全 文 ：2008年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论·
收稿日期:2007-11-16
基金项目:北京市教委基金(KM200510028008)
作者简介:郝云婕(1981-),硕士,研究方向:细菌分类
通讯作者:韩素贞,Tel:68902964,E-mail:hansuzhen99@vip.sina.com
系统发育分析在细菌分类中占有重要地位。核
糖体 RNA基因(特别是 16SrRNA基因)因进化速
率缓慢,基因产物功能保守,其序列分析是目前细
菌的主要系统发育分类方法。Woese在 20世纪 70
年代末开始应用 16SrRNA序列分析技术对细菌进
行系统发育分类的研究[1]。
而 16SrRNA分子较小、包含的信息量较少,
对于亲缘关系较近的细菌可能分辨率不够,常不
能反映关系较近的种间关系[2],16SrRNA序列分析
也只能在属的水平上区分细菌,而种水平分类单元
仍需要通过 DNA-DNA杂交结果来最后确定。但
DNA-DNA的杂交不仅给细菌分类带来较大的工作
量,而且由于杂交过程受很多因素影响,杂交结果
有时并不稳定。此外,也有发现 16SrRNA基因序列
用于系统发育分析存在其它缺陷的研究报告。如不
同种菌株之间的 16SrRNA基因存在重组现象[3,4],
说明依据 16SrRNA基因序列分析推论系统发育关
系有可能出现错误。或者 16SrRNA序列的高级结
构对一级结构进化有束缚[5],序列比对时可能还必
须考虑二级结构,否则会影响系统发育关系的准确
性。还由于细菌之间可能发生基因横向转移,使一
些依据传统分类方法无关的属种聚在一起[4]。
由于用 16SrRNA基因进行系统发育分析存在
局限性,研究者们尝试用其它保守的染色体基因进
行细菌系统发育分析,与 16SrRNA基因序列分析
得到的结果相互补充和验证。如热激蛋白(Heat
shockproteinHSP)相关基因(hsp65、hsp70等)、重组
蛋白基因(recA等)、延长因子 Tu基因、部分 RNA
聚合酶基因(rpoB、rpoD等)和 DNAtopoisomeraseI
的 gyrB等等。
gyrB属于信息通路中与 DNA复制、限制、修饰
和修复有关的蛋白编码基因[5],呈单考贝,多数细菌
中都存在;一般位于细菌基因组的 rnpA-rmpH-
dnaA-dnaN-recF-gyrB-rnpA基因簇中,编码的是惟
gyrB基因在细菌系统发育分析中的应用
郝云婕 韩素贞
(首都师范大学生命科学学院,北京 100037)
摘 要: 细菌gyrB编码DNA促旋酶的B亚单位蛋白,对细菌DNA的转录和复制很重要。因不显现频繁的基因
横向转移并且基于该序列的分析与DNA杂交同源性分析有较好的一致性,近年来常被选用于细菌系统发育分析及细菌
鉴定,一般采用对该基因测序或对其PCR产物RFLP等方法进行研究。
关键词: gyrB 系统发育分析
ApplicationofgyrBGeneinBacterialPhylogeneticAnalysis
HaoYunjie HanSuzhen
(ColegeofLifeScience,CapitalNormalUniversity,Beijing100037)
Abstract: gyrBinbacteriacodesBsubunitproteinofDNAgyraseswhichisimportantinDNAreplicationand
transcription.Becauseitslow frequencyin1ateralgenetransferandsequencinganalysisinaccordancewithDNA-DNA
hybridization,itwasusedinphylogeneticanalysisandidentificationinbacteriaatpresent.SequencinganalysisorPCR-RFLPwas
usedingyrB.
