全 文 ：第 １２卷第 ５期
２０１４年 ９月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ５
Ｓｅｐ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０５􀆰 ００３
收稿日期：２０１３－０８－０９
基金项目：国家重点基础研究发展计划（２００７ＣＢ７１４３０３）；上海农业科技重点基金（２００８：８－５）
作者简介：梁克学（１９８９—），男，山东新泰人，硕士研究生，研究方向：发酵工学；史仲平（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｌｐ１９８９０６０４＠ １６３􀆰 ｃｏｍ
甲醇 ／山梨醇共混流加控制溶氧改善毕赤酵母表达
猪圆环病毒 Ｃａｐ蛋白的发酵性能
梁克学，丁　 健，侯国力，史仲平
（江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 ２１４１２２）
摘　 要：研究在重组毕赤酵母（ＧＳ１１５，Ｍｕｔ＋）表达猪圆环病毒 Ｃａｐ蛋白的发酵过程中，甲醇毒害作用以及溶氧波动
影响目的蛋白的正常表达。 基于对甲醇和山梨醇代谢途径的分析，将 Ｃ 源流加的手动调节与反馈控制相结合，提
出了 １种新型的甲醇 ／山梨醇共混诱导策略，能够将溶氧稳定地控制于某一设定值，同时避免甲醇毒害作用。 使用
该策略将溶氧控制于 ２０％的批次，Ｃ源（甲醇和山梨醇）添加过少，导致 Ｃａｐ 蛋白表达量较低（５４ ｍｇ ／ Ｌ）；而将溶氧
控制于 １０％的批次，Ｃ源流加速率适宜，Ｃａｐ蛋白表达量达到 １９８ ｍｇ ／ Ｌ，表达水平明显高于采用传统甲醇诱导策略
（０ ｍｇ ／ Ｌ）和 ＤＯ ｓｔａｔ诱导策略的批次（１２１ ｍｇ ／ Ｌ）。
关键词：毕赤酵母；Ｃａｐ蛋白；甲醇；山梨醇；反馈控制
中图分类号：Ｑ８１５　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０５－００１４－０９
Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ Ｃａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ
ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ＤＯ ｂｙ ｍｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ｓｏｒｉｂｉｔｏｌ ｃｏ⁃ｆｅｅｄｉｎｇ
ＬＩＡＮＧ Ｋｅｘｕｅ，ＤＩＮＧ Ｊｉａｎ，ＨＯＵ Ｇｕｏｌｉ，ＳＨＩ Ｚｈｏｎｇｐｉｎｇ
（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ Ｃａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｔｏｒｉｓ
（ＧＳ１１５，Ｍｕｔ＋），ｍｅｔｈａｎｏｌ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｏｘｙｇｅｎ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．
Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈａｎｏｌ ／ ｓｏｒｂｉｔｏｌ ｃｏ⁃ｆｅｅｄｉｎｇ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｗａｓ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ
ｓｏｒｂｉｔｏｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ． Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｄ ｆｅｅｄｂａｃｋ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ｓｏｒｂｉｔｏｌ ｆｅｅｄｉｎｇ
ｒａｔｅｓ，ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｏｘｙｇｅｎ （ＤＯ） ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｓｔｅａｄｉｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｄｅｓｉｒｅｄ ｖａｌｕｅ，ａｖｏｉｄｉｎｇ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｔ
ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ． Ｉｎ ｔｈｅ ｂａｔｃｈ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ＤＯ ａｔ ２０％ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｓｔｒａｔｅｇｙ，Ｃａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｗｅａｋｌｙ
ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｅｃａｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｈｏｒｔａｇｅ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ （ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｍｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ｓｏｒｂｉｔｏｌ），ｏｎｌｙ ５４ ｍｇ ／ Ｌ； Ｉｎ
