全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第4期
收稿日期:2008-02-26
基金项目:国家自然科技资源平台建设项目(2001DEA1006)
作者简介:贾红玲,女,新疆阜康人,在读硕士研究生,主要从事动物疾病诊断和动物病毒分子生物学的研究
通讯作者:关伟军,男,教授,Tel:010-62815992,E-mail:wjguan86@iascaas.net.cn
马月辉,男,研究员,博导,Tel:010-62813463,E-mail:Yuehuima@263.net
前言
犬瘟热病毒(Caninedistempervirus,CDV)属副黏病毒科、麻疹病毒属,为负链单股不分节段的 RNA病
虎源犬瘟热病毒P基因的遗传进化分析
贾红玲 1 吴润 1 郭峰 2 刘长清 3 丛义梅 3
包阿东 3 关伟军 3 马月辉 3
(1甘肃农业大学动物医学院,兰州 730070;2北京市兽医实验诊断所,北京 100101;
3中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100094)
摘 要: 根据GenBank中犬瘟热病毒基因组(Caninedistempervirus,CDV)P基因序列,设计合成一对特异性引
物,以虎源犬瘟热病毒的总RNA为模板,RT-PCR扩增P基因,并进行克隆与序列分析。结果显示,CDV虎源犬瘟热病毒
P基因序列与 GenBank中的 10种不同毒株 AY466011、AY964113、AF181446、AY386315、AF259549、AJ582385、AB212727、
AB212962、AY130857和U53712的同源性分别为93%、95%、93%、91%、91%、95%、94%、96%、98%和 93%,经过基因序列分
析,发现聚合酶P基因包含了与10个病毒毒株共有序列的6个不同改变(change),其中位点2243C和位点2465A在
虎犬瘟热毒株、AF466011毒株、AY130857毒株中保留,种系进化分析显示,三者的亲缘关系最近,表明位点 2243与
2465的点突变在犬瘟热病毒宿主间的传播极其重要,P基因结构的稍微变化是导致病毒在不同寄主中增殖的活力改变
的重要因素。
关键词: 犬瘟热病毒 P蛋白 进化 病毒毒力
TheSequenceAnalysisofPProteinCodingGeneofTigger
StrainofCaninedistempervirus
JiaHonglin1 WuRun1 GuoFeng2 LiuChangqing3 CongYimei3
BaoAdong3 GuanWeijun3 MaYuehui3
(1GansuAgricultureUniversityAnimalMedecineInstitute,Lanzhou730070;2ExperimentationDiagnosisInstituteof
Veterinary,Beijing100101;3ChineseAcademyofAgricultureScience,Beijing100094)
Abstract: AccordingtothereportedgenesequenceofPproteinofCanineDistemperVirus(CDV)inGene
Bank,aspecialpairofprimersweredesignedtoRT-PCR amplifyPproteingenebyusingtotalRNAofCDVTigger
stainasatemplate.TheresultsshowedthatthehomologyofgenesequencebetweenCDVtiggerstrainandY466011
strainwas93%,AY964113stain(95%),AF181446strain(93%),AY386315Strain(91%),AF259549strain(91%),AJ582385
Strain(95%),AB212727strain94%,AB212962strain96%,AY130857strain98%,U53712strain93%.Byanalysisingthe
sequencesofthe10strains,resultsindicatedthatthere6changesamongthem.Furthermore,site2243Candsite2465
Aareconservedinthetiggerstrain,AF466011strainandAY130857strain.Asystem ofbiologicaltaxonomybasedon
quantitativeanalysisofcomparativedata,indicatedthattiggerstrainrelatedtoAF466011strainandAY130857strain.From
thisinformation,itcanbepredictedthatanychangesofthestructureofPproteincouldresultinchangeofthe
virulenceofCanineDistemperVirus.
