全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
LfcinB突变基因在大肠杆菌中的融合表达
及其活性测定
吴建军 1 韩跃武 2 刘凯 1 张延英1 刘永琦 1
( 1甘肃中医学院,兰州 730000; 2兰州大学基础医学院,兰州 730000 )
摘 要: 测定 L fcinB突变基因 ( mL fc inB)在大肠杆菌中的融合表达及其表达产物的抗菌活性。对 L fc inB基因突变后进
行克隆并测定序列, mL fc inB基因融合表达载体构建后并在大肠杆菌中的表达, 分离提纯表达物并测定其活性。结果显示, L f
cinB突变基因克隆后表达产物在经 SDSPAGE电泳, 考马斯亮蓝 G250染色可在 29 kD处看到预期的融合蛋白条带;对照组空
质粒 pGEX4T1经相同条件诱导后表达的蛋白为 26 kD。通过抑菌试验发现其对金黄色葡萄球菌 ATCC25938具有较强抗菌
活性。表明 mLfc inB基因表达物具有较强的抗菌作用。
关键词: L fcinB基因 突变 PCR 融合表达 抗菌
LfcinBMutantGene Cloned inEscherichia coli Fusion Expression
and Activity Determ ination
Wu Jian jun
1
H an Yuewu
2 L iu Kai1 Zhang Yanying1 L iu Yongqi1
(
1
Gansu College of T raditional ChineseM edicine, Lanzhou 730000;
2
BasicM edical College Lanzhou University, Lanzhou 730000)
Abstrac:t The resea rch was to de tect L fcinB m utant gene( mL fc inB) in Escherichia co li fus ion expre ssion and antibacter ia l ac
tiv ity o f expression p roducts. A fterL fcinB cloned genem utations and detection gene s sequence, mL fc inB fusion gene expression vecto r
in E. coli a fte r express ion, the express ion of sepa ra te and refine and dete rm ine its activ ity. Re sults show ed tha t indicated that L fc inB
m utant gene cloned in the expression product by SDSPAGE electrophoresis and Coom ass ie br illiant b lue G250 staining can be seen
at the expected fusion 29 kD protein bands, compar ing w ith con tro l group, w here the em pty plasm id pGEX4T1 expression induced
by the sam e conditions, expressed the pro te in 26 kD. Through the an tibacte ria l test w as found on S taphy lo coccus aureus
ATCC25938 has strong antim icrobia l activ ity. Therefo re, it proved that mL fc inB com plex gene expre ss ion has a strong antibacte ria l
effect.
Key words: L fcinB gene M utation PCR Fusion expression Antim icrob ial
收稿日期: 20091222
基金项目:甘肃省科技攻关项目 ( 2GS064A4302021)