ｔｈｅ ｂａｔｃｈ ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＯ ａｔ １０％， ｆｅｅｄｉｎｇ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ａｔ ｐｒｏｐｅｒ ｌｅｖｅｌ，ｓｏ Ｃａｐ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈ １９８ ｍｇ ／ Ｌ，ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｂａｔｃｈｅｓ ｗｉｔｈ
ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ （０ ｍｇ ／ Ｌ） ａｎｄ ＤＯ⁃ｓｔａｔ ｓｔｒａｔｅｇｙ （１２１ ｍｇ ／ Ｌ）．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ； Ｃａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ； ｍｅｔｈａｎｏｌ； ｓｏｒｂｉｔｏｌ； ｆｅｅｄｂａｃｋ ｃｏｎｔｒｏｌ
　 　 猪圆环病毒（ＰＣＶ）可引起原发性猪皮炎肾病 综合征 （ ＰＤＮＳ）和断奶仔猪多系统衰竭综合征
（ＰＷＭＳ），给养殖业带来极大危害。 ＰＣＶ 包含 ２ 个
开放阅读框 ＯＲＦ１和 ＯＲＦ２。 ＯＲＦ１编码与病毒复制
相关的 Ｒｅｐ 蛋白［１］；ＯＲＦ２ 编码病毒的主要结构是
蛋白核衣壳蛋白（Ｃａｐ 蛋白） ［２］，其相对分子质量为
２􀆰 ６×１０４。 目前，关于 Ｃａｐ蛋白的研究工作主要集中
在工程菌的构建方面。 在前期工作中，笔者已成功
构建出能够在摇瓶发酵中正常表达 Ｃａｐ 蛋白的重
组毕赤酵母（ＧＳ１１５，Ｍｕｔ＋）。
与其他表达系统相比，毕赤酵母表达系统具有表
达效率高、外源基因遗传稳定、易实现高密度培养、产
物可分泌和蛋白翻译后加工等优点［３］。 毕赤酵母高
密度发酵可使高效合成外源蛋白成为可能，但与此同
时高耗氧速率引起的氧匮乏严重制约着外源蛋白的
表达。 因此在毕赤酵母高密度发酵中，富氧空气甚至
纯氧的广泛使用，也带来了一系列的安全隐患。
除溶氧浓度（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｏｘｙｇｅｎ，ＤＯ）外，甲醇浓度
是蛋白表达过程中的另一个关键问题。 市售的甲醇
电极，由于其数据漂移以及响应滞后的缺点，并未被
广泛使用。 在传统的甲醇诱导策略中，仅依靠离线测
定，难以稳定控制甲醇浓度，并且最优的甲醇诱导浓
度在不同的发酵过程中并不一致［４］。 因此，直接控制
甲醇浓度的诱导策略存在一定局限性。 为了解决此
类问题，以 ＤＯ 作为反馈指标，间接控制甲醇浓度的
ＤＯ ｓｔａｔ诱导策略已被广泛使用［５－６］。 ＤＯ ｓｔａｔ策略
以 ＤＯ作为反馈指标，可自动调节甲醇流加量，将甲
醇控制于较低的水平，不但能提高甲醇的利用效率，
还可以避免甲醇浓度过高而造成的毒害作用。 但是，
在诱导过程中频繁出现的波动和频繁出现的 Ｃ 源匮
乏也会降低外源蛋白的合成速率。
山梨醇对醇氧化酶（ａｌｃｏｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ，ＡＯＸ）转录
的抑制较弱、能减缓目标蛋白的胞外降解、降低有
毒副产物的积累［７－１０］，现已逐渐成为毕赤酵母高密
度发酵过程中最常用的辅助 Ｃ 源。 在近期研究中，
山梨醇流加主要依靠恒速流加、指数流加等前馈式
控制方法实现［１１－１３］，基于反馈控制的山梨醇流加策
略未见报道，本研究将山梨醇共混诱导与间接控制
Ｃ源流加相结合，提出了 １种新型的甲醇 ／山梨醇共
混诱导策略，以 ＤＯ为反馈指标，间接控制甲醇以及
山梨醇流加，并将其应用于重组毕赤酵母表达猪圆
环病毒 Ｃａｐ蛋白的发酵过程。 此外，进一步比较了
在该新型诱导策略、传统甲醇诱导策略以及 ＤＯ
ｓｔａｔ诱导策略下的 Ｃａｐ蛋白表达水平以及关键发酵
过程的参数，以期实现毕赤酵母表达猪圆环病毒
Ｃａｐ蛋白的高效表达，为其工业化生产的实现提供
理论基础和参考借鉴。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌株
巴斯德毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ１１５（Ｃａｐ
ｐＰＩＣＺαＡ）菌株 （载体为 ｐＰＩＣＺ α，外源基因为
ＰＣＶ２的 ｃａｐ基因，载体呈线型整合在染色体上），由
上海市农业科学院畜牧兽医研究所构建。
１􀆰 ２　 发酵培养基
种子培养基（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ２０、蛋白胨 ２０、酵母
粉 １０。
ＰＴＭ１（ｇ ／ Ｌ）：ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ ６、ＮａＩ ０􀆰 ０８、ＭｎＳＯ４·
Ｈ２Ｏ ３、Ｎａ２ＭｏＯ４·２Ｈ２Ｏ ０􀆰 ２、Ｈ３ＢＯ３ ０􀆰 ０２、ＣｏＣｌ２ ０􀆰 ５、
ＺｎＣｌ２ ２０、ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ６５、Ｂｉｏｔｉｎ ０􀆰 ３；Ｈ２ＳＯ４ ５ ｍＬ ／ Ｌ。
发酵初始培养基：ＭｇＳＯ４ １ ｇ ／ Ｌ、 Ｋ２ＳＯ４ １ ｇ ／ Ｌ、
（ＮＨ４） ２ ＳＯ４ ５ ｇ ／ Ｌ、ＣａＳＯ４ ０􀆰 １ ｇ ／ Ｌ、甘油 ２０ ｍＬ ／ Ｌ、