Keywords: CaninedistempervirusPprotein Evolution Virulenceofcaninedistempervirus
2008年第4期
毒,对我国养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的犬瘟热(Caninedistemper,CD)的病原[1~2]。
近年来老虎、大熊猫等多种野生动物也有 CD自然发病的报道[3],甚至从 Paget骨炎患者体内检测到犬瘟热
病毒核酸[4],使得 CDV有可能成为继狂犬病之后人犬共患的第 2种疫病,引起了动物病毒学界及医学界的
普遍关注。
犬瘟热病毒 RNA聚合酶负责病毒 RNA复制、转录,在病毒的生活周期中发挥着重要的作用,P基因
可以反映犬瘟热病毒的活性,代表它在不同寄主中的复制活力,同时,该酶较为稳定,不像表面抗原血凝素
(HA)和 NA那样容易发生变异,不同地域和物种的 RNA聚合酶做同源性比较,可以找出犬瘟热病毒在不
同物种和不同区域进化的痕迹[5]。因此,对犬瘟热病毒 RNA聚合酶基因进行分子遗传进化分析,找出其关
键结构域和酶活性位点及其他功能位点,可以为犬瘟热病毒的起源和进化提供一条思路。
虎源犬瘟热病毒的研究,国内仅运用常规方法检测出犬瘟热病毒[6],而分子生物学方面的研究尚未见
报道。为了研究虎源犬瘟热病毒的起源和其特殊的毒力,将分离到的一株虎源犬瘟热病毒的磷基因进行了
序列测定和分析,之后比较我国的虎源犬瘟热毒株和世界不同地区不同寄主犬瘟热毒株磷基因的差异,分
析 P基因在犬瘟热毒株遗传进化中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
虎源犬瘟热病毒由北京市兽医诊断中心分离,采集自北京市某动物园发病死亡虎,生前体温 40℃,持
续 3d,气喘,厌食,白细胞由 5000/ram上升到 10000/ram,核左移,淋巴细胞少;剖检见气管黏液增多,肺炎
症状;取其肺脏、胰脏、肝脏、脾、肾,经剪碎、研磨后制成 5倍匀浆,反复冻融 5次后用无菌滤器过滤除菌,
备用。
1.2 质粒与菌株
pGEM-Teasy载体购自大连 TaKaRa公司,宿主菌 DH5a由 本试验室保存。
1.3 试剂和基因序列测定
RNA提取试剂 TrizolLSreagent购自 Invitrogen公司,反转录酶及相关试剂购自 Promega公司,Taq聚合
酶及 PCR相关试剂,AgaroseGelDNAPurificationKit(ver.2.0)购自大连 TaKaRa公司.
1.4 引物设计与合成
依据 GenBank中报道的的犬瘟热病毒 P基因的序列,运用软件 Primier5.0设计包含 P基因全部编码区
的 PCR引物(括号中的数字代表病毒全基因组序列上的位点)
上游引物 PF:5′-ACCACCCGTTCTATCCCTA-3′(1781-1799)
下游引物 PR5′-TAAGCGATAGTGAAAGCAG-3′(3360-3379)
1.5 犬瘟热病毒在 Vero细胞上增殖
取出冻存的 Vero细胞复苏,加入含 10%新生牛血清培养液,于 37℃培养至形成致密单层,用 0.25%胰
蛋白酶消化后传代培养,细胞长成单层后,将上述病料 4倍稀释后接种细胞,0.2ml/瓶,37L吸收 1h后弃去
病料,Hank′S液清洗 1～2次,加入培养基,分别于 33℃、37℃室温培养,逐日观察细胞病变(CPE)。
1.6 犬瘟热病毒总 RNA的提取
取 250μlVero细胞上清于 1.5ml离心管,加入 1mlTrizolLSreagent,用移液器抽打裂解物 8～10次,加入
200μl氯仿,彻底振荡混匀,室温静止 10~15min,12000r/min高速离心 15min,小心吸取上层水相 500μl放
置在 1.5μl离心管,再加入 500μl异丙醇室温静置沉淀 30min,12000r/min高速离心 10min,加入 1ml75%乙
醇漂洗后,加入 20μlDEPC水溶解,-80℃保存备用。
1.7 RT-PCR
取 10μlRNA加入 1.5ml的离心管中,然后加入 20pmol/lPF1μl,混匀,70℃水浴 5min后,取出置于冰
