全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 9期
香蕉MuNPR11基因的克隆与表达分析
李康 1 李胜军1 于洋1 董轶博 1 温瑞明 2 陈世凯 2 叶尚 2 裴新梧 1
( 1中国农业科学院生物技术研究所,北京 100081; 2广东省信宜市农业科学研究所,信宜 523530)
摘 要: 利用同源序列法克隆了中山大蕉中的 MuNPR11和 M ePR1基因, RTPCR分析了 MuNPR11和 M ePR1基因
对香蕉枯萎病 4号小种的应答反应, 结果表明抗病的中山大蕉幼苗叶片经香蕉枯萎病 4号小种接菌诱导后, M uNPR11基因
的表达水平在诱导后 12 h达到最高, 高表达持续到 24 h,在 72 h降到接近起始状态, 病原相关蛋白 M ePR1基因的表达在 24 h
达到最高, 48 h开始下降, 72 h又恢复到起始水平。而感病的粉蕉中 M uNPR11在 0、12和 24 h无明显变化 ,在 48- 72 h表达
增加, 病原相关蛋白 M ePR1基因的表达在 0、12和 24 h无明显变化, 在 48- 72 h有增加 ,但表达强度低于中山大蕉。这表明
了抗病的中山大蕉的 MuNPR11基因对病原菌信号分子的反应比感病品种粉蕉敏感, 有助于激活下游防卫基因的表达。
关键词: 香蕉 枯萎病 M uNPR11基因 M ePR1基因
Cloning and Analysis of SAR Related GeneMuNPR11 in Banana
L iKang
1
L i Sheng jun
1
Yu Yang
1
Dong Y ibo
1
W en Rumi ing
2
Chen Sh ikai
2
Ye Shang
2
PeiX inwu
1
(
1
B io technology Research Institute, Chinese A cademy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;
2
X iny i Institute of Agricultural Science and T echnology, X inyi 523530)
Abstrac:t W e cloned the fulllength cDNA o fM uNPR11 andM ePR1 gene using hom o logous clon ing and RACE techn iques from
Zhongshanda jiao. RTPCR is used to ana lyze the expression changes o fM uNPR11 andM ePR1 in Zhongshandajiao and Fen jiao after
FOC 4 trea tm en t. The resu lts show ed tha tM uNPR11 express ion level reach the h ighest po int in 12 h andM ePR1 in 24 h afte rFOC 4
treatmen,t w hile a fter FOC 4 treatment fo r 72 h, the expression leve l is just as nontrea ted. H owever, the MuNPR11 andM ePR1 from
susceptib leFen jiao have no d istinct changes until 48 h a fter treatm ent, and the h ighest leve l last to 72 h. It indicated that theM uNPR1
1 of resistantZhongshandajiao show mo re sensitiv e to pa thogen s igna l m o lecules than tha t of susceptib leFenjiao. Th is sensitiv ity to
pathogen m ight be favorab le to express downstream plant defense genes.