作者简介:吴建军,男,硕士,讲师,研究方向:药理学; Em a i:l w jj611285@ 126. com
通讯作者:韩跃武,男,硕士,副教授,从事医学生物化学与分子生物学教学和科研工作
由于抗生素的长期使用,自然界中微生物的抗
药性不断增强,因此迫切需要寻找高效安全的新型
生物工程的抗菌药物。抗菌肽具有广谱的抗菌能力
和不易产生耐药性及不杀伤真核细胞的特点, 在抗
生素耐药性日益严峻的情况下,抗菌肽有望成为抗
生素的最佳替代者 [ 1]。本次研究通过克隆乳铁蛋
白多肽 ( lacto ferricin, lfcin)突变基因, 并测定其真核
系统中表达产物的抗菌活性。
1 材料与方法
1. 1 材料
L fcinB基因片段由上海生物工程公司合成。
E. coli DH5: 基因型 supE44 lac169 ( 80 lacZ
M 15) hsdR17 recA gyrA96 thire lA .l ; E. coli BL21:
基因型 FompThsd S ( rBmB) ga l( 1, 2) . ; 金黄色葡
萄球菌 ATCC25938由兰州大学生物化学与分子生
物学研究所保存。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
质粒载体 pUC18: 购自华美公司; PCR鉴定所
需的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合
成; PCR试剂盒:购自华美生物工程公司; 限制性内
切酶 E coR及其配套缓冲液:购自宝生物工程 (大
连 )有限公司; 限制性内切酶 Sal及其配套缓冲液
购自宝生物工程 (大连 )有限公司; T4DNA连接酶:
购自华美生物工程公司。小牛肠碱性磷酸酶
( C IAP): Fermentas产品; Agarose(琼脂糖 ): 德国进
口分装; Agarose LM P (低熔点琼脂糖 ) : Prom ega产
品分装; IPTG: Promega产品分装; XGa:l普洛麦格
(北京 )生物技术有限公司; 100 bp DNA marker: 购
自华美生物工程公司;胰蛋白胨: 英国 Oxoid公司产
品;酵母提取物: 英国 Oxo id公司产品; Agar(琼脂 ) :
日本进口分装;溶菌酶、ATP: 购自华美生物工程公
司产品; UN IQ10柱式 DNA胶回收试剂盒, UN IQ10
柱式质粒小量抽提试剂盒, Pro teinM arker:购自上海
生工生物工程技术服务有限公司; G lutath ioneSeph
arose 4B: Amersham B ioscience AB进口分装; 凝血
酶:购自 Sigma公司;其余为国产分析纯。
12 Lfc inB突变基因克隆后并测定序列
121 Lfc inB基因的突变 Lfc inB基因经试验获
得并抽提后重组质粒送上海生工生物工程技术服务
有限公司测序。然后根据 LfcinB结构特征及文献
资料设计突变位点,将第 4位的精氨酸密码子 CGT、
第十位的甲硫氨酸密码子 ATG, 均突变为色氨酸密
码子 TGG。然后对突变 LfcinB基因进行克隆。即在
37 用 E coR和 Sal双酶切 mL fcinB基因连接产物及
pUC18质粒 3- 4 h;回收酶切得到的 mLfcinB及线性
pUC18质粒,应用 T4 DNA连接酶 16 连接过夜, 转
化感受态大肠杆菌 DH5, 应用含 IPTG /XGal/Amp
的培养基培养过夜,随机挑取白色 Amp抗性菌落, 应
用上海生物工程公司小量质粒快速抽提试剂盒提取
质粒;进一步进行单、双酶切及 PCR鉴定。
122 mLfcinB基因的序列分析 将经过限制性
核酸内切酶单酶消化、双酶消化、PCR扩增鉴定为
阳性的重组质粒样品送上海生工生物工程技术服务
有限公司测定序列。
13 mLfcinB基因融合表达载体构建后并在大肠
杆菌中的表达
131 mLfc inB基因融合表达载体构建 预先对融
合表达载体 pGEX4T1进行处理。包括对 pGEX4T
1双酶切,然后 pGEX4T1双酶切后去磷酸化,用低
熔点琼脂糖挖块法回收双酶切产物,并使 mLfc inB与
PGEX4T1连接,对 mLfcinB与 PGEX4T1的连接产