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上,依次加入 10mmol/ldNTP1μl,20U/μlRNasin0.5μl,5×RT-bufer4μl,100U/lM-MULV反转录酶 1μl,42℃
水浴 1h,72℃水浴 10min灭活终止反应,-20℃保存备用。
1.8 反转录产物的 PCR扩增
取 RT-PCR产 物 2μl,Taq10×bufer2.5μl,2.5mmol/ldNTP4μl, 引 物 PF,PR各 0.5μl,1μl/l高 保 真
TaqDNA聚合酶 1μl,补加水至 25μl,混匀。PCR循环参数为 94℃预变性 5min,94℃变性 30s,50℃退火 30s,
72℃延伸 100s,30个循环后,72℃延伸 10min。取 PCR产物 5μl,1%琼脂糖凝胶电泳,观察扩增片段大小。
1.9 犬瘟热病毒 P基因的克隆与鉴定
PCR产物经电泳后,切下特异性条带,用凝胶回收试剂盒回收,按常规方法与 pGEM-Teasy载体连接,
并转化宿主菌 DH5a,通过氨苄抗性来筛选阳性克隆产物,运用 PCR技术鉴定筛选和鉴定阳性克隆子,序
列测定进一步验证。
1.10 犬瘟热病毒 P基因的序列分析
阳性克隆子由北京赛百盛基因技术有限公司测序,应用 DNAStar和 Mega(version3.1)分析软件对虎源
CDV病毒的 P基因序列进行整个阅读框架的核苷酸序列,及其推导的氨基酸序列进行同源性比较,并与世
界各地报道的 10个株犬瘟热病毒 P基因序列进行多序列排列比较分析,构建进化树。
2 结果与分析
2.1 犬瘟热病毒 P基因的特异性扩增
RT-PCR产物 PCR扩增后,经凝胶电泳后,于紫外凝胶成像仪中分析,虎源犬瘟热病毒扩增出了大小
约为 1598bp的特异性片段,与预期大小相符(图 1)。
2.2 重组子的筛选与鉴定
PCR产物经连接转化培养后,得到了阳性克隆子,经酶切鉴定后扩增出了与理论上大小一致的片段,
(图 2)。
图 2 重组质粒 PCR鉴定结果
M:DL2000Marker;1:鉴定重组质粒
图 1虎源犬瘟热病毒的 P基因全长片段的 PCR扩增
M:DL2000Marker,1:空白对照,3:阴性对照,2:RT-PCR产物
2.3 犬瘟热病毒 P蛋白基因序列同源性分析
系统分析 P基因通常从第 25个核苷酸开始,每个 P基因都包括一段 390bp连续核苷酸序列(以疫苗
株 Onderstepoor为参考的 2154~2543序列),GenBank已有扩增得到的 P基因很多不是全长序列,而是这
段 390bp的保守序列。因此,取扩增的虎源犬瘟热病毒 387bp保守的核苷酸序列(以疫苗株 Onderstepoor为
参考的 2153~2540序列区域,以下核苷酸序列位置以疫苗株 Onderstepoor为参考),在 GenBank中进行
BLAST分析,结果表明同源性在 98%~91%之间(表 1)。
由此可知,不论是从不同地域分离的毒株,还是从不同寄主体内分离的毒株,其 P基因序列同源性在
91%以上,推知 P蛋白是一个高度保守的蛋白。
2.4 P基因序列变异分析
对犬瘟热病毒 P基因序列 387bp个保守核苷酸序列进行分析,比较发现聚合酶 P基因包含了与各病
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毒病毒株共有序列不同的 6个改变 (change),即 2 229位点 A→C,2 243位点 T→C,2 256位点 T→C,2
420位点 G→A,2 465位点 T→A,2 505位点 G→T,此区域内有个别氨基酸发生了变异,即氨基酸序列第
748位点 L→P和第 822位点 D→V,748位点 P和第 822位点 V在虎源犬瘟热病毒毒株、AF466011、
AY130857中得到保留,不同于其它 7个毒株,种系进化分析显示虎源犬瘟热病毒毒株、AF466011、
AY130857三者的亲缘关系最近,说明核苷酸序列 2 243位点 T→C和 2 465位点 T→A两个位点突变在进
化上及其重要。
2.5系统遗传进化分析
