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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 12期
基于多重 PCR的 DNAMarker制备方法
张俊河  王俐  董卫华  王芳  王天云
(新乡医学院生物化学与分子生物学教研室,新乡 453003 )
  摘  要:  报道了一种简便的制备分子量大小为 100- 1 000 bp DNA m arke r的方法, 其原理是以一段特异的 DNA片段为
模板, 设计 PCR引物, 采用多重 PCR的方法一次扩增 100- 1 000 bp系列条带,酚 /氯仿抽提,乙醇沉淀, 即可得到条带清晰的
DNA m arker。
关键词:  DNA m arker PCR 凝胶电泳  制备
A SimpleM ethod for Prepareing DNAM arker
Zhang Junhe W ang L i DongW e ihua W ang Fang W angT ianyun
(D epartm ent of Biochem istry and M olecularB iology, X inx iang M edical University, X inx iang 453003)
  Abstrac:t  A simp le m ethod that prepare DNA m arker is reported in this paper. A spec ific DNA fragment w as used as PCR tem

p late, and m ultip le PCR was used to am plify 100- 1 000 bp series DNA fragm ents, and then were purified and e lectropho resised in 2%
agarose ge ls, the bands o f the prepared DNA m arke rw ere clear and cou ld be used in the mo lecu la r experim ents.
Key words:  DNA marker PCR Gel e lec trophoresis Preparation
收稿日期: 2010
04
23
基金项目:河南省科技厅科技攻关资助项目 ( 0624410041) ,河南省教育厅自然科学基金 ( 2008A310008)
作者简介:张俊河,男,硕士,讲师,主要从事基因工程方面的研究; E
m ai:l z jh@ xxm u. edu. cn
通讯作者:王天云,男,博士,副教授,硕士生导师,研究方向:基因表达调控与基因工程; E
m ai:l w ty@ xxm u. edu. cn
DNA marker是分子生物学试验必备的试剂之
一,它能准确判断核酸分子量的大小,起到核酸分子
量标志物的作用。此外, 它还能对标志的核酸目的
片段进行定量分析。目前, 绝大多数实验室所用的
DNA m arker依靠公司生产,而本研究拟通过一种简
便的 PCR方法研制 DNA marker, 以期所研制的
DNA m arker条带清晰,分子量大小标准, 完全可用
于实验室标志 DNA的分子量。
1 材料与方法
1. 1 材料
pUC
DNA由实验室构建和保存, 由一段特殊的
DNA片段连接至 pUC18载体构建而成。 PCR试剂
(Taq酶、10 PCR buffer、Mg2 + )等购自上海生物工
程有限公司, PCR引物也由该公司合成。
1. 2 方法
1. 2. 1 引物的设计  试验所用引物如表 1。
1. 2. 2 多重 PCR程序  在一只 PCR管内加入反应
所需要的 10种引物, 通过多重 PCR扩增出 100 -
1 000 bp片段。PCR反应体系 [ 1 - 3] ( 25
L)如下: 模
板 DNA 15- 35 ng, 50 mmo l/L KC,l 10 mmol /L T ris

