全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 5期
猪繁殖与呼吸综合症病毒 E基因克隆及重组
腺病毒表达载体的构建
刘光瑞1, 2 李宝玉 2 柳纪省 2 胡永浩 1
( 1 甘肃农业大学动物医学院,兰州 730070; 2 中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室
农业部畜禽病毒学重点开放实验室 农业部兽医公共卫生重点开放实验室,兰州 730046)
摘 要: 研究采用 RTPCR技术对猪繁殖与呼吸综合症病毒 ( PRRSV )E基因进行了克隆、测序和特征分析,得到长度为
603 bp, 编码 201个氨基酸残基的目的基因片段。将克隆到的 E 基因插入到 pAdT rackCMV穿梭质粒中, 再将重组穿梭质粒
pAdT rackCMV /E用 Pm e线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体 pAdeasy1的大肠杆菌 B J5183感受态细胞, 经细菌内同源
重组产生重组腺病毒质粒 pAdE asyE, 成功获得了含有 PRRSV E 基因的重组腺病毒表达载体。为猪繁殖与呼吸综合症活载体
疫苗的研制提供了依据。
关键词: 猪繁殖与呼吸综合症病毒 E基因 腺病毒 表达
C loning ofE Gene of Porcine Reproductive and Respiratory
Syndrome Virus( PRRSV) and Construction of
Recombinant Adenovirus Expressing Vector
L iu Guangrui
1, 2 L iBaoyu2 L iu J ix ing2 Hu Yonghao1
(
1
College of VeterinaryM edicine, Gansu A gricultural University, Lanzhou 730070;
2
Lanzhou Veterinary Research Institu te, Chinese A cademy
of Agricultural Sciences, S tateK ey Laboratory of Veterinary EtiologicalB iology, K ey Laboratory of Animal V irology of M inisty of Agriculture,
K ey Laboratory of Veterinary Communal Sanitation M inistry of Agriculture, Lanzhou 730046)
Abstrac:t In th is study, full leng th E gene o f po rc ine reproductiv e and respiratory syndrom e v irus( PRRSV ) w as cloned by RT
PCRThe resu lts show ed that theE gene conta ins 603 nuc leo tide that cou ld code 201 am ino ac idesThen theE gene was subcloned into
adenov irus shu ttle vecto rs pAdT rackCMV, and the transfer vec to r pAdT rackCMV /E w as constructed After be ing linear ized, the
pAdT rackCMV /E w as transfo rm ed into the E coli stra in B J5183 ce lls and the recomb inant superco iled adenov ira l vecto r pAdEasy1