ＰＴＭ１ １０ ｍＬ ／ Ｌ、Ｈ３ＰＯ４ ２％（体积分数）；ｐＨ ６􀆰 ０。
生长期流加培养基： （ ＮＨ４ ） ２ ＳＯ４ ０􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ、
ＫＨ２ＰＯ４ ０􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ、ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ０３ ｇ ／ Ｌ、ＰＴＭ１ １０ ｍＬ ／ Ｌ、
甘油 ５００ ｍＬ ／ Ｌ；ｐＨ ６􀆰 ０。
甲醇诱导培养基：（ＮＨ４）２ ＳＯ４ ０􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４
０􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ、 ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ０３、甲醇 ５００ ｍＬ ／ Ｌ、 ＰＴＭ１ １０
ｍＬ ／ Ｌ；ｐＨ ５􀆰 ５。
山梨醇培养基（ｇ ／ Ｌ）：山梨醇 ５００。
混加培养基：生长期流加培养基和甲醇诱导培
养基按体积比 ２５ ∶ １混合。
１􀆰 ３　 检测分析方法
１􀆰 ３􀆰 １　 细胞浓度、细胞干质量测定
细胞浓度、细胞干质量测定方法参见文献
［１３］。
１􀆰 ３􀆰 ２　 总蛋白、Ｃａｐ蛋白表达量测定
总蛋白采用考马斯亮蓝法测定［１４］。
Ｃａｐ蛋白表达量采用 ＳＤＳ ＰＡＧＥ 以及 Ｗｅｓｔｅｒｎ
杂交技术测定，具体方法参照文献 ［ １５］。 使用
ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ软件分析 Ｗｅｓｔｅｒｎ 杂交结果，可以得到
对应样品中的 Ｃａｐ蛋白浓度。
１􀆰 ３􀆰 ３　 甲醇浓度、山梨醇浓度检测方法
甲醇浓度采用气相色谱仪测定，色谱条件见参
照文献［１６］。
山梨醇浓度采用高效液相色谱法测定，色谱条
件如下：柱型号为有机酸柱，检测器为示差折光检
测器（ＲＩＤ），柱温为 ６０ ℃，流动相组成为体积分数
５１　 第 ５期 　 　 梁克学等：甲醇 ／山梨醇共混流加控制溶氧改善毕赤酵母表达猪圆环病毒 Ｃａｐ蛋白的发酵性能
０􀆰 ０４２％的 Ｈ２ＳＯ４，流动相流速为 ０􀆰 ６ ｍＬ ／ ｍｉｎ，进样
量为 １０ μＬ。
１􀆰 ３􀆰 ４　 Ｏ２利用速率，ＣＯ２释放速率的计算
利用尾气分析仪（ＬＫＭ２０００Ａ，韩国 ＬＯＫＡＳ 公
司）在线检测发酵尾气中的 ＣＯ２和 Ｏ２分压，按文献
［１７］中的计算公式计算 Ｏ２利用速率（ｏｘｙｇｅｎ ｕｐｔａｋｅ
ｒａｔｅ，ＯＵＲ）、ＣＯ２释放速率（ ｃａｒｂｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ
ｒａｔｅ，ＣＥＲ），并借助 ＲＳ２３２ 通信接口将数据传输记
录于工业控制计算机中。
１􀆰 ３􀆰 ５　 甲醇及山梨醇代谢关键酶比酶活测定
醇氧化酶（ ａｌｃｏｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ，ＡＯＸ）、甲醛脱氢酶
（ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ， ＦＬＤ）、甲酸脱氢酶
（ｆｏｒｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ， ＦＤＨ）、异柠檬酸脱氢酶
（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＩＤＨ）以及 α 酮戊二酸脱
氢酶 （ α ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ， α
ＫＧＤＨＣ）比酶活按文献［１２］报道方法测定。
１􀆰 ４　 培养方法
１􀆰 ４􀆰 １　 种子培养
在装有 ５０ ｍＬ种子培养基的 ５００ ｍＬ三角瓶中接
入从 ＹＥＰＤ平板上挑取的单菌落，３０ ℃、２２０ ｒ ／ ｍｉｎ的
条件下摇瓶培养 ２４ ｈ，作为发酵罐的种子液。
１􀆰 ４􀆰 ２　 １０ Ｌ发酵罐分批补料培养巴斯德毕赤酵母
表达 Ｃａｐ蛋白
分批补料培养在 １０ Ｌ 发酵罐（ＧＵＪＳ １０，镇江
东方生物工程设备技术有限公司）内进行，初始培
养基 ５ Ｌ。 菌体生长期、过渡期和诱导期的基本操
作见前期报道［１８］。 在生长期、过渡期采用 ＤＯ ｓｔａｔ
法控制甘油培养基以及混合培养基流加，当菌体质
量浓度达到 １００ ｇ ／ Ｌ（以细胞干质量计）时停止流
加。 经过 １～２ ｈ的饥饿培养，甘油以及其他可以充
当 Ｃ源的中间代谢物全部耗尽后，开始诱导。
本研究采用了 ３ 种不同的诱导策略：传统甲醇
诱导策略、ＤＯ ｓｔａｔ 诱导策略以及本文提出的新型
甲醇 ／山梨醇共混诱导策略。 在整个诱导期内，通
气量和搅拌速率保持不变，并将 ２ 个电子天平通过
ＲＳ２３２通讯接口连接至工业控制计算机，通过自编
的监控程序在线纪录甲醇和山梨醇的流加速率。
传统甲醇诱导策略：通过离线测量甲醇浓度以
及手动调节甲醇诱导培养基流加速度，试图将甲醇
浓度始终维持在 １０ ｇ ／ Ｌ的适宜水平［１２］。 由于 Ｃ 源
供应充足，菌体耗氧量极大，因此在整个诱导阶段，
必须使用纯氧。
ＤＯ ｓｔａｔ诱导策略：在使用纯氧供氧的条件下，
采用 ＤＯ ｓｔａｔ控制甲醇诱导培养基的流加［５］。
新型甲醇 ／山梨醇共混诱导策略：在共混诱导
中，甲醇和山梨醇共同为菌体合成蛋白提供能量
（ＡＴＰ）以及碳骨架，即甲醇和山梨醇的代谢过程
均包括能量代谢以及蛋白合成 ２ 条途径，如图 １ 所
示。 二者异化产能途径可由如下的反应方程式
表示：
Ｃ ｍｅｔｈａｎｏｌ( ) ＋ ３