收稿日期: 20100517
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30871569)
作者简介:李康,男,硕士研究生,研究方向:植物基因工程; Em ai:l caas lk@ yahoo cn
通讯作者:裴新梧,研究员,从事植物基因工程研究; Ema i:l peixw@ ma il caasnet cn
Key words: Musa spp. Fusar ium oxy sp orum ( FOC) M uNPR11 gene M ePR1 gene
系统获得抗性 ( SAR)是指植物受到病原菌攻击
后,诱导植物产生的系统获得性抗性,即通过植物的
超敏反应导致侵染部位周围的细胞死亡, 激活一系
列下游防卫基因的表达, 提高植物的防卫反应强度
或加快防卫反应速度, 从而使未侵染部位和整株具
有广谱抗病能力。
NPR1( nonexpresso r of pathogenesisrelated genes
1)是 SAR中的一个中心元件, 其功能定位在 SAR
信号转导反应中的水杨酸 ( SA )积累和随后的 SAR
基因表达之间。NPR1最初是从拟南芥中发现
的 [ 1] ,此基因突变后不能表达 PR蛋白, 当用 SA或
INA处理后, 野生型抗病原菌 P seudomonas syringae,
而突变体表现感病。拟南芥 NPR1基因位于 1号染
色体,含有 4个外显子和 3个内含子,其启动子区有
一个 W box序列,可与 WRKY因子结合,从而调控
NPR1基因的转录, 编码一个 66 kD的蛋白。NPR1
蛋白在 C末端含有一个核定位信号 ( nuclear locali
zat ion signa,l NLS ), N末端含有 BTB /POZ结构域
( broadcomp lex, tram track, bricabrac /poxv irus, zinc
finger doma in ), 中间区域 含锚蛋白重复 序列
( ankyr in repeats domain, ANK )
[ 2]。病程相关蛋白
( pathogenesisrelated proteins)即 PR蛋白是植物受
2010年第 9期 李康等:香蕉 M uNPR11基因的克隆与表达分析
到生物侵袭和非生物胁迫时,诱导表达的具有直接
防御功能的一系列蛋白。在 SAR中, PR1蛋白可
以被 SA依赖性防御反应诱导产生, PR1基因被认
为是植物系统获得抗病性 ( SAR)的标志基因。
本研究选用抗逆性强的中山大蕉,利用同源序
列的方法克隆系统获得抗性途径中的主要抗病信号
元件 MuNPR11和病原相关蛋白 M ePR1,旨在分析
在抗病的中山大蕉和感病的粉蕉中 MuNPR11和
M ePR1基因对香蕉枯萎病 4号小种的应答反应,以
期揭示中山大蕉可能抗病的分子机理, 为植物抗病
基因工程提供新的基因资源。
1 材料与方法
11 植物材料
选用抗逆性强, 尤其高抗香蕉枯萎病的中山大
蕉 ( ABB) ,感病的粉蕉 ( AAB ) , 由广东省农业科学
院果树研究所国家香蕉资源圃和广东省信宜市农业
科学研究所提供。
12 基因克隆
在香蕉试管苗 5- 6叶期, 用浓度为 1 mo l/L的
SA涂抹叶片, 24 h后采集叶片, 利用改良的 CTAB
法,提取 RNA [ 3]。
根据已知 NPR1基因的保守区设计简并引物,
用于中间片段的克隆。primerF1: 5 AGGCAC ( T ) TT
( G) GAC (T ) TCNGATA ( G ) TT( A) GA3 ; primerR1:
5 TCC (T ) C ( T ) TC ( A, T ) CG ( T ) CATA ( C ) GCAG
CAAT (T ) G ( A ) TGAAG3 。通过 TouchDown PCR
扩增基因片段, PCR反应程序: 94! 5 m in; 94! 30
s, 54! 30 s, 72! 1 m in, 2个循环; 94! 30 s, 52!