Keywords: gyrB Phylogenyanalysis
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
一一种能诱导 DNA负超螺旋的拓扑异构酶——
DNA促旋酶的 B亚单位蛋白 GyrB,对细菌 DNA的
转录和复制很重要。因不显现频繁的基因横向转移
并且基于该序列的分析与 DNA杂交同源性分析有
较好的一致性,近年来常被选用于细菌系统发育分
析及细菌鉴定[6],一般都是采用对该基因测序或对
其 PCR产物 RFLP等方法进行研究。
1 依据 gyrB序列分析细菌的亲缘关系
Yamamoto[7]等人 1995年设计出通用引物可从
许多革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌成功扩增出
GyrB基因。于是,他们[8]对 20株假单胞菌属(包括
Pseudomonas putida、Pseudomonas fluorenscens 和
Pseudomonaschlororaphls)菌株的 16SrRNA和 GyrB
基因序列进行了测序,发现根据用 GyrB基因序列
同源性建立的系统发育树中,这些菌株可分为两大
群:一群包括 P.putida模式菌株及其所有的生物变
种 A,另一群包括所有 P.putida生物变种 B及 P.
fluorenscens和 P.chlororaphls菌株;而用 16SrRNA
全序列进行分析时,P.putida生物变种 A和 B并没
有分开。他们认为,虽然 16SrRNA的可变区碱基替
换率很高,但由于存在互补作用,所以螺旋结构并
没有改变,而可变区的二级结构的功能很重要,所
以并没有导致相近的种产生差别。他们还发现
GyrB基因相对于 16SrRNA基因具有较高的替换
率,并且作为蛋白编码基因所固有的遗传密码子的
兼并性使其 DNA序列可发生较多替换而不改变氨
基酸序列(尤其是第三位核苷酸),因此特别适合亲
缘关系较近的菌种的区别和鉴定[9]。
Kasai[10]等人对放线菌 Micromonospora属的 15
个种和 4个亚种的 gyrB序列分别进行了分析。结
果与 16SrRNA序列分析的一样:这些菌株形成一
个大的分支,但反映的属内各菌株之间的亲缘关系
不同,GyrB基因序列分析的结果能更好地将各个
种分开,而 DNA-DNA杂交的结果与 GyrB基因序
列分析的结果一致,因此他们根据杂交和 GyrB基
因序列分析的结果将该放线菌属重新分为 14个
种。根据对放线菌、假单胞菌和分枝杆菌等细菌的
系统发育研究,Kasai等[10]认为,GyrB基因符合蛋白
类编码基因作为分类鉴定和系统发育分子标记的
要求,特别是 gyrB序列分析,对高 G+Cmol%含量
G+细菌种水平的分类很有用。
目前,gyrB序列分析也较好地解决了其它细菌
如蛭弧菌属(Vibrio)、芽孢杆菌属(Bacilus)巴氏肺
炎球菌(Pasteurelapneumotropica)和苯酚分解菌等
相近菌株的分类问题[10,11]。
2 gyrBPCR-RFLP进行细菌鉴定
分枝杆菌的菌株传统上依据表型来鉴定,但很
多种的菌株生长很慢,故现在也多采用如 16S
rRNA系统发育分析等遗传方法进行。而分枝杆菌
属(Mycobacterium)内很多种亲缘关系很近,用 16S
rDNA序列分析很难将它们区分开。Kasai[11]等人对
生长较慢的 15个种的分枝杆菌模式菌株进行了
GyrB基因序列分析,从以该序列分析结果建立的
无根树上可以看出,这 15个菌株都有独立的分支。
其中 M.tuberculosis、M.bovis、M.africanum和 M.
microti的相似性达到 99%。分析比对它们的 gyrB
序列后发现有 4个碱基同义置换位点,根据这些位
点分别设计引物对 4种分支杆菌进行种特异性
gyrB序列扩增,从扩增产物的电泳图谱上对它们进
行鉴定。还可用特异性 gyrB序列片段 PCR的方法
鉴定这 4种分枝杆菌:比对 M.tuberculosis和其它
分支杆菌的 gyrB序列,找出特异性的片段,通过设
计该菌的特异性引物从 M.tuberculosis而不是其它
种分支杆菌中扩增出该片段,这样就可以鉴定 M.