２
Ｏ２ ＋ ６ＡＤＰ →ＣＯ２ ＋ ６ＡＴＰ ＋
２Ｈ２Ｏ
Ｃ ｓｏｒｂｉｔｏｌ( ) ＋ Ｏ２ ＋
１９
３
ＡＤＰ → ＣＯ２ ＋
１９
３
ＡＴＰ ＋
Ｈ２Ｏ
由以上可知，在甲醇以及山梨醇的产能途径
中，ＡＴＰ 对于 Ｏ２的得率系数（消耗 １ ｍｏｌ Ｏ２所产生
的 ＡＴＰ）分别为 ４ 和 ６􀆰 ３３。 这也就是说，在消耗相
同数量 Ｏ２时，山梨醇可以为菌体提供更多的 ＡＴＰ。
１ ｍｏｌ甲醇经过同化途径生成目的蛋白时，消耗 ０􀆰 ５
ｍｏｌ Ｏ２，而山梨醇的同化途径中不需要 Ｏ２的供应。
综合考虑 ２种底物的同化途径和异化途径可知，菌
体利用山梨醇时对 Ｏ２的需求量更低。 在总 Ｃ 添加
速率不变，且甲醇 ／山梨醇无积累的条件下，可以通
过改变 ２种底物的添加比例来调节 Ｏ２消耗速率和
ＤＯ。 根据这一原理构建控制器，ＤＯ 偏高时增加总
Ｃ源中甲醇的比例，ＤＯ 偏低时增加山梨醇比例，从
而将 ＤＯ控制于某一设定值。 在不同诱导阶段菌体
对 Ｃ源的需求量不同，因此总 Ｃ 添加速率需要操作
人员根据经验分阶段手动调节。
１􀆰 ５　 Ｃ源比消耗速率的计算
在不同的诱导策略下，Ｃ 源消耗速率采用不同
的方法计算。 传统甲醇诱导策略下，诱导 ｔ ｈ 的甲
醇消耗速率 Ｒｍｅｔｈ（ ｔ） （ｇ ／ （Ｌ·ｈ））可以由以下公式计
算得到
Ｒｍｅｔｈ ｔ( ) ＝
ρｍｅｔｈ ｔ( ) Ｖ － ρｍｅｔｈ ｔ ＋ Ｎ( ) Ｖ ＋ ｍ ｔ( )
ＮＶ
（１）
式中：ρｍｅｔｈ（ ｔ）为离线测定的甲醇质量浓度，ｇ ／ Ｌ；Ｎ
为 ２ 次取样之间的间隔， ｈ；Ｖ 为发酵液体积， Ｌ；
ｍ（ ｔ）为 ｔ～ ｔ＋Ｎ ｈ之间甲醇的流加量，ｇ。
ＤＯ ｓｔａｔ策略：甲醇匮乏会引起 ＤＯ 急剧上升，
以此为依据流加甲醇诱导培养基，因此发酵液中甲
醇浓度始终维持于极低水平，某时间段内甲醇的消
耗速率近似等于其流加速率。 本研究中，以 １ ｈ 为
采样周期，由电子天平读数计算该时间段内甲醇流
６１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
图 １　 甲醇 ／山梨醇代谢途径
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ｓｏｒｂｉｔｏｌ
加速率，甲醇消耗速率约等于其流加速率。
共混流加控制溶氧策略：以 ＤＯ为反馈指标，调
节甲醇 ／山梨醇流加速率。 当 ＤＯ 维持于设定值附
近时，甲醇 ／山梨醇在发酵液中无积累（由液相色谱
仪测定，数据未给出），因此甲醇 ／山梨醇消耗速率
等于其流加速率。 以 １５ ｍｉｎ 为采样周期，根据天平
读数计算 １次甲醇 ／山梨醇消耗速率。 如前所述，以
Ｒｍｅｔｈ（ ｔ）表示甲醇消耗速率。 同理，以 Ｒｓｏｒ（ ｔ）表示诱
导 ｔ ｈ的山梨醇消耗速率。 Ｃ源消耗速率 Ｆ（ ｔ）可用
以下公式表示
Ｆ ｔ( ) ＝ １
３２􀆰 ０４
Ｒｍｅｔｈ ｔ( ) ＋
６
１８２􀆰 １７
Ｒｓｏｒ ｔ( ) （２）
式中：３２􀆰 ０４和 １８２􀆰 １７ 是甲醇和山梨醇的摩尔质量，
ｇ ／ ｍｏｌ。 在单独使用甲醇诱导的批次中，Ｒｓｏｒ（ｔ）为 ０。
１􀆰 ６　 Ｃ流分配的计算
根据图 １，甲醇和山梨醇代谢均包括能量代谢
途径和蛋白合成途径。 采用本研究中所提出策略
进行诱导的发酵批次中，流向能量代谢途径以及蛋
白合成途径的 Ｃ 流量可以通过计算得到。 首先，ｔ１
到 ｔ２时间段内 Ｃ源的消耗总量 Ｍｔｏｔａｌ（ｍｏｌ ／ Ｌ）可以由
式（３）计算。
Ｍｔｏｔａｌ ＝ ∫ｔ２
ｔ１
Ｆ ｔ( ) ｄｔ （３）
由于流向能量代谢途径的 Ｃ源最终以 ＣＯ２形式排出，
因此可以通过计算 ＣＯ２排放总量为这一部分的 Ｃ 源
定量。 ｔ１ ～ ｔ２时间段内用于生成 ＡＴＰ 的 Ｃ 源总量
Ｍｅｎｅｒｇｙ可以由式（４）计算得到。 利用式（５）计算出流
向蛋白合成途径的 Ｃ源总量 Ｍｓｙｎｔｈｅｓｉｓ。 由于使用纯氧
供氧的发酵批次中，在线状态参数（ＣＥＲ）无法测定，
因此只能计算 Ｃ 源的消耗总量 Ｍｔｏｔａｌ，而无法计算流
向 ２条支路中的 Ｃ流。
Ｍｅｎｅｒｇｙ ＝ ∫ｔ ２
ｔ１
ＣＥＲ ｔ( ) ｄｔ （４）
Ｍｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＝ Ｍｔｏｔａｌ － Ｍｅｎｅｒｇｙ （５）
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 不同诱导策略下 ＤＯ的比较
本研究中，将上述 ３ 种诱导策略应用于 ４ 个批
次的发酵实验中。 批次 Ａ 与 Ｂ 分别采用传统甲醇
诱导以及 ＤＯ ｓｔａｔ诱导策略；批次 Ｃ与 Ｄ采用本研
究中提出的新型甲醇 ／山梨醇共混诱导策略，分别
将 ＤＯ设定为 １０％和 ２０％。 上述 ４个批次诱导阶段
ＤＯ变化情况如图 ２所示。
７１　 第 ５期 　 　 梁克学等：甲醇 ／山梨醇共混流加控制溶氧改善毕赤酵母表达猪圆环病毒 Ｃａｐ蛋白的发酵性能
由图 ２可知：批次 Ａ中，尽管 ＤＯ的控制目标为
１０％，但实际的控制效果极差，ＤＯ在 ０ ～ ５０％范围内
大幅度波动。 在使用纯氧供氧的条件下，ＤＯ 对通
气量以及搅拌转速的波动十分敏感，这是导致 ＤＯ
波动的重要原因。 批次 Ｂ 中，使用自编的控制程序
识别 ＤＯ 峰值，启动甲醇流加。 在使用纯氧的条件
下，甲醇匮乏时 ＤＯ 峰值可以达到 ２００％以上，但是
在 ２次流加操作的间隔，菌体耗氧量极大，又会导致
ＤＯ几乎降为 ０。 在批次 Ｃ 与 Ｄ 中，使用空气供氧，
ＤＯ的设定值分别为 １０％和 ２０％。 这 ２ 个批次的
ＤＯ值始终维持在设定值附近，仅有微小波动。
图 ２　 批次 Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ诱导期中 ＤＯ变化