30 s, 72! 1 m in, 2个循环; 94 ! 30 s, 50! 30 s,
72! 1m in, 2个循环; 94! 30 s, 48! 30 s, 72! 1
m in, 2个循环; 94! 30 s, 46! 30 s, 72! 1 m in, 28
个循环; 72! 5 m in。 PCR 产物克隆到 pMD18T
V ecto r, 挑取阳性克隆并测序,获得中间片段。
根据获得的中间片段设计引物, 进行全长 cD
NA 的 克隆。 5 RACE 特异 引物 primerR2: 5
GACTCCAGACTCATTCAAGAGCAACT3 ; 3 RACE
特异引物 prim erF2: 5 GGGTCAGCCAATGTGAACT
TGAAGA3 。
利用 RACE技术获得 MuNPR11基因的 cDNA
5 末端和 3 末端。 RACE 得到的产物连接到
pMD18T V ector上, 筛选鉴定阳性克隆, 并进行序列
测定。用 DNAMAN软件分析组装 5 和 3 序列以获
得 GbNPR1全长 cDNA。
13 序列分析
在 GenBank中用 B last X进行同源性比较, 用
DNAMAN 40和 Mega 3进行分子系统进化树和保
守结构域分析。
14 MuNPR11基因对香蕉枯萎病 4号小种的应
答反应
香蕉枯萎病 4号小种的培养:病原菌在 PDA平
板培养基上于 28! , 暗培养 7 d后, 用无菌水配成
5 ∀105 /mL的孢子悬浮液以备用。香蕉接种枯萎病
4号小种: 孢子悬浮液处理香蕉苗, 选取 7- 8叶期
的中山大蕉和粉蕉香蕉苗, 采用盆栽伤根淋菌法
接种香蕉枯萎病菌, 每株浇 50 mL菌液浓度 5 ∀
10
5
/mL的孢子悬浮液, 以伤根清水处理为对照, 置
于温度为 28 - 32! , 光照 14 h, 黑暗 10 h下
培养 [ 3 ]。
MuNPR11基因表达检测引物: M uNPR11F: 5
GGAGCCTCGTCTTCCATAA3 , M uNPR11R: 5 GA
CAGAAGATGCGTACAAGA3 , RTPCR 产物 大小
529 bp。MePR1基因表达检测引物: PR1 F: 5 CT
GCACCAGTACCCTAGCC3 ; PR1 R: 5 GTTTGTAGT
TGCAGGTGATG3 , RTPCR产物大小 400 bp。
2 结果与分析
21 MuNPR11基因的克隆与序列结构分析
根据已知 NPR1基因的保守区设计简并引物,
获得中山大蕉 NPR1基因的中间片段 208 bp[ 4] , 根
据 NPR1基因的中间序列片段, 设计 5 RACE和 3
RACE特异性引物,利用 Inv itrogen公司生产的 Gen
eRacer试剂,获得中山大蕉 NPR11基因 cDNA全长
为 2 189 bp, 5 非翻译区为 234 bp, 阅读框为 1 725
bp, 终止密码子为 TGA, 3 非翻译区为 212 bp, 推定
的编码蛋白为 574个氨基酸,分子量大小为 64 kD。
DNA全长 4 349 bp,有 4个外显子, 3个内含子。第
1个外显子 516 bp,第 2个外显子 748 bp,第 3个外
显子 195 bp, 第 4个外显子 266 bp; 第 1个内含子
1 444 bp,第 2个内含子 1 048 bp,第 3个内含子 132
bp, 且内含子的 5 端和 3 端符合 GTAG法则。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
MUNPR11, EU747883. 香蕉; OSNPR11, NM _189701. 水稻; LeNPR1, AY640378. 番茄; N tNPR1, AF480488. 烟草; atPNR1,
AF088183.拟南芥; BnNPR1, DQ359129.油菜; B jNPR1, AY667498.芥菜; ZmNPR1, AX041006.玉米; M uNPR11A, DQ925843. 香
蕉; MuNPR11B, EF137717.香蕉; BvNPR1, AY640381. 甜菜; H vNPR1, AM 050559. 大麦; PtNPR1, DQ481233. 杨树; M pNPR1,