w as constructed successfu lly, thus prov iding a basis for the research of recom binant rep licationde fective adenov irus based PRRSV vac
cine
Key words: Porc ine reproductive and respiratory syndrom e v irus E gene Adenov irus Express
收稿日期: 20081029
基金项目:甘肃省自然基金项目 ( 3Z S051A25076 ),甘肃省科技攻关 ( 2GS0S2A4100602)
作者简介:刘光瑞 ( 1981) ,男,甘肃民勤县人,硕士研究生,主要从事动物传染病学与分子免疫学研究
通讯作者:柳纪省, Em ai:l L iu jix ing@ hotm ai l com cn
猪繁殖与呼吸综合征 ( porc ine reproductive and
resp iratory syndrome, PRRS)俗称猪蓝耳病, 是由病
毒引起的猪的一种传染病, 以母猪繁殖障碍、早产、
流产和死胎,仔猪及育成猪呼吸系统症状为主要特
征,属二类动物疫病。高致病性猪蓝耳病是由猪繁
殖与呼吸综合征病毒 ( porc ine reproductive and re
spiratory syndrome v irus, PRRSV)变异株引起的一种
急性高致死性疫病。我国 1996年首次报道该病的
存在 [ 1] ,根据临床和血清学调查, 该病在我国普遍
存在,而且近年来还呈流行态势 [ 2]。 PRRSV归属于
尼多病毒目,动脉炎病毒科, 动脉炎病毒属。其病毒
粒子成卵圆形, 直径 50 ~ 65 nm,有囊膜, 20面体对
2009年第 5期 刘光瑞等 :猪繁殖与呼吸综合症病毒 E基因克隆及重组腺病毒表达载体的构建
称,为单股正链 RNA病毒。依据血清学实验及结构
基因序列分析可将 PRRSV划分为两种基本的基因
型,即欧洲型和美洲型,前者主要流行于欧洲地区,
而后者主要流行于美洲和亚太地区。
PRRSV基因组全长 15 kb,含有 8个开放阅读框
(ORFS)。ORF1a和 ORF1b位于基因组的 3端, ORF2
~ ORF7在基因组的 5端。PRRSV包含 3个主要的结
构蛋白, ORF5编码 25 kD的 GP5蛋白,也称 E蛋白,
ORF6基因编码 18~ 19 kD的非糖基化囊膜蛋白 M,
ORF7基因编码的 15 kD的核衣壳 N[ 3]。GP5蛋白含
有 4个糖基化位点,具有 1个 31个氨基酸的信号肽和
3个跨膜功能区分别位于 62~ 83, 90~ 106, 113~ 130位
氨基酸 [ 4]。GP5蛋白还可以通过二硫键与 M蛋白形成
异源二聚体,在二聚体中含有同病毒相关的免疫重要
区 [ 5]。GP5蛋白诱导的抗体能在体外中和病毒的感
染,而且中和能力强于 GP4诱导产生的抗体 [ 6]。用杆
状病毒表达的 GP5蛋白产物免疫母猪可以产生 50%的
保护力 [ 7]。在 CMV启动子控制下的 ORF5质粒免疫
动物后在猪和小鼠产生抗 GP5的特异性中和抗体。在
大肠杆菌表达的重组蛋白免疫的条件下。DNA免疫过
的动物外周血单核细胞母细胞化,说明了对 GP5也具
有特异性的细胞免疫作用 [ 3]。所以, ORF 5基因是研究
PRRSV基因工程疫苗的首选分子。
目前防治 PRRSV的基因工程疫苗研究还处于
实验室研究阶段, 传统的 DNA疫苗制备简单, 成本
低廉, 可诱导体液免疫和细胞免疫, 但是质粒 DNA
导入机体的效率低, 外源基因表达水平低, DNA在
宿主细胞内持续表达能诱发免疫耐受、自身免疫、过
敏反应和超免疫性, 以及存在整合到宿主染色体上
的隐患。而现有研究表明以腺病毒为表达载体的基
因工程疫苗具有良好的应用前景, 该载体介导的基
因具有转移效率高、感染细胞谱广、病毒滴度高、易
于浓缩和贮存等诸多优越性 [ 8]。因此, 本试验利用
