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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 12期
木榄 CaM基因的克隆及序列分析
庞俊峰1, 2
于卓 1
张占路 3
房永雨 2
唐益雄 2
吴燕民 2
( 1内蒙古农业大学农学院,呼和浩特 010019; 2中国农业科学院生物技术研究所,北京 100081; 3深圳市农科集团公司,深圳 518040)


摘
要:
以深圳红树自然保护区的木榄为材料, 根据 GenBank上已公布的钙调蛋白氨基酸保守区的碱基序列设计引
物, RT
PCR扩增木榄 CaM序列, 获得 cDNA全长 735 bp, 命名为 BgCaM ( GenBank登录号: GU722140)。生物信息学分析表明,
BgCaM与拟南芥、花生、大麦、榉木及甘薯等植物钙调蛋白氨基酸保守区具有较高同源性。 BgCaM基因完整开放阅读框为 450
bp, 编码 149个氨基酸, 预测蛋白等电点为 4. 11,分子量为 16. 8 kD。分析基因序列和相应酶切位点, 将扩增获得的 BgCaM基
因完整开放阅读框与中间表达载体相应酶切产物进行连接,构建植物表达载体 pC13rd29A
BgCaM, 为 BgCaM功能分析和进一
步利用奠定了基础, 为植物转基因研究与应用又增添了一个新的基因源。
关键词:
木榄
钙调蛋白
基因克隆
生物信息学
载体构建
The Cloning and Research of CaM on Bruguiera gymnorrhiza
Pang Junfeng
1, 2
Yu Zhuo1
Zhang Zhanlu3
FangYongyu2
Tang Y ixiong2
W uYanm in2
(
1
College of Agronomy, InnerM ongolia Agricultural University,H uhhot 010019;
2
B iotechnology R esearch Institute, ChineseA cademy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;
3
ShenzhenN ongke Group Corporation, Shenzhen 518040)


Abstrac:t
B ruguiera gym norrhiza as m ate rials in this study wh ich co llected from the Shenzhen m angrove natu re reserves. This
study refe renced o ther CaM genes have been repo rted from GenBank. Based on the h ighly conserved nucleotide sequence in the reg ion of
am ino acids, w e cloned the full leng th CaM cDNA sequencew hich is 735 bp from Bruguiera gymnorrh iza, and nam ed BgC aM ( GenBank
number: GU722140) . B io inform atics analysis showed that the BgCaM has h igh hom o logy on conse rvative reg ion o f am ino acids when
compared w ith theA rab idop sis thaliana, peanuts, ba rley, beech, sw eet po tato and o ther p lants by sequence a lignment and phy log enetic
tree ana lys is. The comp le te open read ing fram e o f BgCaM is 450 bp, encoding 149 am ino ac ids. Predicted pro tein isoelectric point is
4
11, m olecu larw e ight is 16. 8 kD. Ana lysis o f gene sequences and the correspond ing restr ic tion s ites, D igest the PCR amp lifica tion
product includ ing the comp le te read ing fram e and in troduce the fragm ent into the d igested inte rmed iate expression vector, and construct
p lant expression vector pC13rd29A
BgCaM. This study has la id a foundation to m ake function ana lysis and application on BgCaM, it
prov ide a new gene tic sources fo r p lant transgenic research and applica tion.
Key words:
Brugu iera gym norrhiza
CaM
C lone
B io informa tics
Vec to r construction
收稿日期: 2010
04
29
基金项目:农业部转基因生物新品种培育重大专项 ( 2009ZX08005
004B )
作者简介:庞俊峰,男,硕士,研究方向:植物基因工程; E
m a i:l pang jun feng@ live. cn
通讯作者:吴燕民,男,研究员,博士,研究方向:生物反应器和植物基因工程; E
m ai:l Wuym 56@ 163. com
红树林是生长在热带、亚热带海岸潮间带的木
本植物群落,经过漫长的历史演化最终适应了海盐
滩或海湾内沼泽地潮涨潮落的生存环境。红树林主
要由红树科、海桑科、马鞭草科等植物群落构成,其
中红树科有 14属 100余种,分布于东南亚、非洲及
美洲热带地区, 我国有 6属 30余种, 主要分布在广
东、广西、海南、香港、台湾等地。红树林具有防风
浪、固海堤、减轻陆源径流对近海污染等生态防护作
用 [ 1]。木榄 [B rugu iera gymnorhiza ( L. ) Lam ]属于红
树科木榄属,生长于热带和亚热带陆海交汇的海湾
河口潮间带, 乔木或灌木,高 2- 4 m, 有支柱根, 叶
革质且交互对生,呈椭圆形。花两性, 聚伞花序, 果
实倒卵形下垂, 长 20- 40 cm。木榄在维护海岸生
态平衡、环境监测、水体净化中起到重要作用 [ 2]。
2010年第 12期