EU624132.苹果; C aNPR1, ABG38308. 辣椒;下同
图 1 M uNPR11基因推定的氨基酸序列与已知 NPR1氨基酸序列的同源性比较
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2010年第 9期 李康等:香蕉 M uNPR11基因的克隆与表达分析
通过在 NCB I中进行 rpsBLAST ( reverse posit ion
specific BLAST )发现, 在 MuNPR11蛋白中含有
BTB /POZ(第 52- 179位氨基酸 )、3个串联的锚蛋
白重复序列 ( 254- 282位氨基酸; 283- 313位氨基
酸; 317- 346位氨基酸 )和核定位信号 ( NLS, 522-
539位氨基酸 ), 由此可以断定,得到的基因是 NPR1
基因在香蕉中的一个同源基因, 命名为 MuNPR11
( GenBank: EU747883)。
22 MuNPR11的序列分析
利用 DNAMAN和 Mega 3软件进行分析图 1,图
2可知,在本研究中克隆的 MuNPR11基因推定的
氨基酸与已知的玉米、苹果、杨树的进化关系较近,
与玉米的氨基酸相似性为 68% ,与苹果氨基酸相似
性为 60%,而与已克隆的两条香蕉 NPR1基因进化
关系较远,氨基酸相似性小于 46% , M uNPR11基因
是一个香蕉中新的系统获得抗病性基因。
图 2 M uNPR11基因推定的氨基酸序列与已知 NPR1的 N J进化树
23 对香蕉枯萎病 4号小种的应答反应
中山大蕉的 MuNPR11基因是我们克隆的系
统获得抗病性的重要基因 ( GenB ank, EU 747883) ,
前期研究结果显示, 经水杨酸处理的中山大蕉苗
叶片, M uNPR11的表达水平发生较明显的变化,
RTPCR结果显示, 在 24 h达到最高, 48 h开始下
降, 72 h又恢复到起始水平 [ 4]。本研究中, 我们对
中山大蕉和粉蕉进行香蕉枯萎病 4号小种诱导,
RTPCR结果 (图 3A )显示, 中山大蕉的 MuNPR1
1在病原菌诱导后 12 h表达水平达到最高, 24 h
开始下降, 72 h又恢复到起始水平, 而同期的粉蕉
在 0、12、24 h均无明显的变化, 在 48- 72 h的表
达量有所提高。这表明了抗病的中山大蕉的 Mu
NPR11基因对病原菌信号分子的反应较感病的
粉蕉敏感。
在本研究中, 我们克隆了中山大蕉中的系统获
得抗 病性 的 标 志 性基 因 MePR1 ( G enB ank:
GU 591492) ,利用 RTPCR的方法,检测了中山大蕉
和粉蕉经病原菌诱导后 PR1的表达变化。结果显
示,在病原菌诱导后, 中山大蕉的 PR1基因的表达
在 24 h达到最高, 48 h开始下降, 72 h又恢复到起
始水平,而粉蕉中的 PR1基因的表达在 0、12、24 h
无明显变化,在 48- 72 h有增加 (图 3B )。 PR1基
因的表达高峰时间较 MuNPR11基因推迟。这也表
明抗病的中山大蕉中的 MuNPR11基因对病原菌
的应答反应时间早于感病的粉蕉, 表达强于感病
的粉蕉, 有助于激活下游防卫基因 MePR1的表
达,从而产生系统获得抗性。可以推断中山大蕉
抗病性强的可能原因是对病原菌等信号分子的反
应更加敏感。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
图 3 中山大蕉 ( A )和粉蕉 ( B )叶片中 M uN
PR11和M ePR1基因在 FOC4处理后的表达变
化, 对照为 A ctin1
3 讨论
NPR1基因是调控植物抗病反应的一个关键基
因,它不仅对植物 SAR和 ISR起核心调控作用, 而
且是植物基础抗性以及由抗病基因决定的抗性反应
网络的重要调控因子。利用同源序列法克隆了中山
大蕉中的 NPR1基因和病原相关蛋白基因 MePR1。
利用 RTPCR研究了抗病的中山大蕉和感病的粉蕉
中的 MuNPR1基因和病原相关蛋白基因 MePR1的
对香蕉枯萎病 4号小种的应答反应。结果表明,抗
病的中山大蕉中的 MuNPR11基因对病原菌的应答
反应时间早于感病的粉蕉, 表达强度高于感病的粉
蕉,这将有助于激活下游防卫基因 MePR1的表达,
