全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 4期
转萝卜过氧化物酶基因毕赤酵母株系培养条件的优化
王一帆 李芳军 杨静 王丽 王林嵩
(河南师范大学生命科学学院, 新乡 453007)
摘 要: 为了提高转萝卜过氧化物酶基因 RsP rx1毕赤酵母株系的表达产量, 对培养条件进行优化。试验结果表明,
26 , pH 7 4,甲醇浓度 05% , 通气面积 1 5 cm2, 225 r/m in条件下, 萝卜过氧化物酶 RsP rx1表达量达 50 95 U /mL。在优化条
件下, 对培养基补充方式和菌株的遗传稳定性研究表明, 彻底更换培养基较补充培养基提高 3倍得率,转基因菌株遗传稳定性
较高。
关键词: 萝卜过氧化物酶 毕赤酵母 转基因 培养条件
TheOptimum Cultivation for Improved Heterologous
Expression of Radish Peroxidase in P ichia pastoris
W ang Y ifang L iF angjun Yang Jing W ang L i W ang L insong
(College of Life Science, H enan N ormal University, X inx iang 453007)
Abstrac:t The optim um cultiva tion have been investigated fo r improved heterologous express ion of R sP rx1( a perox idase o f rad
ish) in P ich ia pastor is. The resu lts show ed that the expression o fR sP rx1 could reached 5095 U /mL in 26 , pH 7 4, 0 5% m ethano ,l
1 5 cm2 aeration area, 225 r/m in. In the optimum cultiv ation, the tota l activ ity o f perox idase was about 3 tim es h ighe r in abso lute ly re
p laced m ed ium continuous cu lture than that partly added med ium continuous culture. The PCR resu lts show ed the transgen ic stra in w as
hered itary stab ility.
Key words: Radish perox idase P ichia pastor is T ransgene Cu lture condition
收稿日期: 20091218
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30570135 ), 国家大学生创新性实验计划项目 ( 081047609 ), 河南师范大学大学生创新性实验计划项目
( 2008405) , 河南师范大学 (国家级 )实验教学示范中心大学生创新性实验计划项目
作者简介:王一帆,男,研究方向:生物化学
通讯作者: 王林嵩, Em ai:l w ls@ henannu. edu. cn
过氧化物酶在动植物疾病发生、染料废水的降
解以及有机合成中的作用已越来越受人们注意 [ 1 ]。
虽然过氧化物酶是一单体蛋白,但是糖基化程度限
制其在原核生物表达体系的有效表达, 已有报道过
氧化物酶在酵母中成功表达 [ 2]。为了研究萝卜过
氧化物酶 R sPrx1的功能, 构建了萝卜过氧化物酶毕
赤酵母表达菌株 [ 3] , 但表达产量较低, 直接影响进
一步的研究, 为了提高转萝卜过氧化物酶基因
RsPrx1毕赤酵母株系的表达产量, 本试验对其培养
条件进行优化,并对培养方式进行有益探讨。
1 材料与方法
11 供试材料
含有萝卜过氧化物酶基因 R sPrx1重组酵母菌
株为本实验室构建和保存 [ 3]。
12 优化条件
选用 BMMY培养基, 首先参照文献 [ 2 ]在
pH 60, 28 , 225 r/m in条件下, 选择甲醇浓度, 设
置两个浓度 ( 05%和 10% ); 选择温度: 甲醇浓度
为 05% , 温度为 28 和 26 ;选择通气面积:甲醇
浓度为 05%, 温度为 26 , 通气面积为 01 cm2和
15 cm2;最后选择 pH: 甲醇浓度为 05%, 温度为
26 ,通气面积为 15 cm 2, pH66、pH70、pH74。
诱导体积为 20mL, 12 h补一次甲醇。每 24 h取一
次菌液样品,室温下 3 000 ! g,离心 5m in,取上清测
定 POD酶活性, 选择甲醇浓度时用斑点显色法测
定 [ 4] , 其他用分光光度法 [ 5] , 重复试验 3次,确定最
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
佳诱导表达因素。
13 培养方式对 R sPrx1表达量的影响
将含有萝卜过氧化物酶基因 R sPrx1重组酵母
菌株和宿主菌株 GS115分别置于 BMGY培养基
中; 待菌液 OD600达到 10左右, 将转化菌株的菌液
离心后收集菌体, 用 pH74的 BMMY诱导表达培
养基重悬, 等体积分装到 2个相同规格的摇瓶中,
放置于 26 , pH74 BMMY, 甲醇浓度 05% ,通气
面积 15 cm 2, 225 r /m in条件下继续生长, 每 24 h
取一次菌液样品离心取上清, 测定上清中 POD酶
活性。 9 d后一瓶连续培养 (补充 YP) , 另一瓶离