庞俊峰等 :木榄 CaM基因的克隆及序列分析

胎生
的生殖方式是其特点之一, 当幼苗发育到一
定程度便从植株母体脱落到淤泥里逐渐发育成熟,
或随海水漂流至下游适宜地方发育。在长期的进化
过程中木榄进化出一套有别于陆生植物或淡水植物
的耐盐机制。
钙调蛋白 ( calmodulin, C aM )是生物细胞内一种
重要的调控蛋白,作为一种多功能钙离子传感蛋白
存在于所有真核生物中,在植物生长发育过程中,钙
离子作为第二信使扮演着至关重要的角色。细胞内
的钙离子受激素、光照、机械损伤以及病虫害等许多
信号的调控 [ 3] ,这些信息形成的瞬时钙离子信号又
被多种细胞内钙离子传感蛋白所破译 [ 4]。即通过
自身特有的 CaM结合结构域 ( CaM
b ind ing dom ain,
CaMBD)与其靶蛋白相互作用调节细胞的正常生长
和发育以及生理功能,包括酶活性调节、细胞分裂与
分化、细胞骨架与细胞运动、细胞分泌和渗透调节、
细胞信号转导、光合作用等。近几年来,越来越多的
编码钙调蛋白的基因在动物、植物、真菌和原生动物
中都被分离和克隆出来。其中已成功克隆的植物材
料有水稻、小麦、大麦、条斑紫菜、马铃薯、玉米、丹参
和拟南芥等 [ 5- 12 ]。但很少见红树科植物钙调蛋白
基因克隆的报道,因此克隆该基因将为植物基因工
程领域增添新的抗逆基因源,在转基因生物新品种
的培育方面具有重要意义。
1
试验和方法
1. 1
材料菌种及主要试剂
木榄枝条采集于深圳红树林自然保护区。用
250 mmol /L的 N aC l将木榄嫩枝浸泡处理 5 h, 摘
取幼嫩叶片立即用液氮处理, 保存于 - 80
超低
温冰箱中备用。大肠杆菌 DH5
和农杆菌菌株
C58C1都由本实验室保存, pMD19
T克隆载体和
Taq酶购自 TaK aRa公司, DNA胶回收试剂盒购自
北京百泰克生物技术有限公司, 限制性内切酶、T4
连接酶等购自 NEB公司, 第一链 cDNA合成试剂
盒购自 MB I公司, 引物合成由北京奥科生物技术
有限公司完成, 测序由中国农业科学院作物基因
资源与遗传改良国家重大工程开放实验室测序部
完成。
1. 2
木榄总 RNA提取和 cDNA的合成
采用胍盐 /

巯基乙醇法提取木榄新鲜幼嫩叶
片总 RNA, 变性琼脂糖凝胶电泳检测 RNA并于
- 80
保存。用 MB I反转录试剂盒合成 cDNA, 以
木榄总 RNA为模板, 以 O ligo
dT为引物 (工作浓度
为 10 pmo l/
L) , 70
预变性 5 m in,立即置于冰上
2 m in。利用 M
MuLV反转录酶 42
60 m in进行
逆转录, 70
10 m in灭活反转录酶终止反应, 向反
应液中加入 1
L ( 2 U /
L)的 RN ase H, 37
20
m in消化与 cDNA结合的单链 RNA, - 20
保存
备用。
1. 3
同源 cDNA片段 RT
PCR扩增及产物克隆
根据 GenBank上几种已克隆的作物 (玉米、甘
蔗、水稻等 )钙调蛋白 cDNA编码序列附近高度保守
的碱基序列设计引物。 BCF: 5