物进行转化,转化后对 PGEX4T1mLfc inB表达重组
质粒进行鉴定,使用上海生工的 UN IQ10柱式质粒小
量抽提试剂盒抽取重组质粒。最终对重组质粒的单、
双酶切,以引物 3和 4为抽提的表达重组质粒为模板
进行 PCR鉴定。将经过限制性核酸内切酶单酶消
化、双酶消化、PCR扩增鉴定为阳性的重组结果送大
连 TaKaRa公司测定序列。以确定目的基因插入方
向是否正确,确保表达的正确进行。
132 mLfc inB基因在大肠杆菌中的诱导表达并
分离纯化 将含有目的插入片段的重组质粒 pGEX
4T1 mLfcin转化大肠杆菌 BL21感受态细胞, 在含
Amp的 LB固体培养基上过夜生长, 随机挑取数个
克隆接种到 3mL含 Amp的 LB液体培养基中, 37
摇床剧烈震荡培养过夜, 次日以 5% 的比例将
250 L细菌悬液接种到 5 mL LB液体培养基中, 继
续 37 震荡培养至对数生长期后加入 IPTG至终浓
度为 05mM,继续培养 2- 5 h。取诱导后 3 h的菌
液 2mL, 5 000 r/m in离心 5 m in,收集菌体,进行全
菌体蛋白 SDSPAGE凝胶电泳分析 [ 2]。取 mL fc inB
表达阳性的 BL21菌液 100 L加入到 100 mL含
Amp的 LB培养基中, 37 剧烈振摇, 直到 OD600值
为 05- 07,加入终浓度为 05mM /L的 IPTG诱导
表达 3 h, 5 000 r /m in, 离心 5 m in收集菌体。菌体
破碎后对包涵体进行纯化、溶解, 对融合蛋白复性和
纯化。进一步对 mLfc inB蛋白与 GST融合蛋白进行
分离提纯。
14 测定分离提纯表达物的活性
将处于 对数生 长期的金 黄色葡 萄球菌
ATCC25938细菌悬浮液 ( OD650 = 03- 05) 30 L与
固体培养基 7 mL在 45 左右混匀,平铺于两个培养
皿中,凝固后每个培养皿中打直径为 3 mm的小孔 4
个, 2个孔中滴入 4- 5 L纯化后的 LfcinB蛋白,另
外 2孔以生理盐水作为对照, 37 培养过夜, 观察抑
菌环并测量其大小 [ 3]。
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2010年第 3期 吴建军等 : L fcinB突变基因在大肠杆菌中的融合表达及其活性测定
15 统计方法
抑菌环直径表示用 x s表示, 分析数据采用独
立样本 t检验。
2 结果
21 mLfc inB基因的测序结果
测序结果表明,所获得的克隆重组体中含有 Lf
cinB成熟肽 cDNA序列,与设计序列完全一致。
211 mLfcinB基因片段 E coR和 Sal双酶切结
果 (图 1)。
M. DNA m arker DL2000; 1. ssDNA; 2. mL fcinB / E coR + Sal 双酶
切产物; 3, 4. m LfcinB
图 1 mLfcinB基因 EcoR和 Sal双酶切结果
212 pUC18与 mLfc inB连接、转化及筛选 蓝
色菌落为不含重组质粒的阴性菌落, 白色菌落为含
重组质粒的阳性菌落。
213 克隆重组体的鉴定 将重组质粒 pUC18
mL fcinB用 EcoR和 Sal双酶切, 可见约 80- 90
bp的小片段 (图 2)。同时做重组体 EcoR单酶切
对照。用引物 1和 2扩增抽提的重组质粒 pUC18
mL fcinB,结果如图 3所示。
M. 100 bp DNA ladder; 1. pUC18mLfcinB /E coR + Sal 双酶
切产物; 2. pUC18mLfcinB /E coR酶切产物
图 2 pUC18mLfcinB重组体酶切结果
M. DNA M arker DL 2000; 1, 2. pUC18 /PCR; 3, 4. pUC18
mL fcinB /PCR;
图 3 pUC18mLfc inB PCR鉴定结果
214 测序结果 抽提后重组质粒送上海生工测
序, 结果如图 4。测序结果表明,所获得的克隆重组
体中含有 mL fcinB DNA序列,与试验设计的结果完
全一致。
图 4 mLfc inB序列
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
22 mLfc inB基因融合表达载体构建后并在大肠