心去上清后用新鲜的 BMMY培养基重悬菌体后继
续培养;重复 2次, 其间每 12 h向培养基中添加
100%甲醇至终浓度为 05%, 重复试验 3次, 比较
连续培养间断补充培养基和完全更换培养基对表
达的影响。同时将 3次收集到的菌体采用煮冻煮
的方法进行 PCR鉴定其遗传稳定性。引物和 PCR
条件同文献 [ 3]。
2 结果
21 优化条件
211 甲醇浓度对转化酵母表达的影响 如图 1所
示 05%甲醇的诱导体系更有利于外源蛋白 RsPrx1
的表达。
1. GS115; 2. 05%甲醇; 3: 10%甲醇; AF.第 1- 6天的表达样品
图 1 甲醇浓度对转化酵母表达的影响
212 温度对转化酵母表达的影响 如图 2所示
26 条件下外源蛋白的表达量较 28 条件下明显
增高,培养到第 5天时, 26 条件下的表达量可达到
28 的 35倍 (P < 001)。
小写字母表示同一时间不同温度之间的差异显著性, P < 001
图 2 温度对转化酵母表达的影响
213 通气面积对转化酵母表达的影响 图 3表
明通气面积为 15 cm2时,外源 R sPrx1的表达量较
通气面积为 01 cm2的高, 培养到第 5天时通气面积
15 cm2条件下的表达量可达到 01 cm2的 45倍,
(P < 001)。
小写字母表示同一时间不同通气面积之间的差异显著性, P < 001
图 3 通气面积对转化酵母表达的影响
214 pH值对转化酵母生长和表达的影响 在
通气面积为 15 cm 2, 培养温度为 26 , 甲醇浓度
为 05%, pH值分别为 66, 70, 74的条件下, 转
基因酵母的生长情况没有明显差别, 即 OD600值基
本一致 (图 4a) , 但表达量却差别很大, 并随诱导
时间延长而增大。 pH74时, R sPrx1的酶活性始
终保持最高,而 pH 66时, 酶活性一直较低。在所
测时间范围内, 不同 pH 值条件下诱导表达的
R sPrx1酶活在第 5天时表达量差别最大, 分别在
pH74达到 1261 U /mL, pH70为 861 U /mL,
pH66为 745 U /mL, pH74时酶活是 pH66时
的 169倍 (P < 001) (图 4b)。
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2010年第 4期 王一帆等:转萝卜过氧化物酶基因毕赤酵母株系培养条件的优化
A.不同 pH值条件下的 OD 600值; B.不同 pH值条件下的酶活性;
小写字母表示同一时间不同 pH 值之间的差异显著性, P < 001
图 4 pH值对转化酵母生长和表达的影响
22 培养方式对转基因酵母表达外源 R sPrx1基因
的影响
在优化条件下 ( 26 , pH74, 05%甲醇, 15 cm2
通气面积和 225 r /m in)诱导表达转化菌株和非转化菌
株。对照组 GS115酵母菌株在整个诱导表达过程
中没有检测到任何 POD活性, 转化酵母在非诱导
表达的情况下可检测到微弱的 POD活性。转化酵
母补充培养基连续培养的菌液上清中的过氧化物
酶活性在原有的基础上不断增加, 略有下降时, 添
加 YP培养基后继续培养, 酶活性继续增加, 第 25
天时达到第 3个最大峰, 6613 U /mL,不再补充培
养基,酶活持续下降; 完全更换培养基的菌液起初
并不能检测到任何酶活, 但随着培养时间的延长
酶活性快速增加。第 16天时达到最大值 49 02
U /mL,且超过连续培养的菌液中的酶活, 第 17天
时酶活下降, 彻底更换培养基后酶活增长趋势同
前,在第 28天时再次达到最大酶活 4995 U /mL
(图 5)。29 d后补充培养基连续培养收获的总酶
活为 2 23503 U; 而完全更换培养基培养收获的总
酶活为5 72987U,是前者的 256倍左右, 且经计算
两种培养方法的成本相当。因此, 进行毕赤酵母
诱导表达外源基因时, 为经济, 快速且高效地获得
分泌表达产物, 可采取更换培养基的连续培养
方法。
箭头所指是更换或补充培养基
图 5 培养方式对表达的影响
用琼脂糖凝胶电泳检测结果表明,除 GS115酵
母菌株以外均能检测到 RsPrx1基因,且补充培养基
连续培养和更换培养基连续培养的菌株 3次鉴定条
带亮度基本一致 (图 6)。表明 R sPrx1基因转入并
整合到毕赤酵母的基因组后稳定遗传。
3 讨论
大多数使用 AOX1表达系统的重组毕赤酵母的
补料发酵方式由 3- 4个阶段组成, 也有两个阶段,
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
1. M arker, 2. GS115, 3- 5.连续培养的重组毕赤酵母;
6- 8.更换培养基培养的重组毕赤酵母
图 6 重组毕赤酵母的遗传稳定性鉴定
即甘油生长阶段和甲醇诱导阶段 [ 6]。不论是补料
发酵还是连续发酵, 甲醇浓度 [ 7] , 温度 [ 8] , 氧通量 [ 9]
都是重要的影响因素。由于所表达的基因不同, 对
每个重组毕赤酵母株系的培养条件都存在差
异 [ 10, 11]。本试验以文献报道为依据, 选用最少的变
异参数,对转萝卜过氧化物酶基因 R sPrx1毕赤酵母
AOX1表达株系的培养条件进行优化, 其培养最佳
条件是 26 , pH74, 05%甲醇, 15 cm 2通气面积
和 225 r /m in转速。虽然文献报道 [ 9, 12]增加或减少
氧通量均可提高表达产量, 但在本试验中通过增加
通气面积来增加氧通量则增加表达量。根据 R sPrx1
的氨基酸序列计算所得等电点为 86, 纯化的萝卜
过氧化物酶在弱碱性条件下比较稳定 [ 13 ] , 较高的
pH和较低的温度, 减少蛋白酶的降解作用, 有利于
表达产物 RsPrx1的稳定。