GCGCGGCATGGCG

GATCCGCTCACCGAC
3
, BCR: 5

GGCCTCCCATG

GCCATCATGACCTTGA
3
。以木榄 cDNA为模板,
进行 RT
PCR扩增,反应程序: 94
4 m in, ( 94
35
s, 61
35 s, 72
60 s) 30个循环 , 72
10 m in。
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析,在长波紫外
灯下切割特异 DNA片段凝胶,将切下的 DNA凝胶
放入 1. 5mL离心管中称重, 注意要将离心管预先称
重, 加入 3倍体积的溶胶结合液, 55
水浴 8- 10
m in, 直至胶完全溶解,加入 1倍体积的异丙醇后混
匀, 将上述溶液加入吸附柱中, 12 000 r/m in离心 1
m in, 弃掉废液, 加入 700
L漂洗液 12 000 r /mm in
离心 1m in,弃掉废液,将吸附柱放到新的离心管中,
加入 50
L洗脱缓冲液, 室温静置 2 m in, 之后
12 000 r/m in离心 1m in,将回收产物与 pMD19
T载
体室温金属浴连接 1 h。
1. 4
重组子克隆的转化、筛选鉴定及测序
将 10 mL连接产物加入到 50mL DH 5
感受态
细胞中,冰上放置 30 m in, 42
热激 60 s, 再冰浴 2
m in, 加入 LB培养基 500mL于 37
下 200 r /m in培
养 1 h,涂于含 100mg /mL氨卞青霉素和 20mg /mL
的 X
ga,l 40 mg /mL的 IPTG中 LB培养基上 37
培
养 10 h左右获得阳性重组子。在选择培养基上挑
取白色菌落, 进行菌落培养并 PCR验证, 引物为
BCF和 BCR,扩增程序: 94
3 m in, ( 94
45 s, 61

35 s, 72
40 s) 30个循环, 72
10 m in。反应结束
后用 2%的琼脂糖凝胶电泳对 PCR产物进行鉴定,
并将筛选得到阳性克隆送中国农业科学院作物基因
127
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 12期
资源与遗传改良国家重大工程开放实验室测序部
测序。
2
结果与分析
2. 1
木榄总 RNA提取
木榄叶片总 RNA提取效果良好, 变性琼脂糖凝
胶电泳结果 (图 1)显示 28S和 18S条带明亮清晰,
无杂质污染, 结果符合下游 cDNA合成和 RT
PCR
试验要求。
图 1
木榄总 RNA提取结果
2. 2
木榄 CaM基因 cDNA序列的获得
通过设计特异引物 BCF和 BCR,以木榄叶片 cD

NA为模板进行 RT
PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测
得到一条约 700- 800 bp的扩增产物 (图 2), 回收这
条特异片段,转化后菌落 PCR验证结果正确 (图 3)。
挑取多个阳性转化克隆测序, 结果表明 735 bp测序
结果为正确序列, 此序列比对结果显示与多种植物
CaM家族的基因有较高相似性, 推断为新的 CaM基
因,命名为 BgCaM ( GenBank: GU722140)。

M. DNA Marker; 1. PCR产物
图 2
BgCaM 基因 cDNA扩增结果



M. DNA M arker; 1 - 5. PCR产物


图 3
菌落 PCR结果
2. 3
BgC aM cDNA全长生物信息学分析
2. 3. 1
BgCaM cDNA全长基本信息
BgC aM基因
的全长序列为 735 bp (图 4) , 完整开放阅读框 450
bp( 69- 518 bp) ,编码 126个氨基酸 (图 5), 5

UTR
( 1- 68 bp), 3

UTR ( 519- 735 bp)。通过 Theoreti

cal pI/Mw工具预测蛋白等电点为 4. 11, 分子量为
16. 8 kD。
TCTTCGTTGATCCACTCACCCGCCGAAGTCTCTCCTCC
CATCTCCGCTTCTCTCGCGCAGAGGAGGCCATGGCGG
ATCAGCTCACCGACGACCAGATCGCCGAGTTCAAGGA
GGCCTTCAGCCTCTTCGACAAGGACGGCGATGGTTGC
ATCACAACCAAGGAGTTGGGAACTGTCATGCGTTCACT
AGGGCAGAACCCAACGGAAGCTGAGCTCCAGGACATG
ATCAACGAGGTTGATGCTGATGGCAATGGAACCATTGA
TTTTCCTGAGTTTCTCAATCTGATGGCTCGCAAGATGAA
GGACACTGATTCAGAGGAAGAACTCAAGGAGGCCTTCC
GGGTGTTTGACAAGGACCAAAATGGCTTCATCTCCGCT
GCTGAGCTCCGCCATGTGATGACAAATCTTGGCGAGAA
GCTAACTGACGAGGAGGTGGATGAGATGATCCGTGAGG
CTGATGTTGATGGTGATGGTCAGATAAACTATGAGGAG
TTTGTGAAGGTCATGATGGCCAAGTGAGCCATGGAACC
ATACTCTAAGGCAGAGGAGGCTAAAAAGGATTTTCCTG
CTATGTTCCTCTGAAGTGTGTTTTCAGATCTCTATTGTG
TGTTGCATAGTCCTAGTTAAGATGCAACACTTGTTTTAT
CAATTTCCAGTGAAGCATCCTACTAGCTGTAGTCGTAGT
TATATATTTTTTCATCAATTTATGCTCGAGTCTAATCAAA
AAAAAAAAAAA
图 4
BgCaM基因 cDNA全长序列
2. 3. 2
编码区典型结构域分析
NCB I在线对 Bg