HC l pH83, 20 mmo l/L M gC l2, 正义引物 75 pmo,l
100- 500 bp的反义引物各 5 pmo,l 600- 1 000 bp的
反义引物各 10 pmo,l 03 mmol /L dNTPs, Taq酶 5
U,并且 Taq酶用热启动法加入到上述反应体系, 最
后加灭菌超纯水至 25
L。
多重 PCR程序采用改进的降落 PCR程序: 95!
3m in, 94! 30 s, 56- 46! 30 s, 72! 1 m in, 每个退
火温度间隔 2! 为 2个循环, 最后 44! 22个循环,
72! 3 m in。
1. 2. 3 电泳、目的片段的回收及测序  所有 PCR
产物均在 2%琼脂糖 ( TAE缓冲液 )凝胶进行检测,
电压 120V电泳 40 m in。用凝胶回收试剂盒回收目
的 PCR产物, 送上海生工公司测序。测序结果与
pUC
DNA上基因序列进行序列比对, 用 BLAST进
行同源性分析。
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 12期
表 1 试验所用引物
长度 ( bp) 引物序列 ( 5∀- 3∀) 位置
1 000 GCGGCACGGAGTGGAGCAAG 6 631
900 GTTCGATCCGAAAGGCTGGGCGCT 6 731
800 AAAGACCTGGGCAAAGCGGTGT 6 831
700 TCCTGCCGCACAACACGATG 6 931
600 ACGCCTCTGCCCGTTACCCGAA 7 031
500 GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTG 7 131
400 CCGCTCGCTGGGTGAACAA 7 231
300 ACGGATGAAACTGCCGGTCAGGACA 7 331
200 TGGATACGTCTGAACTGGTCACGGT 7 431
100 AACGGCGTTTCGTGTCTCTGCCGGT 7 531
0 GTTATCGAAATCAGCCACAGGGC 7 630
1. 2. 4 DNA marker的制备  将 PCR产物用氯仿、
异戊醇抽提, 乙醇沉淀, 浓缩后,溶解于 TE缓冲液
中。加入 6 Loading buffer混合, 即可使用。
2 结果
在同一个反应体系中加入相同数量的 10种引
物对, 采用退火温度从 58! 降落至 48! 30个循环
及退火温度从 58! 降落至 46! 35个循环, 结果显
示, 100- 500 bp的片段利用此方法均能扩增到 (图
1
a,图 1
b)。调整 10种引物的量以及退火温度从
56! 降落至 46! , 大多数目的片段也能检测到 (图
1
c) ,但条带不清晰。最后,增加 600- 700 bp反义
引物的量以及退火温度从 56! 降落至 44! ,所有的
目的片段均能扩增到并且无非特异性条带 (图
1
d)。将 PCR产物进行纯化, 与上海生工的 DNA
marker相比,本方法制备的 DNA marker条带清晰,
大小标准,能满足一般的分子生物学试验要求。
M. Sangon DNA M arker; P.不同条件下的 PCR产物
图 1 调整反应体系及退火温度的电泳结果比对图
3 讨论
随着分子生物学技术的发展, DNA标准参照物
已广泛应用到分子生物学试验中, 良好的 DNA标准
参照物要求制作简便、条带分布均匀等。常规的
DNA标准参照物制作方法往往是酶切质粒及噬菌
体 DNA等 [ 4, 5] , 这种方法存在的不足主要是周期
长, 工作量大, 涉及到细菌 /噬菌体的培养, 基因组
DNA /质粒 DNA的提取、酶切等一系列繁琐的步骤。
其次由于质粒或噬菌体 DNA上酶切位点的分布不
均一,制作的 DNA标准参照物条带分布没有规律,
DNA条带间隙大小不一 [ 6, 7] , 使用起来不方便。如
DNA用 EcoR I酶切制作的 DNA标准参照物包含:
21 226、7 421、5 804、5 643、4 878及 3 530 bp长度的
条带,小于 3 530 bp的 DNA条带无法标志。另外,
如 21 226 bp和 7 421 bp条带间间隙过大,限制了其
在分子生物学试验上的应用 [ 8, 9 ]。
采用 PCR方法扩增和制备 DNA marker可使试
验简便和快捷,但常规 PCR每次一管只能扩增一种
DNA片段,而 DNA marker往往要求由数条 DNA片
段组成, 因此使工艺变得复杂和繁琐 [ 10, 11] , 并且由
于各个 DNA片段之间存在量的差异,在进行调配时
难以掌握,制备的 DNA marker条带之间含量不成比
例, 造成其使用上的不便。本试验用多重 PCR技术
一次扩增 100- 1 000 bp条带, 试验简便,大大简化
了制作工艺。并且制作的 DNA marker条带清晰,易
于识别, 可以与市售的 DNA marker相比,并且试验
成本大大降低,完全可用于分子生物学试验。
参 考 文 献
[ 1] W ang TY, Zhang JH, J ing CQ, et a.l Posit ional effects of th e m atrix
attachm ent region on transgene expression in s tab ly transfected CHO
cells. C ell B iol Int, 2010, 34( 2) : 141
145.
[ 2] 王芳,张俊河,昝玉玺,等. DNA标准分子量参照物的制备.安徽
农业科学, 2009, 37 ( 15) : 6903, 6951.
[ 3] 冉丹霞,王荣荣,郝亚宁,等. 重叠 PCR法合成轮状病毒抗原基
因 VP4.生物技术通报, 2009( 8) : 118
119.
[ 4] 韦柳静,韦宇拓,黄小凤,等. 一种新型可用于 DNA分子量标准
的质粒构建.生物技术, 2004, 14 ( 5) : 33
35.
[ 5] 朱春江,魏清跃,欧维琳,等. 用 DNA阳性及阴性标本制备专用
DNA m arker的实验研究.华夏医学, 2005, 18( 6) : 937
938.
[ 6] H ym an DH. DNA ladders: US, 5 840 575[ P ]. 1998
11
24.
(下转第 200页 )
190
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 12期
[ 8] Lee B I, Chang C, Cho S J, et a.l Lactate dehyd rogenase from the hy

