全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 6期
两种阳离子纳米基因载体及植物基因介导效果的研究
宋瑜　李颖　崔海信　李瑶
(中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所 ,北京 100081)
　　摘 　要 : 　以阳离子聚乙烯亚胺 (polyethylenim ine, PE I)和壳聚糖 ( chitosan, CS)作为两种植物基因载体 ,分别制备了载基
因 PE I纳米粒 ( PE I/DNA )和壳聚糖 2DNA纳米粒 (CS/DNA ) ,并对其形态、粒度分布、包封率、DNA结合的稳定性及纳米颗粒
对 DNA的保护等方面进行表征。并以 GFP基因为报告基因进行植物细胞转染 ,比较两者转化效率。结果表明 PE I/DNA纳
米粒稳定性 ,对 DNA的保护以及转染效率等方面均优于壳聚糖 2DNA纳米粒。
关键词 : 　聚乙烯亚胺 　壳聚糖 　纳米粒 　基因载体 　转基因
Study on Cation ic Nanoparticles as Gene Carr iers and the Eff ic iency
for Transferr ing Gene into Plant Cells
Song Yu　L i Ying　Cui Haixin　L i Yao
( CAAS Institu te of Environm ent and Sustainable Developm ent in Agriculture, B eijing 100081)
　　Abs trac t: 　Polyethyleneim ine ( PE I) and chitosan (CS) were used to p repare PE I2DNA ( PE I/DNA ) and CS2DNA (CS/DNA )
comp lexes as gene carriers for DNA delivery1 The characteristics of the comp lexes such as morphology, particle size, association effi2
ciency, stability of DNA binding, and p rotection ability to DNA were investigated1Transfection efficiency mediated by PE I/DNA and
CS/DNA were exam ined with GFP gene as report gene, respectively1 The results showed that PE I/DNA nanoparticles were superior to
chitosan2DNA nanoparticles in stability, p rotection ability of DNA and transfection efficiency A rabidopsis thaliana to p rotop lasts1
Key wo rds: 　Polyethylenim ine　Chitosan　Nanoparticles　Gene vector　Transgene
收稿日期 : 2009203206
基金项目 :国家“863”重大项目 (2006AA10A203) ,国家博士后科学基金项目 (20070420435)
作者简介 :宋瑜 (19822) ,男 ,辽宁丹东人 ,在读硕士研究生 ,主要从事纳米生物技术研究 ; E2mail: rollinsong1982@1631com