从而产生系统获得抗性。
在对香蕉 NPR1的研究中, 发现了 4个 NPR1
相似序列, 其中的 2条是南非学者 Endah[ 5] 克隆
( GenBank: DQ 925843, EF137717), 这两段序列均克
隆自栽培香蕉 Cavend ish(AAA ),对其中的一个 MN
PR1A基因的研究表明, FOC处理后, 抗病香蕉中
MNPR1A基因和 PR1表达量在 12 h达到最高,这
与我们克隆的中山大蕉的 MuNPR11基因的表达时
间一致,而不抗病的粉蕉中的表达明显滞后于在抗
病的中山大蕉中的表达。
本研究中克隆的中山大蕉中的病原相关蛋白
M ePR1基因,病原菌诱导后在抗病的中山大蕉中显
著提高, 24- 48 h表达最高, 而在感病的粉蕉中表
达量变化较小。南非学者的研究结果表明 PR1在
SA处理后 24 h达到最高, 抗病香蕉中的表达量是
不抗病香蕉的 5倍。这与我们的研究结果一致, 即
PR1基因的表达量在抗病香蕉中不仅时间早,而且
表达强度高。最近, W endy等 [ 6]报道了一项非常有
意义的研究, 将烟草病原相关蛋白基因 PR1a转入
拟南芥突变体,结果表明拟南芥恢复了原有的对香
蕉枯萎病的抗病性,这也暗示是否在抗病的中山大
蕉中存在抗枯萎病 4号小种的病程相关蛋白基因;
是否中山大蕉中的 M ePR1基因可以应用于香蕉抗
病性改良。
自 1994年克隆了拟南芥中的 NPR1基因以来,
相继克隆了多种作物中的 NPR1基因, 包括小麦、玉
米、棉花、烟草、大豆、葡萄、水稻、番木瓜、香蕉。已
将拟南芥的 NPR1基因转入水稻 [ 7]、番茄 [ 8]、小
麦 [ 9]、烟草 [ 10]、胡萝卜 [ 11 ]和棉花 [ 12]等, 结果表明转
A tNPR1基因的水稻可明显提高对白叶枯病的抗
性, 转 A tNPR1基因的番茄对真菌和细菌具有广谱
抗性,转 A tNPR1基因的小麦对镰刀菌赤霉病抗性
显著,转 A tNPR1基因的棉花对枯萎病、黄萎病抗病
性和线虫增加抗性, 转 A tNPR1基因的胡萝卜对真
菌病害抗性显著。海岛棉的 GbNPR1基因转入烟
草, 离体叶片接种试验表明转基因的烟草对烟草赤
星病菌 (Alternaria alternata )的抗性明显提高。此外
棉花黄萎病原菌可也诱导转基因烟草中的这个基因
转录水平的表达 [ 13]。水稻 OSNPR1在转化到水稻
中高表达, 能够增强对白叶枯病和稻瘟病的抗
性 [ 14]。在转基因苹果中,超量表达苹果 MpNPR1基
因能够激活一系列下游相关防御基因的表达, 增加
了苹果对火伤病和其它真菌病害的抗性 [ 15]。在葡
萄 [ 16]、油菜 [ 17]等研究中取得了同样的结果, 可以预
见, NPR1基因在作物抗病性改良中有着广阔的
前景。
参 考 文 献
[ 1] C aoH, Bow ling SA, Gordon AS, et a.l Characterization of anAra
bid op sism utan t that is non respons ive to inducers of system ic acqu ired
resistance. P lan tC el,l 1994, 6( 11) : 15831592.
[ 2] C ao H, G lazebrook J, C lark e JD, et a.l TheArabidopsisNPR1 gene
that con trols system ic acqu ired resistance encodes a novel protein
con tain ing ankyrin repeats. Cel,l 1997, 88( 1) : 5763.
[ 3 ] Pei XW, Li SJ, Jiang Y, et a.l Isolat ion, characterization and phy
logenetic analys is of the resistance gen e analogues ( RGAs ) in ba
80
2010年第 9期 李康等:香蕉 M uNPR11基因的克隆与表达分析
nana (Mu sa spp. ) . P lan t Science, 2007, 172 ( 6) : 11661174.