CaM基因编码的蛋白结构域进行分析, 结果 (图 6)
表明 BgCaM蛋白含有位于 13- 74和 85- 146位的
128
2010年第 12期



庞俊峰等 :木榄 CaM基因的克隆及序列分析
149 aa
MADQLTDDQ IAEFKEAFSLFDKDGDGC IT

TKELGTVMRSLGQNPTEAELQDM I

NEVDADGNGT IDFPEFLNLMARKMKDTD

SEEELKEAFRVFDKDQNGFISAAELRH

VMTNLGEKLTDEEVDEM IREADVDG

DGQ INYEEFVKVMMAK
图 5
BgCaM 基因推测的氨基酸序列
2个 Ca2 +结合基序 ( EFh)结构域, 可以特异结合
Ca
2 +
,发挥其调控功能。
2. 3. 3
同源比对和系统进化树分析
在 NCB I中
搜索 CaM基因 mRNA序列, 用 DNAMAN软件进行
基因序列比对和系统进化树分析,结果 (图 7)显示,
木榄与拟南芥、花生、大麦、榉木、甘薯、桑树、烟草、
图 6
BgCaM 典型结构域分析
甘蔗以及丹参等多数作物 CaM 氨基酸保守区具有
较高的同源性。系统进化树分析 (图 8)表明木榄
CaM基因与拟南芥、甘薯、桑树、大麦、甘蔗等作物
聚类在一起。









a.拟南芥; b.花生; c.大麦; d.榉木; e.甘薯; .f木榄; g.桑树; h.烟草; .i甘蔗; .j丹参









图 7
木榄 CaM 与植物中已知的 CaM 类转录因子的氨基酸保守序列比对
a.拟南芥; b.花生; c.大麦; d.榉木; e.甘薯; .f木榄; g.桑树; h.烟草; .i甘蔗; .j丹参
图 8
木榄 CaM与植物中已知的 CaM类转录因子的氨基酸保守序列比对
2. 4
表达载体 pC13rd29A
BgCaM的构建
2. 4. 1
引物设计与 PCR扩增
设计合成含有酶切
位点 BamH
和 B stp
的引物 BgCaM ( F)和 BgC aM
( R )。利用该引物从连接有 BgCaM 基因全长的
pMD19
T载体上扩增出其完整的阅读框。扩增产
物经相应的酶切、琼脂糖凝胶电泳、回收纯化, T4连
接酶将 BgC aM基因连接至中间载体 pC13rd29A相
应的酶切位点, 构建植物表达载体 pC13rd29A
Bg

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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 12期
CaM (图 9)。所用引物 BgCaM ( F ): 5

CGCGGATC

CATGGCGGATCAGCTCA
3
, BgCaM ( R ) : 5

GGG

TAACCTCACTTGGCCATCATG
3
。
图 9
表达载体 pC13rd29A
BgCaM
2. 4. 2
重组质粒的菌落 PCR鉴定
在重组质粒的
转化 LB (K an+ )平板上,分别挑取白色单菌落, 进行
菌落 PCR鉴定, 6个为阳性克隆, 见图 10。


M. M arker; 1 - 6. pC13 rd29A
BgCaM
图 10
pC13rd29A
BgCaM 重组质粒菌落 PCR扩增结果
2. 4. 3
重组质粒的酶切鉴定
将 PCR检测的阳性
菌落转入 LB (K an+ )液体培养基, 37
摇菌过夜,提
取重组质粒并进行酶切鉴定。 pC13rd29A
BgC aM
重组质粒均被切出目标带,酶切结果正确,见图 11。
M. Marker; 1. pC13 rd29A
BgCaM重组质粒;
2. BamH I和 B stp I双酶切
图 11
pC13rd29A
BgCaM 重组质粒的酶切结果
2. 4. 4
含有表达载体的农杆菌 PCR检测
将重组
质粒转化农杆菌 C58C1, 以转化后的农杆菌菌液为
模板, 进行菌落 PCR鉴定 (图 12 )。检测结果表明
上述重组质粒已成功转入农杆菌中。