通讯作者 :崔海信 ,男 ,吉林人 ,研究员 ,博士 ,研究方向为纳米生物技术 ; E2mail: zhongzhengc@yahoo1com1cn　　在植物转基因研究中 ,裸露 DNA进入细胞需要借助于合适的载体来携载 DNA进入细胞 ,从而进一步实现有效表达 ,所以基因载体是关键因素。探索和发展外源基因输送载体与转化方法是现代植物基因工程中的重要内容 ,对于促进分子生物学、分子遗传学等基础生物学的发展也具有重要的意义。聚乙烯亚胺 ( polyethylenim ine, PE I)是一种人工合成的有机高分子物质 ,因携带高密度正电荷而具有很强的结合与浓缩 DNA的能力 [ 1 ] ,可以作为非病毒基因载体与 DNA结合形成纳米级的 PE I/DNA基因载体复合物 [ 2, 3 ] ,有利于细胞通过内吞作用高效吸收 ,从而携带外源基因进入细胞 [ 4 ]。并且 PE I能够发挥“质子海绵 ”作用 [ 5 ] ,从而较大程度地提高细胞的转化效率。作为运载外源基因载体 , PE I在 基因治疗和动物细胞转染方面具有良好的介导效果 ,其转染效率可以提高 10～30倍 [ 6 ] ,但是 PE I基因载体在植物基因转化中的应用研究尚未见文献报道。壳聚糖是一种从甲壳类动物提取制备而成的一种生物可降解性多糖 [ 7 ] ,是天然存在的甲壳素的脱乙酰产物 , 为不多见的无生物学毒性碱性的多糖 [ 8, 9 ] ,具有良好的生物相容性和生物可降解性 ;因其分子中的葡糖胺基荷正电 ,与荷负电的 DNA可产生静电作用凝聚为多聚复合物 ,使 DNA成结构相对致密的纳米级粒 [ 10 ]。在动物细胞转染试验中 ,该粒子可以与荷负电的细胞膜相互作用 ,从而提高细胞转染效率 [ 11 ] ,但在植物转基因实验中尚未见报道。本研究以 PE I和壳聚糖为载体材料 ,分别采用
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
自凝聚和复凝聚法制备了载基因 PE I纳米粒 ( PE I/
DNA )和壳聚糖 2DNA纳米粒 (CS/DNA ) ,并对其粒
度分布、包封率、复合物中 DNA的稳定行对 DNA的
保护进行测定和比较 ;并以绿色荧光蛋白基因为报
告基因 ,对拟南芥原生质体细胞进行转化实验 ,比较
其转化效率 ,从而为开发和构建一种新型、高效的植
物基因工程载体和外源基因转化方法奠定基础。
1　材料
111　试剂
PE I为分枝状 ,分子量 25 kD,购自 A ldrich2Sigma
公司 ; 3种壳聚糖分别是高分子量型、中等分子量型
及低分子量型 ,脱乙酰度分别为 9116%、9215%和
8711% ,购自山东奥康生物科技有限公司 ;纤维素酶
为日本产 Cellulase Onzuka R210;离析酶为日本产 Ma2
cerozyme R210;限制性内切酶 EcoRⅠ购自 TaKaRa公
司 ; DNase购自北京盛旭百川生物技术公司 ;质粒大
量提取纯化试剂盒购自北京威格拉斯生物技术公司 ,
其余试剂均为分析纯。
112　植物材料
哥伦比亚野生型拟南芥 (A rabidopsis tha liana,
Columbia ecotype)种子由北京生命科学研究所惠
赠。种子经在 MS培养基上育苗后 ,移栽至培养基
质 (蛭石 ∶草炭 = 1∶1 )中生长 ,于温度 22℃,湿度
65% ～75% ,光照强度 30 000 lx,短日照条件下
培养。
2　方法
211　质粒 pGFP的扩增与纯化
含有绿色荧光蛋白基因的植物表达质粒
pCM12052GFPn (北京生命科学研究所惠赠 )在大肠
杆菌 DH5α菌株中大量扩增 ,用质粒大量提取纯化
试剂盒制备质粒 ,电泳鉴定 ,紫外分光度计测定质粒