[ 4] 李敏,李胜军,裴新梧. 香蕉 NPR1基因片段的克隆及对水杨酸
的早期应答反应.农业生物技术学报, 2007, 150 ( 2) : 352353.
[ 5] E ndah R, Beyen eG, K iggunduA, et a.l E licitor and Fu sarium in
duced express ion ofNPR1like gen es in b anana. Plan t Phys iol B io
ch em, 2008, 46 ( 11) : 10071014.
[ 6] W endy VH, P iet FW, Wou tersM B, et a.l TheA rabidopsis d efense
response m utan t esa1 as am odel to d iscover novel res istan ce tra its a
gainstF usarium diseases. Plan t Science, 2006, 171( 5 ): 585595.
[ 7 ] C hern MS, F itzgerald HA, Y adav RC, et a.l Ev idence for a d is
easeres istan ce pathw ay in rice sim ilar to th e NPR1m ed iated s igna
ling pathw ay inA rabid op sis. P lan t J, 2001, 27 ( 2) : 101103.
[ 8 ] L inWC, Lu CF, W u JW, et a.l T ransgenic tom ato p lan ts express
ing the A rabidop sis NPR1 gene d isplay enhan ced resistance to a
spectrum of fungal and bacteria l d iseases. Transgen ic Research,
2004, 13 ( 6) : 567581.
[ 9] M akandar R, E ss ig JS, S chapaugh MA, et a.l Genetically engi
neered resistance to Fu sarium head blig ht in w heat by expression of
Arabid op sis NPR1. Mol P lan tM icrobe In teract, 2006, 2: 123129.
[ 10 ] M eu r G, Budath aM, Dutta Gupta A, et a.l D if feren tial indu ct ion
ofNPR1 du ring defense responses in B rassica jun cea. PhysiolM ol
Plant Patho,l 2006, 68( 46) : 128137.
[ 11 ] W ally O, Jayara j J, Pun ja ZK. B roadsp ectrum d isease resistance
to necrotroph ic and b iotroph ic pathogen s in transgen ic carrots
(Daucus carota L. ) exp ress ing anArabid opsisNPR1 gene. P lan ta,
2009, 231 ( 1) : 131141.
[ 12 ] Parkh iV, Kum ar V, Cam pbellLAM, et a.l Res is tan ce against va
riou s fungal pathogen s and ren iform nem atod e in tran sgen ic cotton
p lants exp ressing Ara bid opsisNPR1. Tran sgen ic Research, 2010.
[ 13] 王旭静, 窦道龙, 王志兴,等. 海岛棉 GbNPR1基因全长 cDNA
的克隆及其在烟草中的表达. 中国农业科学, 2006, 39 ( 5 ):
886894.
[ 14 ] Yuan YX, Zhong SH, L i Q, et a.l Functional ana lysis of rice
NPR1 like genes reveals that O sNPR1NH1 is the rice ortho logue
con ferring d isease res istan ce w ith enhan ced herb ivore suscept ib ili
ty. P lan t B iotechno logy Journ a,l 2007, 5 ( 2) : 313324.
[ 15] M alnoyM, J in Q, BorejszaWysocka EE, et a.l Overexpression of
th e appleM pNPR1 gene con fers in creased d isease resistance inM a
lus x dom estica. Mol PlantM icrobe In teract, 2007, 20: 15681580.
[ 16] Le H, H eitzGT, M estre P, et a.l Characterization ofVitis vinifera
NPR1 hom ologs invo lved in th e regu lat ion ofP athogenesisR ela ted
gene express ion. BMC Plan t B iology, 2009, 9: 54.
[ 17] M eur G, Budatha M, S rin ivasan T, et a.l C onst itu tive expression
ofArabidopsisNPR1 confers enhan ced resistance to the early ins tars
ofSpodoptera litu ra in transgen ic tobacco. Physiol Plant, 2008,
133( 4) : 765775.
81