tuberculosis种,依此类推可区别鉴定其他 3种分枝
杆菌。此外,还可进行 4种分枝杆菌的 gyrBPCR-
RFLP分析,根据酶切图谱来鉴定各个菌。
Coenye等[12]同样用 gyrBPCR-RFLP对 Stenotrop-
homonas的各个种进行了分析,然后对 191株 Sten-
otrophomonasmaltophilia进行了鉴定,鉴定的结果与
DNA-DNA杂交的结果一致。这一研究说明了用
gyrBPCR-RFLP方法对细菌进行系统发育分析和
菌种鉴定的潜力。Gulati[13]等对分离自印度、法国、
德国和美国 81株不同血清型的 Yersiniaenterocoli-
ticabiovar1A进行了 gyrBPCR-RFLP分析,将它们
分为两群,分别将各群中的致病菌和非致病菌分为
若干亚群,结果与 16SrDNA和 16S-23SrDNA转录
间隔区(ITS区)序列多态性分析的结果一致,为该
菌的鉴定提供了很好的依据。用 gyrBPCR-RFLP鉴
定对巴氏肺炎球菌的鉴定也取得了比较好的效果[11]。
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3 gyrB序列与其它编码蛋白类的靶基因结
合分析的研究
3.1 gyrB与 rpoD序列共同分析
Yamamoto等[8]通过分析 gyrB和 rpoD(RNA聚
合酶 δ-70因子的编码基因)序列,研究假单胞菌属
属间和属内相关性。重新定位 PsutidabiovarB菌株
的分类地位时发现两个进化树框架基本相似。
Soler[14]等用 gyrB和 rpoD序列分析气单胞菌属
(Aeromonas)系统发育时发现,这两个基因有相同
的置换率 (小于 2%)和相似的变异位点 (分别为
34%和 32%);分别用 gyrB、rpoD或结合这两个基因
的序列分析结果都和已有分类结果一致。可见,在
种内水平,gyrB对相近的种具有很高的分辨率,
rpoD能把混杂在一起的种区分开来,但综合两个
基因的序列分析能更好地区分相近的分类单元。
3.2 gyrB与 rpoB、groE序列一起分析细菌
Kupfer[15]等分别根据 16SrRNA、GyrB、RpoB基
因序列研究了 28个已知的及从人、动物以及环境
中分离出来的 33株 Aeromonas菌的分类。结果表
明,16SrRNA只能在属的水平将这些菌株分开,而
gyrB序列分析对属内种的区分很有用,而且尽管
rpoB比gyrB更保守,它同样能很好地区分Aeromonas
属内关系相近的种;如果采用 rpoB差异较大的区
域进行分析,那么其序列分析的分辨率与 gyrB不
相上下;结合rpoB的分析,能够澄清人们对于Aero-
monas属中有争议的种的认识。
VolokhovDV[16]等利用 rpoB部分序列和 gyrB以
及 16-23SrRNA转录间隔区(ITS区)的全部序列对
古细菌 Acholeplasma所有已知种菌株进行系统发
育研究。这些基因分析的系统发育树与 16SrRNA
的系统发育树中所表现的各个菌株的亲缘关系很
相似,因此认为可把它们作为分析古菌Acholeplasma
属内菌株进化关系的补充标记。
3.3 与更多的蛋白编码基因一起分析
Chelo[17]用 16SrRNA基因和蛋白编码基因 dnaA
(编码染色体复制的起始蛋白)、gyrB、rpoC(编码依
赖 DNA的 RNA聚合酶 β′亚单位)和 dnaK(编码
70kD热休克蛋白)分析Leuconostoc-Oenococcus-Weis
sela分支内各菌株进化关系的一致性。结果表明,
几个蛋白编码基因数据叠加后得到的树状图结构
与 16SrRNA的一致。16SrRNA基因的进化速率虽
然能够反映属水平的进化关系,但是有些菌株的分
类地位似乎在各类蛋白基因序列分析所得到树状
图中更加可靠。
综上所述,相对保守而又有一定变异率的持家
基因——gyrB序列已经逐渐显示出许多优势表明
它既可作为一种重要的分子标记进行细菌系统发
育分析,又可在种的水平确认新的分类单元。目前
已有许多种属细菌的大约 1000多个 gyrB序列及
其相关产物 GyrB数据被放置于 ICB(htp:/www.
mbio.co.jp)[18]数据库,为细菌分类鉴定提供了方便。
展望未来,尽管以 gyrB序列为基础的系统发
育分析、分类鉴定细菌等微生物的研究已经广泛展
开,相关数据库 ICB也在逐渐壮大,更精确的分子
标记和更简便准确的分析方法仍然需要大家在不
断的实践和创新中共同努力寻找。而且,随着测序
技术的发展,细菌全基因组序列的分析和比对研究
逐渐变得较为容易,系统发育分类将依据对大量细
菌进行序列分析然后进行比较或是通过能够反映
序列变异的高通量的芯片方法进行深入研究。
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