的纯度和浓度 ,要求 OD260 /OD280≈ 118,制成 2μg/
μl的水溶液 , - 20℃保存备用。
212　PE I/DNA纳米粒与 CS/DNA纳米粒的制备
21211　自凝聚法制备 PE I/DNA纳米粒 　在 pH值
710条件下 , PE I与质粒 DNA按不同质量比混合于
50μl体系中 ,通过超声波充分混匀 ,室温静置 30
m in,制备得到 PE I/DNA纳米粒。
21212　复凝聚法制备 CS/DNA纳米粒 　壳聚糖用
1%醋酸溶解 ,滴加氨水使其沉淀 ,沉淀用去离子水
洗涤至中性 ,冷冻干燥得到纯化的壳聚糖。纯化的
壳聚糖溶解于 1%醋酸溶液中 ,用 010 l mol/L NaOH
调 pH至 515,稀释溶液使壳聚糖浓度为 0102% (w /
v) ,用 0122μm滤膜过滤除菌。质粒 DNA溶解于
30 mmol/L Na2 SO4 溶液中 ,浓度分别为 50、100、200
μg/m l。壳聚糖和 3种不同浓度的质粒溶液均预热
至 50～55℃,分别取等体积迅速混匀 ,涡旋 30 s,室
温静置 30 m in,制备得到 CS/DNA纳米粒。
213　PE I/DNA纳米粒与 CS/DNA纳米粒的形态和
粒径分布
分别吸取少量 PE I/DNA纳米粒与 3种不同分
子量的壳聚糖制备的 CS/DNA 纳米粒混悬液滴至
铺有碳膜的铜网上 ,静置 2 m in,用滤纸吸干混悬液 ,
再滴加 2 %磷钨酸负染 2 m in,于 PH IL IPS2FE ITEC2
NA I20透射电子显微镜下观察纳米粒形态 ,并分别
选取有代表性的视野进行拍照 ,进行形态测观察。
214　PE I、CS与质粒结合、稳定性及保护性检测
按表 1取 PE I与 DNA按不同质量比例 (5∶1, 4
∶1, 3∶1, 2∶1, 1∶1, 1∶2, 1∶3, 1∶4, 1∶5)连接的 PE I/
DNA纳米颗粒进行琼脂糖凝胶电泳阻滞试验 ,用凝
胶成像仪观察。并将制备好的 PE I/DNA纳米颗粒
放置 24 h后电泳分析 PE I/DNA复合物的稳定性。
按表 2取不同分子量的壳聚糖分别和不同浓度
的质粒结合 ,形成的 CS/DNA纳米粒进行琼脂糖凝
胶电泳阻滞试验 ,用凝胶成像仪观察。制备的 CS/
DNA纳米颗粒放置 24 h和 48 h后电泳分析 CS/
DNA纳米颗粒的稳定性。用限制性内切酶 EcoR I
和 DNase I于 37℃下分别对 PE I/DNA 纳米颗粒和
CS/DNA纳米颗粒进行消化 (设置阳性和阴性对
照 ) ,经电泳检测纳米载体对质粒 DNA 的保护
情况。
215　包封率测定
分别取不同连接梯度的 PE I/DNA 和 CS/DNA
纳米粒悬液于高速冷冻离心机上 ( 4℃, 10 000 r/
m in, 1 h)离心分离 ,用分光光度计 (尤尼柯 2800紫
外分光光度计 )测上清液中质粒 DNA含量 ,并按下
式计算 :包封率 ( % ) = (W总 2W游 ) /W总 ×100% (W总
为质粒 DNA的加入总量 , W游 为上清液中 DNA的测
得量 ) [ 12 ]。
216　拟南芥原生质体的制备
67
2009年第 6期 宋瑜等 :两种阳离子纳米基因载体及植物基因介导效果的研究
选取生长 3～4周、未开花拟南芥植株叶片 ,切
成 015～1 mm的长条 ,置于 5 m l含 115%纤维素酶、
013%离析酶的酶液中 , 23℃下酶解 2～3 h,然后用
200目的尼龙网过滤去除叶片碎片 ,滤液经 100 g离
心 1 m in并用预冷的 W 5溶液洗涤 2次 ,收集纯化的
原生质体。将制备好的原生质体浓度调整为 ( 1～
2) ×105 个 /m l,冰上放置 30 m in后备用 [ 13, 14 ]。