RTPCR扩增出 E基因, 与 GenBank上 E基因进行
序列测定和比较,同时构建包含 PRRSV E基因的重
组复制缺陷型腺病毒表达载体,为研制出安全有效
的 PRRSV腺病毒活载体疫苗奠定基础。
1 材料与方法
11 病毒样品
PRRSV本实验室保存。
12 质粒、宿主菌株
pMD18T载体购自大连宝生物工程公司; 腺病毒
穿梭载体 pAdTrackCMV、腺病毒骨架载体 pAdEasy1、
JM109、BJ5183、DH10B等由所在实验室提供。
13 工具酶及其它试剂盒
AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs、Ex Taq
DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、E coR、Bgl、DNA凝胶回
收试剂盒、质粒提取试剂盒等购自大连宝生物工程公
司; RNA提取试剂盒购自 Q iagen公司; PmeI, PacI等限
制性内切酶购自 B io lab公司;脂质体 Lipofectam ine2000TM
购自 Invitrogen公司。
14 引物设计与合成
参考 GenBank中登陆的 PRRSV全序列,用计算机
软件 DNAstar进行序列比对,根据 PRRSV基因组的特
性及序列的保守性,用 Prmi er设计一对引物能够完整
的扩增出 E基因全序列,引物均由大连宝生物 ( Taka
ra)工程公司合成。引物序列为 A1: 5TGTATTAGAC
CAGACTGG3A2: 5CTGCCAACCGCCATCTATCTT3。
根据所测序列,在引物的 5端引入 E coRI和 Bgl
酶切位点,合成引物 A3和 A4, 再次进行 PCR扩增,
并将相应的 DNA片段插入到 pMD18T载体进行测
序,阳性重组质粒命名为 pMD18T /E,测序由大连宝
生物工程公司完成。A5: 5CTTGAATTCAACATGTT
GGGGAAGTGCTTGAC3, A6: 5AAGAGATCTAGAG
ACACCCCAAGTTC3。
15 病毒 RNA的提取
按照 Q IAGEN公司的 RNA提取试剂盒 RNeasy
m in i Sp inColumns K it操作说明书进行, 提取的总
RNA - 70 保存备用。
16 PCR产物的克隆
将 PCR产物用 10 g /L琼脂糖凝胶电泳,切下含
目的条带的凝胶,按说明书用 DNA回收试剂盒回收
PCR产物, 按常规方法与 pMD18T载体连接; 将连
接产物转化大肠杆菌埃希氏菌 JM 109感受态细胞,
37 培养 12 h。挑取上述转化平皿中的单个菌落,
接种到含有 Amp( 100 g /m l)的 LB液体培养基中,
37 振荡培养过夜至混浊, 提取质粒进行酶切和
PCR鉴定。采用 Sangers双脱氧末端终止法对经酶
切和 PCR鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定 (由
大连宝生物工程公司完成 )。对测序结果应用
131
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
DNAstar和 B last等软件与 GenBank中 PRRSV参考
毒株进行同源性比较。
17 重组腺病毒穿梭载体的构建
将 pMD18T /E质粒用和双酶切后形成带有粘
性末端的目的基因, 同时将腺病毒 pA dTrackCMV
也经 E coR I和 Bg l双酶切得到线形化的载体。使
用 T4 DNA连接酶对上述产物进行粘端连接。按常
规方法将连接产物转化 JM 109, 在含卡那抗性的琼
脂平板上筛选,挑选克隆后,提取质粒。采用酶切、
PCR等方法鉴定, 得到阳性重组质粒, 命名为
pA dTrackCMV /E。
18 重组腺病毒质粒的构建
将骨架载体 pAdE asy1转化大肠杆菌 B J5183,
制备携带腺病毒骨架载体的感受态菌。将重组穿梭
载体 pA dTrackCMV /E经 Pme I线形化后电转化感