Ｆｉｇ􀆰 ２　 ＤＯ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ ｉｎ ｂａｔｃｈｅｓ Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ
２􀆰 ２　 不同诱导策略下 Ｃ源消耗速率的比较
在批次 Ａ和 Ｂ中，甲醇作为提供合成目的蛋白
所需能量以及碳骨架的唯一 Ｃ 源，其消耗速率如图
３（ａ）所示。 诱导 ４２ ｈ 前，二者没有明显区别；诱导
４２ ｈ后，批次 Ｂ 的甲醇消耗速率基本维持稳定，而
批次 Ａ的甲醇消耗速率突然降低。 在诱导 ４２ ｈ 左
右时，批次 Ａ 甲醇质量浓度突然上升至 ３０ ｇ ／ Ｌ，甲
醇浓度的急剧波动和过高的甲醇浓度会导致菌体
活性下降，甲醇利用速率减缓（图 ３（ ａ））。 批次 Ｂ
中，由于整个诱导期甲醇均维持在很低的浓度，因
此在诱导 ６０ ｈ前菌体始终维持较高的活性，Ｃ 源消
耗速率稳定。 本研究中提出的共混诱导策略，目的
在于优化甲醇 ／山梨醇流加速率（消耗速率），使其
更有利于目的蛋白的表达。 不同诱导阶段菌体对
总 Ｃ源（包括甲醇和山梨醇）的需求量有所不同，因
此总 Ｃ流加速率由操作人员按经验分阶段调节。
在此基础上，使用上述的控制器自动调节甲醇和
山梨醇的流加速率。 批次 Ｃ与批次 Ｄ的 Ｃ源消耗速
率（流加速率）的设定值与实测值如图 ３（ｂ）所示。 由
图 ３（ｂ）可知：在整个诱导期内，批次 Ｃ的 Ｃ源消耗速
率明显高于批次 Ｄ，这是由 ２个批次不同的 ＤＯ设定
值决定的。 在整个诱导阶段，批次 Ｂ 的 Ｃ 源消耗速
率始终高于批次 Ｃ 和 Ｄ；批次 Ａ 的 Ｃ 源消耗速率只
在 ４２ ｈ前高于批次 Ｃ和 Ｄ。 即使在相同的 Ｃ源流加
速率下，甲醇在总 Ｃ 中所占的比例不同，也会导致耗
氧速率的差异。 在批次 Ｃ与 Ｄ中，供氧条件相同，通
过调节总 Ｃ中甲醇所占的比例来调节菌体耗氧速率，
ＤＯ值可以被稳定地控制于设定值。 从图 ３（ｃ）可以
看出，批次 Ｃ 中，大约 ８０％的 Ｃ 源由甲醇提供，而在
批次 Ｄ中，诱导 ２５ ｈ前甲醇约占总 Ｃ源的 ５０％，在其
余时间，甲醇只占总 Ｃ源的 ２０％左右。
醇氧化酶（ＡＯＸ）催化甲醇代谢的第一步反应，
也是毕赤酵母表达系统中最重要的关键酶，ＡＯＸ 比
酶活的高低直接决定了甲醇的代谢速率，进而影响
到目的蛋白的发酵生产水平。 由于不同诱导策略
下，进入诱导期后的菌体质量浓度基本相同（１００ ～
１１０ ｇ ／ Ｌ，以细胞干质量计），所以图 ４ 中 ＡＯＸ 的比
酶活实际上体现了不同诱导条件下细胞代谢甲醇
的能力。 在本研究中，当混加少量的山梨醇时（批
次 Ｃ），一定程度上促进了 ＡＯＸ比酶活的提升，此批
次 ＡＯＸ的比酶活是单独甲醇诱导的 １５０％ ～ ４００％，
达到 ５０ Ｕ ／ ｇ（以细胞干质量计）。 批次 Ａ、Ｂ 的 ＡＯＸ
比酶活相对较低，而由于在这 ２ 个批次流加了更多
的甲醇，所以批次 Ａ、Ｂ 的甲醇消耗速率相对较高
（图 ３ （ ａ））。 由于批次 Ｄ 甲醇流加过少，导致其
ＡＯＸ比酶活相对较低，但在诱导期的很长时间里，
这一数值依然比单独甲醇诱导的批次高，这也间接
证明了甲醇山梨醇混加可以提升 ＡＯＸ的比酶活。
８１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
图 ３　 Ｃ源消耗速率、甲醇所占比例以及甲醇浓度变化
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｃａｒｂｏｎ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ，ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
２􀆰 ３　 不同诱导策略下关键酶比酶活比较
采用甲醇山梨醇混加策略时，甲醛异化途径
中甲醛脱氢酶（ＦＬＤ）、甲酸脱氢酶（ＦＤＨ）（尤其是
批次 Ｃ）的比酶活显著提高（图 ４）。 由图 ４ 可知，
ＦＬＤ和 ＦＤＨ可以完全氧化甲醛异化途径产生的中
间毒负代谢产物并释放 ＣＯ２，高 ＦＬＤ 和 ＦＤＨ 比酶
活有利于抑制中间毒副产物的积累，进而提高细
胞代谢活性和蛋白合成速率。 由图 ４ 还可知，批
次 Ｃ 的 ＦＬＤ 和 ＦＤＨ 比酶活是单独甲醇诱导时的
２００％ ～５００％，分别达到 ６０ 和 １００ Ｕ ／ ｇ（以细胞干
质量计）。 甲醇山梨醇混加还显著提升了 ＴＣＡ 循
环中异柠檬酸脱氢酶（ ＩＤＨ）、α 酮戊二酸脱氢酶
（α ＫＧＤＨＣ）的比酶活，对 ＩＤＨ 比酶活的提升尤
为显著，批次 Ｃ、Ｄ 的 ＩＤＨ 比酶活都达到较高水
平。 综上所述，甲醇山梨醇可以显著改善关键酶
的比酶活，进而提高细胞的能量代谢效率和蛋白
合成速率。
２􀆰 ４　 不同 ＤＯ设定值条件下 ＯＵＲ与 ＣＥＲ的比较
ＯＵＲ和 ＣＥＲ 是毕赤酵母发酵过程中重要的
在线状态参数，可以直接反映菌体的呼吸代谢状
况。 需要特别指出的是，在使用纯氧供氧的批次
（批次 Ａ和 Ｂ）中，发酵尾气内 Ｏ２ 的分压超出尾气
分析仪的测量范围，无法测量，故无法计算出 ＯＵＲ
与 ＣＥＲ。 图 ５ 比较了批次 Ｃ、Ｄ 诱导阶段的 ＯＵＲ。
由图 ５ 可知：批次 Ｃ 的溶氧设定值低于批次 Ｄ，总
Ｃ 源消耗速率以及 Ｃ 源组成中甲醇所占的比例明
显高于批次 Ｄ，因此其 ＯＵＲ 值始终维持在 ０􀆰 １４
ｍｏｌ ／ （Ｌ·ｈ）以上的较高水平。 与此相反，由于批次
Ｄ的较低的 Ｃ 源以及甲醇消耗速率，其 ＯＵＲ 值始
终低于 ０􀆰 １４ ｍｏｌ ／ （ Ｌ·ｈ）。 批次 Ｃ 与 Ｄ 的 ＣＥＲ 如
图 ５ 所示。 从图 ５ 可以看出，批次 Ｃ 中的 ＣＥＲ 远
远高于批次 Ｄ，这也是由于不同的 Ｃ 源流加（消
耗）速率造成的。
２􀆰 ５　 不同诱导策略下 Ｃａｐ蛋白表达水平比较