217　PE I/DNA纳米粒与 CS/DNA纳米粒细胞转化
试验
经预实验选取质量比为 1∶1的 PE I/DNA和质
量比为 1∶1的低分子量 CS/DNA复合物。分别吸取
200μl拟南芥原生质体细胞分别与与 PE I/DNA和
CS/DNA复合物充分混匀 ,室温转化 5～10 m in,然
后经 W 5溶液洗涤 2次 ,加入 MS培养液 ,在弱光下
培养过夜 ,以常用的 PEG介导的原生质体转化作为
阳性对照 ,并设置加入相应计量的裸质粒 DNA处理
为阴性对照 ,在 Leica TCS SP 2激光共聚焦显微镜
下观察绿色荧光蛋白的表达情况。
3　结果与分析
311　纳米基因载体 PE I和 CS与质粒 DNA的结合
及其复合物的形态观察
31111　纳米基因载体与质粒 DNA的结合 　PE I、CS
与 DNA结合形成复合物后颗粒尺寸比原来 DNA的
分子尺寸变大 ,在琼脂糖凝胶电泳中阻滞了 DNA的
迁移 ,使复合物滞留在点样孔中 ,而未与纳米材料结
合的 DNA可以从点样孔中迁移出形成条带。因此 ,
可以通过这种方法鉴定 DNA是否与 PE I结合及结
合程度。图 1表明 ,不同质量比条件下 PE I与 DNA
的结合程度不同。1～8孔中质粒 DNA均未出孔 ,
表明在 PE I与 DNA质量比分别为 5∶1, 4∶1, 3∶1, 2∶
1, 1∶1, 1∶2, 1∶3, 1∶4时 PE I可与质粒 DNA稳定结
合 ;其中 1～6孔样品 PE I与质粒 DNA完全结合 ,阻
止了溴乙锭插入 DNA双螺旋结构中 ,故观察不到荧
光 ; 7、8孔中有微弱的荧光 ,泳道中无 DNA条带 ,表
明 PE I与质粒 DNA稳定结合 ,但未将质粒 DNA完
全包裹 ; 9孔中有较强的荧光 ,并且泳道中有 DNA
迁移出。
由壳聚糖与质粒 DNA结合的琼脂糖凝胶电泳
图 (图 2)可以看出 , 1～6孔中 (质粒 DNA均滞留在
孔中 ,且 1～3孔和 4～6孔分成两组随着 DNA量的
增多亮度也明显递增 ,表明高分子量 CS和中等分
子量 CS与不同浓度质粒 DNA均能稳定结合 ; 7～9
孔显示低分子量型 CS只与 DNA浓度为 50μg/m l,
100μg /m l可以稳定结合 ,质粒浓度增加到 200μg/
m l时有部分质粒跑出。
1～91PE I与 DNA的质量比分别为 5∶1, 4∶1, 3∶1, 2∶1, 1∶1, 1∶2, 1∶3,
1∶4, 1∶5; 101纯质粒 DNA (对照 )
图 1　PE I/D NA纳米粒的凝胶阻滞分析
01纯质粒 ; 1～31高分子量 CS与 DNA质量比 2∶1, 1∶1, 1∶2; 4～61
中分子量 CS与 DNA质量比 2∶1, 1∶1, 1∶2; 7～91低分子量 CS与
DNA质量比 2∶1, 1∶1, 1∶2
图 2　CS /D NA纳米粒的凝胶阻滞分析图
PE I、壳聚糖和磁性纳米颗粒均可以与质粒
DNA稳定结合 ,具有结合与浓缩 DNA的作用。其
中 PE I与质粒 DNA的结合能力最强 ,壳聚糖稍差。
表 1　PE I/D NA纳米粒的各组成使用量
质量比 ( PE I/DNA) 5∶1 4∶1 3∶1 2∶1 1∶1 1∶2 1∶3 1∶4 1∶5
DNA (μg) 1 1 1 1 1 2 3 4 5
PE I(μg) 5 4 3 2 1 1 1 1 1
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表 2　不同分子量 CS /D NA纳米粒的各组成使用量
质量比 (CS/DNA) 高分子量 CS 中分子量 CS 低分子量 CS
(纳米级 )
2∶1 1∶1 1∶2 2∶1 1∶1 1∶2 2∶1 1∶1 1∶2