受态菌,电转后将细胞在 LB培养液中于 37 复苏
1 h, 取适量的细胞涂入含 80 mg /m l卡那霉素的培
养皿中, 37 培养 16~ 20 h, 挑选卡那抗性克隆,小
量提取质粒 DNA, 用 08%琼脂糖凝胶进行电泳迁
移率分析,并进行 PacI酶切图谱分析。将所得的重
组腺病毒质粒以上述同样条件电转入宿主菌
DH10B,在此宿主菌内可获得大量高质量的质粒,挑
选目的克隆,命名为 pAdEasyE。
19 重组腺病毒的包装
取从 DH10B中提取的重组腺病毒质粒 4 g,
用 Pac I酶切,完全消化以切去 ori和 kan抗性基因
等质粒构件,并暴露其反转末端重复序列 ( ITR)后,
乙醇沉淀灭菌,溶解沉淀。
脂质体介导的转染。在 35mm组织培养皿中接
种 293细胞,稀释 Pac I酶切线性化的重组腺病毒质
粒 4 g至 250 l DMEM培养液中,然后将脂质体 li
pofectam ine2000TM悬液 10 l加至 250 lDMEM培
养液中,充分将二者混匀, 室温下温育 20 m in。在此
期间吸弃细胞原培养液,用 DMEM 培养液洗细胞 1
次。往每平皿加 500 l DNA /脂质体复合物, 在
37 , 5% CO 2培养箱中温育 3~ 5 h后吸弃含 DNA /
脂质体复合物的培养液,补加 4 m l含 10%犊牛血清
的 DMEM完全培养液,继续培养。脂质体转染 9 d后
于绿色荧光显微镜下观察绿色荧光的表达。
2 结果
21 RTPCR及重组质粒的鉴定
利用所设计的引物, 通过 RTPCR扩增出目的片
段,大小与预期结果一致 (图 1)。将该 PCR产物克隆
于 pMD18T载体上,转化大肠杆菌 JM 109感受态细胞,
通过蓝白斑筛选,得到阳性重组子,酶切鉴定阳性重组
子,得到目的片段, PCR鉴定也得到目的片段
MDL5000M arker; 1E基因 PCR产物
图 1 PCR扩增 E基因结果
22 重组腺病毒穿梭载体的构建
将所获得的含有 E 2基因的腺病毒穿梭质粒用
E coR I和 Bgl双酶切,可切出一条约 600 bp左右的
片段 (图 2)。
1pA dTrackCMV /E经 E coR I和 Bg l 酶切产物
图 2 重组穿梭载体经 EcoRI和 Bgl 酶切鉴定
23 获得复制缺陷型腺病毒质粒
将重组穿梭质粒线性化后,电转化感受态菌,挑
取阳性克隆,小量提取质粒, 08%琼脂糖凝胶电泳,
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2009年第 5期 刘光瑞等 :猪繁殖与呼吸综合症病毒 E基因克隆及重组腺病毒表达载体的构建
可见重组腺病毒质粒与 pAdEasy1大小相似, 而大
于穿梭载体 pAdTrackE (图 3), 限制性内切酶酶切
后可见约 45 kb和 35 kb的条带,其结果与预期相
符 (图 4)。
MH ind M ark er; 1 pA dTrackCMV /E; 2 重组腺病毒质粒;
3pAdE asy1
图 3 重组腺病毒质粒电泳鉴定
MDL15000 DNA分子量标准; 1重组腺病毒质粒酶切
图 4 pAdEasyE酶切鉴定
24 重组腺病毒的包装
重组腺病毒质粒经 PacI酶切后经脂质体 lipo
fectam ine2000转染 293细胞 9 d后可见 GFP大量表
达 (图 4), 由于 GFP位于载体多克隆位点的下游位
置,从而可说明目的基因的表达。
图 5 观测到的 EGFP的表达
3 讨论
ORF5体外中和试验均已证明 GP5抗体具有中
和活性。此外, GP5对 T淋巴细胞增殖反应的刺激
作用仅次于 M蛋白,表明 GP5在诱导 PRRSV特异
性细胞免疫中也具有重要作用。在敏感的猴肾细胞
PAM s原代细胞, PRRSV美洲株和欧洲株都能诱导
细胞调亡。已证实, GP5是 PRRSV中最主要的保护
性抗原,可诱导体液免疫和细胞免疫, 而且其 N端
胞外区存在一个非常强的中和表位, PRRSV感染猪