４ 批次总蛋白浓度变化情况如图 ６ 所示。 由
图 ６ 可知：批次 Ａ、Ｂ 的蛋白表达量在整个诱导期
有所起伏，批次 Ａ尤为严重，其在诱导后期蛋白大
量降解。 前期报道表明，添加山梨醇可以降低蛋
白酶的分泌，减少发酵后期蛋白的降解［１９］ 。 因此，
在批次 Ｃ、Ｄ 中，总蛋白浓度在整个诱导过程中稳
步提高，没有观察到明显的降解。 批次 Ｃ 最终的
总蛋白表达量最高，达到 ２８４ ｍｇ ／ Ｌ；Ａ 批次最低，
仅达到 １７０ ｍｇ ／ Ｌ；批次 Ｂ 和批次 Ｄ 分别达到 ２５４
和 ２４４ ｍｇ ／ Ｌ。
４ 个批次最终的 Ｃａｐ 蛋白表达水平采用
Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交技术测定，测定结果如图 ７所示。 由图
９１　 第 ５期 　 　 梁克学等：甲醇 ／山梨醇共混流加控制溶氧改善毕赤酵母表达猪圆环病毒 Ｃａｐ蛋白的发酵性能
图 ４　 不同诱导策略下关键酶的比酶活
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅｓ
ｕｓｉｎｇ ｖａｒｉｏｕｓ ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ
７可知：２􀆰 ６×１０４左右的条带为猪圆环病毒 Ｃａｐ 蛋
白。 批次 Ａ中，Ｃａｐ蛋白表达水平极低，几乎无法检
测到；批次 Ｄ中，仅有少量的 Ｃａｐ 蛋白被检测到，质
量浓度为 ５４ ｍｇ ／ Ｌ；批次 Ｂ 的 Ｃａｐ 蛋白表达水平明
显高于批次 Ｄ，检测结果为 １２１ ｍｇ ／ Ｌ；批次 Ｃ 的表
达水平最高，达到 １９８ ｍｇ ／ Ｌ。
图 ５　 批次 Ｃ与批次 Ｄ ＯＵＲ与 ＣＥＲ变化
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＯＵＲ ａｎｄ ＣＥＲ ｉｎ ｂａｔｃｈｅｓ Ｃ ａｎｄ Ｄ
图 ６　 不同诱导策略下的总蛋白浓度及
Ｃａｐ蛋白浓度变化情况
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｃａｐ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ
图 ７　 ４个批次的Ｗｅｓｔｅｒｎ测定
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｔｈｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｔｅｓｔ ｏｆ ４ ｂａｔｃｈｅｓ
２􀆰 ６　 新型甲醇 ／山梨醇诱导策略提高 Ｃａｐ 的蛋白
表达
２􀆰 ６􀆰 １　 稳定适宜的 ＤＯ水平提高 Ｃａｐ的蛋白表达
由图 １ 可知：Ｏ２是毕赤酵母利用 Ｃ 源表达目
的蛋白的重要底物，甲醇在醇氧化酶的作用下生
成甲醛，以及 ＮＡＤＨ 经过氧化磷酸化生成 ＡＴＰ 的
反应都必须有 Ｏ２的参与。 发酵液中 ＤＯ 值过低，
０２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
必然会限制上述两步反应的速度，影响目的蛋白
的合成；而 ＤＯ浓度过高同样会对细胞产生毒害作
用，影响目的蛋白的正常表达。 只有 ＤＯ 始终稳定
维持于较适宜的水平时，对目的蛋白的合成才最
有利。 批次 Ｂ 采用ＤＯ ｓｔａｔ诱导策略，在使用纯氧
的条件下，ＤＯ的大幅度波动（０ ～ ２００％）是无法避
免的，这是影响批次 Ｂ Ｃａｐ蛋白表达水平的主要因
素。 批次 Ａ 中也存在 ＤＯ 的波动（０ ～ ５０％），但却
不是影响 Ｃａｐ 蛋白表达量的最主要原因。 批次 Ｃ
和批次 Ｄ 中，ＤＯ 分别被稳定地控制在 １０％和
２０％，对 Ｃａｐ蛋白的表达是有利的。
２􀆰 ６􀆰 ２　 适量的 Ｃ源供应提高 Ｃａｐ蛋白表达
由前期研究报道可知，不同发酵过程中最优
的甲醇诱导浓度各不相同［１２］ 。 本研究中各个批次
诱导期甲醇浓度如图 ３（ｄ）所示。 由图 ３（ｄ）可知：
批次 Ａ 中甲醇供应充足，甲醇浓度最高，Ｃａｐ 蛋白
表达水平反而最低；批次 Ｂ、Ｃ 和 Ｄ中，甲醇质量浓
度均处于 ５ ｇ ／ Ｌ以下的较低水平，Ｃａｐ 蛋白表达水
平均高于批次 Ａ。 显而易见，对于本研究中所使用
的菌株，低甲醇浓度可以提高甲醇的利用效率，更
有利于 Ｃａｐ 蛋白的表达。 批次 Ｂ 中，甲醇浓度较
低，甲醇消耗快，诱导强度高，因此 Ｃａｐ 蛋白表达
水平较高，但是频繁出现的甲醇匮乏以及 ＤＯ 波动
仍然不利于 Ｃａｐ 蛋白的合成。 批次 Ｃ 和 Ｄ 中，为
了保证适宜的 ＤＯ 条件，Ｃ 源供给受到一定限制。
但是山梨醇能在耗氧量较小的情况下，为菌体合
成蛋白提供更多的能量（ＡＴＰ）以及碳骨架，能够
在一定程度上弥补 Ｃ 源供给的不足，有利于 Ｃａｐ
蛋白的合成。 批次 Ｄ 中 ＤＯ 设定值偏高，导致 Ｃ
源添加量偏低，且大部分 Ｃ 源都是由山梨醇提供
的，ＡＯＸ启动子不能被充分诱导，使得 Ｃａｐ 蛋白的
表达量远远低于批次 Ｃ。
２􀆰 ６􀆰 ３　 不同发酵批次碳流分配
在毕赤酵母合成目的蛋白的过程中，一部分 Ｃ
源用于提供能量，生成 ＡＴＰ，Ｃ 以 ＣＯ２形式排出，另
外一部分流向蛋白合成途径，为蛋白合成提供碳骨
架。 流向蛋白合成途径 Ｃ 源的多少，直接决定了目
的蛋白的表达水平。
表 １比较了上述 ４个发酵批次各个诱导阶段和
整个诱导阶段 Ｃ 源的消耗量以及批次 Ｃ、Ｄ 碳流的
分配情况。 单独使用甲醇诱导的 ２个批次（Ａ和 Ｂ）
的 Ｃ 源消耗量大于甲醇 ／山梨醇共混诱导的 ２ 个批
次（Ｃ和 Ｄ）。 其中批次 Ｄ 的 Ｃ 源消耗量远远低于
其他 ３ 个批次，仅相当于 Ａ、 Ｂ、 Ｃ ３ 个批次的
３５􀆰 ８％、３１􀆰 ４％和 ４２􀆰 ０％。 比较 Ｃ、Ｄ ２ 个批次的碳