pertherm oph il ic archaeonM ethanococcu s janna sch ii: overexp ress ion,
crystallizat ion and prelim inary X
ray ana lysis. A cta C ryst, 2000, 56:
81
83.
[ 9] T aguch iH, Ohta T. D
lactate dehydrogenase is am em ber of the D

isom er
specific 2
hydroxyacid dehyd rogenase fam ily: clon ing, se

quencing and exp ress ion inE scherich ia col i of the D
lactate dehydro

genase gene of La ctobac illu s plan eta rium. B iol Chem, 1991, 266:
12588
12594.
[ 10 ] Bernard N, Ferain T, Garm yn D, et a.l C loning of the D
lactate
dehyd rogenase gen e from Lactoba cillu s delbrueckii sub sp. burg la ri

cu s by comp lem entation in E sch erichia coli. FEBS Lett, 1991, 290
( 1
2) : 61
64.
[ 11 ] Kochh ar S, H ottingerH, ChuardN, et a.l C lon ing and overexpres

s ion of Lactoba cillu s helveticu s D
lactate dehydrogenase gen e in
E sch erichia coli. Eu r J B iochem, 1992, 208( 3) : 799
805.
[ 12 ] 李剑,唐贇,梁凤来,等. D
乳酸脱氢酶基因克隆及其表达.微生
物学报, 2004, 44( 4) : 491
495.
[ 13 ] 张刚.乳酸细菌
基础、技术和应用 [M ] . 北京: 化学工业出版
社, 2007: 41.
[ 14] 萨姆布鲁克 J,弗里奇 FF,曼尼阿蒂斯 T,著; 金冬雁,译.分子
克隆实验指南 (第 2版 ) [M ].北京:科学出版社, 2002.
[ 15] 李建武.生物化学实验原理和方法 [M ] .北京: 北京大学出版
社, 1997: 351
353.
[ 16] N athalie B, Keyj i J, H olbrook J, et a.l D175 d iscrim inates be

tw een NADH and NADPH in the coenzym e b ind ing site ofLactoba

cil lus de lbrueckii subsp. bu lgaricu s D
Lactate dehyd rogenase. B io

chem ical and B iophysical Research Commun ication, 1995, 208
( 3) : 895
900.
[ 17] 黄彦,韦宇拓,张黎,等.乳酸片球菌 L
乳酸脱氢酶基因的克隆
及在大肠杆菌中的表达.应用与环境生物学报, 2006, 12( 1 ):
68
71.
[ 18] 吴晖,李明阳,刘冬梅,等.鼠李糖乳杆菌发酵生产 L
乳酸培养
基的优化.食品工业科技, 2008, 19( 4) : 81
83.
[ 19] Kwon S, Lee PC, Lee EG. P roduction of lact ic acid by Lactoba cil

lus rhamnosus vitam in supp lem ented soybean hydro lysate. E nzym e
andM icrob Techn o,l 2000, 26 ( 2
4 ): 209
215.
[ 20 ] Kyla
N ikk ilaK, Hu jancnM, LeisolaM, et a.l M etabo lic ng ineering
ofLactobac illu s h elv eticu s CNRZ32 for product ion of pure L
( + )

lactic acid. A pp l EnvironM icrob io,l 2000, 66 ( 9) : 3835
3841.
(上接第 190页 )
[ 7] H ym an DH. M ethod of m ak ing DNA ladd ers: US, 5 939 293 [ P ].
1999
8
17.
[ 8] Hu ALW, H art ley JL, JordanH J. Nucleic acid ladders: US, 6 924 098
[ P]. 2005
8
2.
[ 9] H art ley JL. Nucleic acid m arker ladd er for estim at ing m ass: US,
7 132 520 [ P] . 2006
11
7.
[ 10 ] Daw son EP. M ethod for the m ult ip lexed p reparation of nu cleic acid
m olecu lar w eight m ark ers and resultan t products: US, 5 714 326
[ P] . 1998
2
3.
[ 11 ] 王天云,王俐,杨瑞,等.一种定性定量脱氧核糖核酸标准参照
物的制备方法:中国, 101 003 559[ P] . 2009
3
25.
200