M. M arker; 1- 8. pC 13 rd29A
BgC aM



图 12
含有表达载体 pC13rd29A
BgCaM
的农杆菌 C58C1的菌落 PCR
3
讨论
在植物生长发育过程中, C a2+作为第二信使扮
演着至关重要的角色。细胞内的 Ca2+浓度受激素、
病虫害、非生物胁迫等许多信号的调控,这些信息形
成的瞬时钙离子信号又被细胞内多种钙离子传感蛋
白所破译。CaM生理功能的研究涉及面相当广泛,
在酶活性调节、细胞分裂与分化、细胞分泌和渗透调
节、细胞信号转导、光合作用、花粉萌发、激素反应、
核内酶系统及基因表达等生理过程中都有 CaM的
参与。在非刺激环境中,细胞中钙调蛋白与 Ca2+结
合后构型稳定,逆境胁迫刺激 (例如盐胁迫 )会使细
胞中 Ca2+浓度升高, C a2+ 同钙调蛋白结合形成
钙
-钙调蛋白复合物
, 就会引起钙调蛋白构型的变
化, 增强了钙调蛋白与许多效应物结合的亲和力,从
而增强抗性。木榄是典型的盐生植物,自身具有特
殊的耐盐生理机制,本试验首次从木榄中克隆出的
钙调蛋白基因结构域中具有两个典型的 Ca2 +结合
基序 ( EFh)结构域,推测其可以特异结合 Ca2 +并发
挥调控功能。
钙调蛋白基因具有高度的保守性。本试验克隆
出的 BgCaM基因与已知的从豌豆、苜蓿、水稻、大
麦、电鳗、根瘤及酵母中克隆出的钙调蛋白基因同源
性较高, BgCaM 氨基酸与拟南芥、甘薯、桑树、大麦
和甘蔗同源性在 98%左右, 这表明钙调蛋白序列在
植物中相当保守,差别多在于碱基 C和 T之间的替
换。分析表明克隆于水稻、小麦、大麦、马铃薯、玉
米、丹参及拟南芥等植物的 CaM基因 cDNA序列同
源性都在 85%以上,表明单子叶植物和双子叶植物
的 CaM基因在保守性上差别不大。分析发现已报
130
2010年第 12期



庞俊峰等 :木榄 CaM基因的克隆及序列分析
道的不同生物钙调蛋白基因调控序列在结构上与其
编码序列有一定差异, 这种差异可能与不同来源的
植物因环境适应或不同生理阶段有关。因此, 对钙
调蛋白基因的克隆过程, 可用来进一步研究其在植
物逆境反应及其它生理生化过程中的调控表达
机理。
基因克隆是基因利用的前提, 对基因功能的研
究是应用的又一关键。目前研究基因功能的方法要
有瞬间表达分析、转基因植株功能分析、突变分析以
及 RNA i技术等。植物 CaM基因瞬间表达分析可以
快速提供 Ca2 +结合特性的信息, 但缺陷在于基因浓
度大大超过体内正常的水平,在高浓度下可能会与
低亲和 Ca2 +结合基序结合,不能真实反应体内 DNA
与蛋白的结合情况。插入突变可产生功能缺失突变
体,通过比较目的基因功能丧失的植株与野生型植
株在基因表达上的差异来鉴定基因功能。但插入突
变体分析基因功能的局限性在于植物中有一定数量
的基因是多拷贝的,有的甚至紧密地连锁在一起,通
常不易得到目标基因的纯合突变体。RNA i等可以
利用反义 mRNA和 RNA之间形成的复合物被降解
或核内加工破坏,使 mRNA的翻译受到阻遏后不能
产生基因相应的表达产物, 从而发挥调节基因表达
和验证基因功能的作用。RNA i的缺点在于有时不
能彻底抑制基因功能, 不一定能导致特异和有效的
RNA i应答, 以及产生脱靶效应或干扰素反应等。目
前的研究中利用最多的方式是通过获得过表达转基
因植株来揭示基因功能。因此本试验将目的基因与
诱导型启动子融合,构建了植物表达载体,为获得转
基因植株对 BgCaM进行功能验证奠定了良好基础。
参 考 文 献
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