培养方式研究表明, 在两种不同的培养方式
(补充培养基和彻底更换培养基 )中, 后者的表达量
更高。这一方面和营养补充有关, 另一方面彻底更
换培养基减少酶的降解,减少产物的反馈抑制作用,
也减少持续补料的能源消耗,从而为工业化生产提
供依据。限制毕赤酵母有效表达异源蛋白的另一个
因素是转入基因的遗传稳定性 [ 10]。本试验表明该
重组毕赤酵母有较好的遗传稳定性, 也同样有利于
工业化生产。
参 考 文 献
[ 1] H am idM, Khalilu rRehm an. Potent ial app lications of peroxid ases.
Food C hem istry, 2009, 115: 11771186.
[ 2 ] M oraw ask iB, L in Z, et a.l Functional expression of horserad ish per
ox idase in Saccharom yces cerev is iae andP ich ia pa storis. Protein En
gin eering, 2000, 13( 5) : 377384.
[ 3] 李芳军,王丽,等.萝卜过氧化物酶基因 RsP rx1在毕赤酵母中的
表达及其抗性.中国蔬菜, 2010 ( 2 ): 3337.
[ 4] Kristensen BK, B lochH, et a.l Barley coleopt ile perox idases, pu rifi
cat ion, m olecu lar clon ing, and indu ct ion by pathogens. Plant Phys i
o,l 1999, 120: 501512.
[ 5 ] Rom anos MA, C lare JJ, et a1. Recom binant Bordetel la pertuss is
pertact in ( P69 ) from th e yeastP ich ia pastoris: h ighlevelp roduction
and immunological p ropert ies. Vaccine, 1991, 9: 901906.
[ 6 ] Yu rimoto H. M olecu lar bas is ofm ethanolinducib le gene expression
and its app licat ion in the m ethylotrophic yeastCand id a boidini i. B io
sci B iotechno lB iochem, 2009, 73( 4) : 793800.
[ 7] C osO, Ram on R, et a.l Operational strateg ies, m on itoring and con
trol of heterologous p rotein produ ct ion in the m ethy lotroph ic yeast
P ich ia pa storis under d ifferent p rom oters: a review. M icrob C ell
Fact, 2006, 5: 1723.
[ 8 ] Jah icM, W allberg F, et a.l Tem perature lim ited fedbatch techn ique
for control of proteolysis inP ichia pastoris bioreactor cu ltures. M icrob
Cell Fact, 2003, 2: 611.
[ 9] Jah icM, Veid e A, et a.l Process techno logy for p roduction and re
covery of h eterologou s proteinsw ithP ichia pa storis. B iotechn olProg,
2006, 22: 14651473.
[ 10] Su rribasA, S tahn R, et a.l Production of a R hizopu s oryza e lipase
from P ich ia pa storis u sing alternat ive operational strategies. J B io
techno,l 2007, 130: 291299.
[ 11] H ong F, M einander NQ, et a.l Ferm en tat ion strateg ies for imp roved
h eterologou s expression of laccase in P ichia pastoris. B iotechno l
B ioeng, 2002, 79: 438 449.
[ 12] KhatriNK, H of fm ann F. Im pact of m ethanol concen tration on se
creted protein production in oxygenlim ited cu ltures of recom binant
P ich ia pastoris. B iotechnol B ioeng, 2006, 93: 871879.
[ 13] Wang L, Bu rhenne K, et a.l Pu rification and clon ing of a Ch in ese
red rad ish peroxidase th atm etabolise pelargon id in and form s a gene
fam i ly inB ra ssicaceae. Gene, 2004, 343( 2 ) : 323335.
206