后产生的中和抗体也主要针对该表 [ 9, 10]。
本试验使用复制缺陷型腺病毒载体系统
pAdE asy
TM
,该系统采用了 pA dTrackCMV穿梭载体
作为转化质粒。由于 pAdT rackCMV含有 GFP 基
因, 该基因被同源重组入复制缺陷型腺病毒基因组
后,能在 293细胞中大量表达 GFP, 在荧光显微镜下
发出很强的绿色荧光,使本系统很容易对外源基因
的表达进行适时监控,从而大大简化了转染成功与
否的鉴定步骤,明显缩短了获得重组病毒的周期,提
高了试验效率。
活载体疫苗是近年来研究的热点之一。由于外
源基因已经作为载体病毒自身结构的一部分,所产生
的免疫应答水平通常不低于完整病毒相应成分所引
起的免疫强度。而腺病毒载体在哺乳动物多种细胞
上进行基因转移和蛋白表达的高效性,使其在基因疫
苗及基因治疗的研究中受到人们的青睐。Ba lasuriya
等 [ 11]在研究马动脉炎病毒 ( EAV )的活病毒载体疫苗
时发现, ORF5与 ORF6共表达的重组病毒疫苗能诱
发很强的体液免疫与细胞免疫反应,并能抵抗强毒攻
击。方六荣等 [ 12]以伪狂犬病毒基因缺失标志疫苗株
TK
/gG
/LacZ
+为亲本株,通过同源重组,构建了表达
PRRSV主要免疫原性蛋白 GP5的重组伪狂犬病毒
TK
/gG
/GP5
+
,将重组病毒免疫 Balb /c小鼠, 2次免
疫后 4周, 50% ( 3 /6)小鼠产生了低水平的 GP5特异
性 ELISA抗体。
以腺病毒为表达载体的基因工程疫苗对于防治
该病具有良好的应用前景, 该载体介导的基因具有
转移效率高、感染细胞谱广、病毒滴度高、易于浓缩
和贮存等诸多优越性。为此本实验从 PRRSV毒株
中扩增到 E基因,并作为外源基因定向插入到腺病
毒穿梭载体中,经过大肠杆菌内同源重组获得含有
PRRSV E蛋白基因的重组复制缺陷性腺病毒, 为猪
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
繁殖与呼吸综合征病毒复制缺陷型腺病毒活载体疫
苗的研制奠定了基础。
参 考 文 献
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713~ 17
(上接第 129页 )
3 讨论
哺乳动物的防御素可以抗细菌、真菌等多种微
生物, 尤其是对支原体、衣原体、螺旋体以及一些恶
性细胞 (肿瘤细胞 )和艾滋病病毒有杀伤作用 [ 10 ] ,
极有可能成为新一代抗菌药物的理想选择 [ 11 ]。猪
防御素作为防御素家族重要成员, 具有极高的研
究和开发应用价值。但猪体内天然 防御素表达
量低、分子小、分离困难及化学合成防御素成本又太
高,所以利用基因工程技术重组表达外源基因已成
为获取目标蛋白的最有效途径之一 [ 3 ~ 7 ]。
动物乳腺生物反应器技术是指利用可在哺乳动
物乳腺特异性表达的启动子元件构建重组基因,使
外源基因可在乳腺中表达,从而获得转基因动物,并
从转基因动物的乳液中获取重组蛋白 [ 8]。由于其
巨大的商业和社会价值, 动物乳腺生物反应器已成
为 21世纪生物制药发展的重点方向之一。
本研究构建的 pIRES2EGFPBLGPBD1, 在目
的基因之前插入山羊 BLG调控序列, 利于目的蛋白
在乳腺特异性高效表达 [ 9]。该载体包含的增强型
绿色荧光蛋白确保了试验过程中能够进行直观、及
时地观察和检测 [ 12 ]。此外,经典途径分泌的细胞因
子其基因序列中都含有前导的信号肽序列, 可引导
蛋白质经由高尔基体 -内质网途径分泌。本试验构
建的乳腺特异性表达载体正是包含了 PBD1自身
的信号肽,可以保证表达产物正常分泌到胞外。因
此, 基于以上分析成功构建的猪 PBD 1基因乳腺特
异性表达载体, 为进一步研究其 PBD1抗菌活性、
抗菌机理,以及最终通过乳腺生物反应器途径获得
大量药用蛋白 PBD1奠定了基础。
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