流分配情况：在整个诱导阶段，批次 Ｃ、Ｄ 的每升发
酵液中，分别有 ４􀆰 ８６ 和 ２􀆰 ９１ ｍｏｌ ／ Ｌ 的 Ｃ 流向蛋白
合成途径，占总各自 Ｃ源的 ３７􀆰 ４％和 ５７􀆰 ２％。
表 １　 不同发酵批次 Ｃ源消耗量及碳硫分配
Ｔａｂｌｅ １　 Ｃａｒｂｏｎ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ａｎｄ ｃａｒｂｏｎ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂａｔｃｈｅｓ
ｍｏｌ·Ｌ－１
诱导时间 ／
ｈ
批次 Ａ
ｃ（总碳）
批次 Ｂ
ｃ（总碳）
批次 Ｃ 批次 Ｄ
ｃ（总碳） ｃ（合成蛋白碳流量） ｃ（总碳） ｃ（合成蛋白碳流量）
１０～２０ ２􀆰 ７３ ３􀆰 ５９ ２􀆰 ８０ １􀆰 ３０（４６􀆰 ４％） １􀆰 ４４ ０􀆰 ９１（６３􀆰 ２％）
２０～３０ ３􀆰 ８２ ３􀆰 ９３ ２􀆰 ４５ １􀆰 ０４（４１􀆰 ６％） １􀆰 ００ ０􀆰 ５２（５２􀆰 ０％）
３０～４０ ３􀆰 ７７ ３􀆰 ５３ ２􀆰 ３９ １􀆰 １４（４７􀆰 ７％） １􀆰 ４１ ０􀆰 ９６（６８􀆰 １％）
４０～５０ ２􀆰 ３９ ３􀆰 ４２ ２􀆰 ０８ ０􀆰 ７３（３５􀆰 １％） ０􀆰 ７６ ０􀆰 ２９（３８􀆰 ２％）
５０～６０ １􀆰 ３６ ２􀆰 ９６ １􀆰 ７８ ０􀆰 ５０（２８􀆰 １％） ０􀆰 ４５ ０􀆰 １５（３３􀆰 ３％）
６０～７０ １􀆰 ２３ － １􀆰 ５１ ０􀆰 １５（９􀆰 ９％） ０􀆰 ４１ ０􀆰 ０８（１９􀆰 ５％）
１０～７０ １５􀆰 ３０ １７􀆰 ４３ １３􀆰 ０１ ４􀆰 ８６（３７􀆰 ４％） ５􀆰 ４７ ２􀆰 ９１（５３􀆰 ２％）
　 　 综上所述，甲醇毒害、ＤＯ波动、Ｃ源供应不足以
及诱导强度低分别是影响批次 Ａ、Ｂ、Ｄ Ｃａｐ 蛋白合
成的主要因素。 而批次 Ｃ 则避免了甲醇的毒害，将
ＤＯ稳定地控制在较温和的水平，同时还为菌体提
供了适量的 Ｃ源以及诱导强度，促使更多的 Ｃ 源流
向蛋白合成途径，因此其 Ｃａｐ 蛋白表达量明显高于
其他 ３个批次。
３　 结　 论
本研究基于毕赤酵母代谢等量甲醇 ／山梨醇耗氧
量的差异，提出了 １种新型的甲醇 ／山梨醇共混诱导
策略，用于重组毕赤酵母表达猪圆环病毒 Ｃａｐ蛋白的
１２　 第 ５期 　 　 梁克学等：甲醇 ／山梨醇共混流加控制溶氧改善毕赤酵母表达猪圆环病毒 Ｃａｐ蛋白的发酵性能
发酵过程。 该策略将人工调节与反馈控制相结合，通
过调节甲醇和山梨醇的流加速率，能够将发酵液中溶
解氧浓度稳定地控制在适宜的水平，适度限制了甲醇
消耗速率，进而缓解了供氧压力，使得整个发酵过程
可以在全程通空气的条件下进行，降低了发酵成本。
使用该策略并将溶氧值控制于 １０％的批次中，甲醛异
化途径和 ＴＣＡ 循环中关键酶活性得到大幅提高，尤
其是 ＡＯＸ，其比酶活达到 ５０ Ｕ ／ ｇ（细胞干质量计），相
对于甲醇单独诱导的批次提高了 １５０％~４００％，代谢
甲醇及降解中间毒负产物的能力显著改善，提高了细
胞代谢活性和蛋白合成速率。 此条件下，最终的 Ｃａｐ
蛋白表达量达到 １９８ ｍｇ ／ Ｌ，是所有发酵批次的最高
水平，相对于 ＤＯ Ｓｔａｔ诱导的批次提高了 ６５％，整体
发酵性能显著改善。
参考文献：
［ １ ］　 Ｃｈｅｕｎｇ Ａ Ｋ．Ｔｈｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｕｎｉｔｓ ｆｏｒ
ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ
ｔｙｐｅ ２［Ｊ］ ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００３，３１３（２）：４５２⁃４５９．
［ ２ ］ 　 Ｎａｗａｇｉｔｇｕｌ Ｐ，Ｍｏｒｏｚｏｖ Ｉ，Ｂｏｌｉｎ Ｓ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ２ ｏｆ
ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｍａｊｏｒ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ［ Ｊ］ ．
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０００，８１（９）：２２８１⁃２２８７．
［ ３ ］ 　 Ｍａｃａｕｌｅｙ Ｐ Ｓ，Ｆａｚｅｎｄａ Ｍ Ｌ，ＭｃＮｅｉｌ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］ ．Ｙｅａｓｔ，
２００５，２２（４）：２４９⁃２７０．
［ ４ ］ 　 Ｇａｏ Ｍ Ｊ， Ｄｏｎｇ Ｓ Ｊ， Ｙｕ Ｒ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ＡＴＰ
ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｐｏｒｃｉｎｅ
ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ⁃ａｌｐｈａ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｕｎｄｅｒ ｌｏｗｅｒ
ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ［Ｊ］ ． Ｋｏｒｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１１，２８（６）：１４１２⁃１４１９．
［ ５ ］ 　 Ｌｅｅ Ｃ Ｙ，Ｎａｋａｎｏ Ａ，Ｓｈｉｏｍｉ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｅｅｄ ｒａｔｅｓ