DNA (μg) 1 1 2 1 1 2 1 1 2
CS(μg) 2 1 1 2 1 1 2 1 1
31112　PE I/DNA纳米粒和 CS/DNA纳米粒的形态
分析 　在透射电子显微镜下观察 PE I/DNA复合物
为规则的球形 ,直径在 100～200 nm之间 (图 3)。3
种不同分子量型的壳聚糖与 3种 DNA浓度 50、100、
200μg/m l结合程度形成纳米颗粒 ,在透射电子显
微镜下观察 CS/DNA复合物近似球形 ,直径在 100
～500 nm之间 (图 4)。
图 3　PE I/D NA纳米粒透射图
图 4　CS /D NA纳米粒透射图
312　PE I/DNA纳米粒与 CS/DNA纳米粒的稳定性
为检测纳米基因载体复合物的稳定性 ,将 PE I/
DNA纳米粒和 CS/DNA纳米粒放置 24 h后进行凝
胶阻滞分析。从图 5可以看出 , 24 h后 PE I与质粒
DNA稳定结合 , DNA并未从 PE I/DNA复合物中解
离出。图 6可以看出 24 h后不同 CS与质粒 DNA
的结合情况不同。高分子量 CS和水溶性 CS能与
DNA稳定结合 ,而低分子量 CS与 DNA在 2∶1下能
稳定结合 ,在 1 ∶1 和 1 ∶2 下不稳定有部分 DNA
跑出。
11纯质粒 ; 21PE I; 3～111PE I与 DNA质量比 5∶1, 4∶1, 3∶1, 2∶1, 1∶1,
1∶2, 1∶3, 1∶4, 1∶5
图 5　PE I/D NA纳米粒放置 24 h电泳图
01纯质粒 ; 1～31高分子量 CS与 DNA质量比 2∶1, 1∶1, 1∶2; 4～61
中分子量 CS与 DNA质量比 2∶1, 1∶1, 1∶2; 7～91低分子量 CS与
DNA质量比 2∶1, 1∶1, 1∶2
图 6　CS /D NA纳米粒放置 24 h电泳图
由于 PE I与 DNA结合的比较紧密孔中不发亮 ,
而 CS与 DNA 结合则疏松孔中发亮 ,为防止 PE I/
DNA纳米粒在酶切前后都不发亮而无法区分 ,所以
在酶切保护实验中选择不同的酶来进行酶切。由图
7所示 ,经限制性内切酶 EcoR I消化后所有孔中没
有看到线性质粒条带跑出 ,即没有与 PE I结合的质
粒 DNA经酶消化后迁移出一条线性质粒条带 (线
性质粒比超螺旋质粒迁移速度慢 , 1泳道 ) ,表明
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2009年第 6期 宋瑜等 :两种阳离子纳米基因载体及植物基因介导效果的研究
PE I对 DNA具有一定程度的保护作用。图 8可以
看出 , CS相对分子质量高的 1～3号点样孔中仍发
亮对 DNA有很好的保护 ,而 4～9孔中 4、5、7孔比
较亮 ,而 6、9孔则较弱说明结合的 DNA被部分酶解
消化 ,表明低分子质量 CS (纳米级 )保护 DNA的能
力相对较弱。说明质粒 DNA与纳米基因载体结合
后 ,纳米基因载体对其有一定的保护作用 ,使其免受
酶的降解。
11酶切的质粒 ; 21纯质粒 ; 3～111PE I与 DNA的质量比分别为 5∶1,
4∶1, 3∶1, 2∶1, 1∶1, 1∶2, 1∶3, 1∶4, 1∶5
图 7　PE I/D NA纳米粒酶切电泳图
01纯质粒 ; 1～31高分子量 CS与 DNA质量比 2∶1, 1∶1, 1∶2; 4～61
中分子量 CS与 DNA质量比 2∶1, 1∶1, 1∶2; 7～91低分子量 CS与
DNA质量比 2∶1, 1∶1, 1∶2
图 8　CS /D NA纳米粒酶切电泳图
313　PE I/DNA与 CS/DNA复合物对拟南芥原生质
体转化效率的比较
选取质量比为 1∶1的 PE I/DNA和质量比为 1∶1
