切、测序鉴定(质粒抽提［5］、酶
切［5，6］及转化［5］等步骤均按常规方法进行，DNA 凝
胶回收按照胶回收试剂盒说明书进行，测序由上海
生工完成)。
1． 2． 2 重组质粒 pGAPZαA-ApCl 转化毕赤酵母
GS115 及阳性克隆子的筛选 提取重组质粒
pGAPZαA-ApCl，用 Bln I 线性化并经酚 /氯仿抽提、
乙醇沉淀［6］。同时，制备毕赤酵母 GS115 感受
态［7］，取 80 μL感受态，加入 10 μL 酶切产物，轻轻
混匀后吸入电击杯冰浴 5 min 后，电击转化［6，7］(同
时转化空质粒 pGAPZαA 作为阴性对照)。转化后
立即加入 1 mL 1 mol /L山梨醇，28℃放置 2 h后，均
匀涂布在含有 100 μg /mL Zeocin的 YPD平板上［8］，
28 － 30℃培养 2 － 3 d 直至培养板上明显长出阳性
单克隆菌落。
1． 2． 3 重组毕赤酵母的菌液 PCR鉴定及胁迫培养环
境下的生长检验 分别挑取培养板上长出的转化空质
粒 pGAPZαA和重组质粒 pGAPZαA-ApCl 的阳性克隆
单菌落，接种至 5 mL YPD液体培养基中(100 μg /mL
Zeocin)，28℃摇菌过夜(OD600值约 2左右)
［8］。
各取 1 μL 摇菌的 菌 液 为 模 板，以 质 粒
pGAPZαA 的 pGAP Forward priming site 及 3AOX1
priming site 为两端引物［8］，各自建立 50 μL 反应体
系，进行 PCR鉴定。
待鉴定后，吸取 400 μL菌液分别接种至 50 mL
含 1． 0 mol /L NaCl、50 mL含 1． 5 mol /L山梨醇(sor-
bitol)的 YPD液体培养基中，28℃ 250 r /min 摇菌。
每隔 4 h吸取少量菌液测量其 OD600值，并记录。
2 结果
2. 1 重组酵母穿梭质粒 pGAPZαA-ApCl的鉴定
挑取转化 pGAPZαA-ApCl 的大肠杆菌 DH5α 阳
性克隆，经摇菌过夜后，提取质粒。以质粒为模板，以
质粒 pGAPZαA 的 pGAP Forward priming site 及 3
AOX1 priming site为两端引物［8］，进行 PCR鉴定。
图 1为扩增出来的目的片段，大小约 900 bp。其
中包括质粒 pGAPZαA本身的α-factor信号肽序列至组
氨酸标签序列的片段，长度为 540 bp，减去双酶切下来
的片段长度为 63 bp，合计 477 bp。再加上克隆入的目
的基因 ApCl(453 bp)，大小与预期基本相符。
图 1 重组质粒 pGAPZαA-ApCl的 PCR鉴定
对提取的质粒 pGAPZαA-ApCl进行的 EcoR I、Xba
I双酶切。结果(图 2)显示，ApCl基因片段(453 bp)已
成功克隆入穿梭载体 pGAPZαA中。
2． 2 重组毕赤酵母的菌液 PCR鉴定
重组质粒 pGAPZαA-ApCl 电击转化毕赤酵母
GS115 后，Zeocin(100 μg /mL)筛选阳性克隆。2 － 3
d后挑取阳性克隆单菌落摇菌过夜，以菌液为模板，
以 pGAPZαA的两端引物，进行 PCR鉴定。
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M． DNA Marker;1． 重组质粒 pGAPZαA-ApCl 的 EcoR Ⅰ和 Xba
Ⅰ双酶切;2．未酶切的重组质粒 pGAPZαA-ApCl为对照
图 2 重组质粒 pGAPZαA-ApCl的酶切鉴定
图 3 中，pGa-ApCl、pGaPZαA 分别转入相应质
粒的毕赤酵母 GS115 菌液 PCR 鉴定。PCR 鉴定结
果表明，重组质粒 pGAPZαA-ApCl 已克隆入毕赤酵
母 GS115 中。
2． 3 重组毕赤酵母在胁迫培养环境下的生长
毕赤酵母 GS115 转化 pGAPZ"A-ApCl 后，以转
化空载体 pGAPZ"A为对照，分别接种含 A(1 mol /L
图 3 重组毕赤酵母菌液 PCR鉴定
NaCl)、B(1． 5 mol /L sorbitol)的两种 YPD培养基中，
28℃摇菌培养。每 4 h 测定一次 OD600值，待数据完
成后，以时间(h)为横坐标，以对应的 OD600值为纵坐
标，做生长曲线图。结果(图4)表明，毕赤酵母GS115
在转化 ApCl 基因后，在干旱(山梨醇模拟干旱胁
迫)、高盐胁迫下生长速度明显高于对照，对照在胁迫
环境下基本不能生长。转基因的 GS115 的抗逆能力
显著提高，相对于对照最高约提高 3倍。
A．含 1 mol /L NaCl的 YPD培养基中，转化 pGAPZ"A和 pGAPZ"A-ApCl的毕赤酵母的生长情况;B．含 1． 5 mol /L sorbitol的 YPD培养基
中，转化 pGAPZ"A和 pGAPZ"A-ApCl的毕赤酵母的生长情况
图 4 转化 pGAPZ"A和 pGAPZ"A-ApCl的毕赤酵母在胁迫环境下的生长曲线
3 讨论
笔者之前通过半定量 PCR 及反向 Northern 试
验证明了 ApCl基因受干旱和盐胁迫诱导，本试验又
证明了 ApCl基因对提高酵母菌的抗盐、抗旱(山梨
醇模拟干旱胁迫)能力有较大的提高，进一步证明
了 ApCl基因对植物抗旱、抗盐的作用。我们还将其
转入了酿酒酵母中，发现其抗酒精、葡萄糖的山梨醇
的能力都有较大提高(资料未发表)。下一步将对
酵母菌中表达的蛋白进行纯化，注射烟草叶片，观察
其是否也像 Cryptogein基因那样能引起叶片的超敏
反应［9］，并进一步研究其在抗旱抗盐中的功能，最
终形成我国自主的知识产权。
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(责任编辑 马鑫
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