应用 DNAStar和 Mega(version3.1)分析软件,对虎源的犬温热病毒株和 GenBank上可检索到的其它 10
株 CDVP蛋白基因及推倒的氨基酸序列进行比较分析,绘制系统进化树(图 4)。从系统进化树可以发现虎
源的犬温热病毒株与貂源 CDV株 AF466011及浣熊源 CDV株 AY130857的亲缘关系最近,而二者都是野
毒株,与其它几株的亲缘关系相对较远。
表 1 虎源犬瘟热及其参考毒株
图 4 CDV P蛋白基因序列系统进化树
3 讨论
犬瘟热是一种急性、传染性极强的病毒性疾病,该病毒能引起犬科、鼬科、猫科、大熊猫科和小熊猫科
等多种动物发病。张振兴等[7]于 1983年首次报道了中国熊猫犬瘟热病;1999年 2月和 1999年 7月重庆动
物园和雅安碧峰峡生态动物园喂养的小熊猫分别突然大面积的爆发犬瘟热病[8];以前在动物园笼养的老虎
身上发现过的病毒,最近在野生老虎身上发现,如最近俄罗斯远东地区第一次在野生老虎中发现了犬瘟热
病毒[9];Harder等[10]也报道 CDV野生型分离物与疫苗株有明显差异,这样犬瘟热病毒在一个种群群内传播
的可能性很高,并且自然界一旦出现新的宿主,犬瘟热病毒就可能发生变异,从而引起大面积流行。
RNA依赖 RNA聚合酶有非常强的抗原选择,在遗传进化上,酶功能和抗原选择性是对立平衡,因此
研究流行病毒株 RNA聚合酶,可以分析犬瘟热病毒 RNA的起源及其进化。
通过虎源 RNA分离、扩增和测序以及反转录聚合酶链反应等方法,对虎源犬瘟热病毒株与世界各地
其它宿主病毒株序列作比较,发现虎源 CDV病毒 P蛋白基因核苷酸序列与欧洲国家芬兰从貂上分离的
CDV病毒 P基因的核苷酸同源性最高为 98%;而 AB212962株是疫苗株,虎源 CDV病毒 P基因与它的核
苷酸的同源性在 96%;与美国从狗上分离到的 CDV病毒 P基因和匈牙利从狗上分离到的 CDV病毒 P基
因的同源性都为 95%;与俄罗斯从海豹上分离的 CDV病毒 P基因、德国从雪貂和狗上分离到的 CDV病毒
的 P基因、东非的坦桑尼亚的狮子上分离的 CDV病毒 P基因、日本从狗上分离的 AB212727CDV病毒 P基
因的核苷酸同源性分别为 93%、91%、93%和 94%。
结果表明,来自欧洲、非洲、北美洲、日本和中国的虎源分离株互不相同,因此地域、宿主来源不同 CDV
毒株之间存在差别,虎源 CDV病毒 P基因的变异可能是犬瘟热流行具有周期性的原因之一[11],也是犬瘟
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热跨宿主传播流行的重要因素。
序列变异分析发现,RNA聚合酶 P基因包含了与从 GeneBank中所选择的 10株病毒病毒株共有序列
不同核苷酸序列的 6个改变(change),其中 2243位点 T→C和 2465位点 T→A两个位点突变,使得 748
位点 P和第 822位点 V在虎源犬瘟热病毒毒株、AF466011、AY130857中得到保留,结合种系分析的结果,
虎源犬瘟热病毒毒株、AF466011、AY130857三者的亲缘关系最近,提示 748位点 P和第 822位点 V在 P基
因的进化中起着及其重要的作用,2243位点 T→C和 2465位点 T→A突变可能引起犬瘟热病毒的活性
的改变,使犬瘟热病毒在寄主虎中的复制活力加强,从而使犬瘟热跨宿主传播。
这种传播主要发生在食肉目内及食肉目犬科、鼬科与鳍足目海豹科之间。由犬传播引起的貂犬瘟热流
行时有发生,而虎源 CDV病毒 P蛋白基因核苷酸序列与欧洲国家芬兰从貂上分离的 CDV病毒 P基因的
核苷酸同源性最高达 98%,推测 CDV病毒的一条主要的进化路线可能为犬-貂-笼养大型动物-大型野生
动物。
CDV经野生动物多次传代后可能会增大其基因多样性,从而使毒力增强,若再传给无抵抗力的动物群
体,就会引发流行的暴发,甚至有可能在人群中传播。因此,推测 P蛋白结构的稍微变化是导致病毒增殖改
变的重要因素[12],如氨基酸第 748位点 L→P和第 822位点 D→V的变化,该变化对 CDV功能将产生怎样
的影响有待进一步证实。
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