的低分子量 CS/DNA两种纳米粒 (经预实验确定 )
转化拟南芥原生质体细胞 ,过夜培养后置于激光共
聚焦显微镜下观察 ,可见两组纳米粒转化组均有不
同程度的表达 ,但转化效率差别很大。 PE I/DNA转
化的效率较高 ,能达到 60% ～70% (图 11) ,高于阳
性对照 PEG介导的转化效率 20% ～30% (图 11) ,
且细胞状态良好 (图 9) ;而 CS/DNA纳米粒转化效
率很低 ,仅约 1% ,远低于 PE I/DNA纳米粒和 PEG
的转化 ,而且 CS对原生质体细胞的伤害程度也很
大 ,多数细胞变形或破裂 (图 10)。
图 9　PE I∶D NA = 1时 PE I/D NA复合物在拟南芥原生
质体中转化的荧光照片
图 10　纳米级 CS∶D NA = 1时 CS /D NA复合物在拟南芥
原生质体中转化的荧光照片
图 11　PE I、PEG和壳聚糖转化效率比较
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
4　讨论
PE I和 CS都是具有高密度正电荷 ,能通过静电
作用结合带负电的 DNA从而作为一种的非病毒基
因载体。本研究正是利用这样的特点分别采用自凝
聚法和复凝聚法来制备两种纳米颗粒。由于 PE I富
含氨基而不受 pH值的影响携带大量的正电荷 [ 15 ] ,
所以可以很容易的通过自凝聚法与带负电的 DNA
连接 ,形成稳定的纳米颗粒。复凝聚法制备的 CS
具有双电层结构 ,具有 Zeta点位 ,溶液的 pH值能直
接影响其表面的正电荷 ,在酸性条件下能增加 CS
表面的正电荷 ,从而增加电荷的间的排斥力。当排
斥力大于表面张力时 ,系统就会趋于稳定而减少聚
集 [ 16 ] ,所以 CS和 DNA的连接稳定性与 pH和影响
表面电荷的钠盐有关 ,影响因素较多。因此 , PE I/
DNA的连接效率及稳定性均优于 CS/DNA纳米粒。
酶切保护试验中 ,由于 PE I和 DNA结合的比较
紧密所以点样孔中观察不到荧光 ,而 CS和 DNA结
合则疏松孔中发亮 ,从电泳图中可以发现 PE I对
DNA的保护效果很好 ,而 CS对 DNA的保护却呈梯
度性 ,即 DNA∶CS的比例越高 , CS对 DNA的保护效
果越低 ,可能是由于 DNA的含量增多使 CS表面的
电荷急剧减少从而影响了其同 DNA结合稳定性 ,易
被酶消化。
转化试验结果证实 ,这两种纳米基因载体能够
将含绿色荧光蛋白 ( GFP)报告基因的植物表达载体
递送到细胞内部 ,并获得表达。研究表明 ,一定质量
比的 PE I与 DNA结合形成的纳米颗粒连接的比较
紧实 ,形成的纳米粒粒径小 ,其表面携带的正电荷显
著减少 ,从而有利于与细胞融合 ,降低载体对细胞的
毒性 ,加之 PE I可以有效的保护 DNA使其免受酶的
消化降解容易被植物原生质体细胞内吞 ,从而提高
了外源基因的转化效率 ; CS与 DNA连接的比较松
散 ,加之 CS本身的分子量相对较高所形成的纳米
粒粒径大 ,因此它对细胞的伤害大 ,转化效率低。综
合已有文献报道 [ 17 ] , CS具有转化植物细胞的能力 ,
但转化效率受到其分子量和脱乙酰度的共同影响 ,
低相对分子量 /脱乙酰度在一定的 pH值下对细胞
的转化效率越高 ,高相对分子量 /脱乙酰度对细胞的
破坏较大而降低转化效率 ,如何对壳聚糖进行修饰
从而降低生物毒性提高转染效率 ,这些方面的研究
本研究组还在进行中。总之 ,比较而言 PE I有望成
为新型植物基因工程的介导物质 ,为探索植物基因
基因工程新载体和新方法奠定了基础。
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