杆菌中的表达
221 全菌体蛋白 SDSPAGE电泳结果 重组表
达质粒 pGEX4T1LfcinB及 pGEX4T1mLfc inB转
化 E. coli BL21,阳性转化子在终浓度为 05 mM /L
IPTG、37 诱导下表达 2 - 5 h后, 全菌体蛋白经
SDSPAGE电泳,考马斯亮蓝 G250染色可在 29 kD
处看到预期的融合蛋白条带 (图 5)。对照组空质粒
pGEX4T1经相同条件诱导后表达的蛋白为 26 kD。
M. Protein marker; 1 - 2. E. coli BL21; 3- 5. L fcinB经 IPTG诱导
后的蛋白表达; 6 - 7. mL fcinB经 IPTG诱导后的蛋白表达
图 5 26 pGEX4T1LfcinB及 pGEX4T1mLfc inB
222 GST与 mL fcinB分离 将收集的经 IPTG诱
导的工程菌经超声裂解后分别进行上清和菌体蛋白
电泳 (图 6)分析发现上清中没有预期的蛋白表达,
而沉淀的菌体中则有大量的蛋白存在, 说明表达产
物主要以包涵体形式存在。包涵体经过变性和复性
处理后变为可溶形式, 再经凝血酶切割, G lutathione
Sepharose 4B柱纯化, 重组的 mLfcinB从与 GST的
融合形式中分离出来。
M. p roteinm arker; 1. GSTmL fcinB; 2.融合蛋白及其凝血酶酶
切产物
图 6 mLfcinB与 GSTmLfc inB
23 分离提纯表达物并测定其抗菌活性
通过抑菌圈试验, 可以看到 mL fc inB蛋白表现
出了对金黄色葡萄球菌 ATCC25938的抗菌活性, 与
对照组抑菌环直径比较, P < 001(表 1) ,体外抗菌
实验证实复性后的 mL fcinB蛋白具有抗菌活性。
表 1 mLfc inB蛋白对金黄色葡萄球菌
ATCC25938的抗菌作用 (x s, n= 10)
组 别 抑菌环大小 ( mm )
mL fcinB蛋白 135 22
生理盐水 25 08 b
注: mL fcinB蛋白抑菌环大小与生理盐水比较, t = 1078; b: P <
001
4 讨论
乳铁蛋白多肽 ( lacto ferricin, lfc in) ,是乳铁蛋白
在酸性环境下经胃蛋白酶水解 N端而释放的一小
段多肽,它与乳铁蛋白的功能密切相关,除不能结合
铁离子外,具备乳铁蛋白所有的生物学活性, 可抗
菌、抗病毒、抑制癌细胞的生长及参与免疫反应
等 [ 4]。在各种 Lfc in中,牛的 Lfc in( lfcinB )抗菌活性
最强。从牛乳铁蛋白分离得到的 N端 1741的一段
多肽,分子量约为 3. 126 kD,具有比 L fB强 400多倍
的抗菌活性, 即 LfcinB [ 5] , L fc in具有广谱的抗细菌
作用,此类研究主要集中在 LfcinB。本试验依据 Lf
cinB的结构特征及相关的文献报道 [ 6- 8] 对 L fc inB
基因进行了突变,将第 4位的精氨酸密码子 CGT、第
十位的甲硫氨酸密码子 ATG,均突变为色氨酸密码
子 TGG, 增加了分子中的色氨酸数, 其空间结构发
生改变。测序结果表明达到了预期的突变结果。大
肠杆菌系统由于其遗传学、生物化学和分子生物学
方面已充分被人们了解而成为表达许多异源蛋白质
的首选表达系统。就本试验而言, 要获得重组 mLf
cinB在原核表达系统的稳定表达, 需要解决的关键
问题是克服肽抗生素对表达宿主菌的杀伤作用也就
是工程菌表达 毒性蛋白时的 自杀 问题。这是
表达对宿主有害基因的关键问题。在试验中, 将包
涵体蛋白经变性和复性处理变为溶解形式, 经过凝
血酶切割从与 GST 的融合形式中解离出来, 通过
GST纯化柱获得了有抗菌活性的 mLfc inB蛋白。
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2010年第 3期 吴建军等 : L fcinB突变基因在大肠杆菌中的融合表达及其活性测定
参 考 文 献
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(上接第 84页 )
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