ｏｎ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｉｎ ＤＯ⁃ｓｔａｔ
ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ［ Ｊ］ ． Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
２００３，３３（４）：３５８⁃３６５．
［ ６ ］ 　 Ｌｉｍ Ｈ Ｋ， Ｃｈｏｉ Ｓ Ｊ， Ｋｉｍ Ｋ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ⁃ｏｘｙｇｅｎ⁃ｓｔａｔ
ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｗｏ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ｆｏｒ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒＧｕａｍｅｒｉｎ ｉｎ
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ［ Ｊ］ ．
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００３，６２（４）：３４２⁃３４８．
［ ７ ］ 　 Ｂｏｚｅ Ｈ，Ｃｅｌｉｎｅ Ｌ，Ｐａｔｒｉｃｋ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ⁃ｌｅｖｅｌ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｏｒｃｉｎｅ ｆｏｌｌｉｃｌｅ⁃ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ｂｙ Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ［Ｊ］ ．Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，３６（８ ／ ９）：９０７⁃９１３．
［ ８ ］ 　 Ｃａｌｉｋ Ｐ，Ｃｅｌｉｋ Ｅ，Ｏｌｉｖｅｒ Ｓ Ｇ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ
Ｍｕｔ （ ＋） ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｕｓｉｎｇ ｄｕａｌ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ：
ｍｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ｓｏｒｂｉｔｏｌ ［ Ｊ］ ． Ｎｅｗ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２００９， ２５ （ １）：
Ｓ６０⁃Ｓ６０．
［ ９ ］ 　 Ｃｅｌｉｋ Ｅ，Ｃａｌｉｋ Ｐ，Ｏｌｉｖｅｒ Ｓ Ｇ．Ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ
ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｉｎ ｔｈｅ
ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｃｏ⁃ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｒｂｉｔｏｌ［Ｊ］ ． Ｙｅａｓｔ， ２００９， ２６ （ ９ ）：
４７３⁃４８４．
［１０］ 　 Ｈｅｌｌｗｉｇ Ｓ，Ｅｍｄｅ Ｆ，Ｒａｖｅｎ Ｎ Ｐ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ⁃ｃｈａｉｎ
ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｕｓｉｎｇ ｏｎ⁃ｌｉｎｅ ｍｅｔｈａｎｏｌ
ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ａｎｄ ｍｉｘｅｄ⁃ｆｅｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ［Ｊ］ ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００１，７４（４）：３４４⁃３５２．
［１１］ 　 Ａｒｎａｕ Ｃ，Ｒａｍｏｎ Ｒ，Ｆｅｒｒｅｒ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｓｏｒｂｉｔｏｌ ｃｏ⁃ｆｅｅｄｉｎｇ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｂｕｒｄｅｎ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ａ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ｌｉｐａｓｅ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ［ Ｊ ］ ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，１３１（２）：Ｓ７６．
［１２］ 　 Ｇａｏ Ｍ Ｊ， Ｌｉ Ｚ， Ｙｕ Ｒ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈａｎｏｌ ／ ｓｏｒｂｉｔｏｌ ｃｏ⁃ｆｅｅｄｉｎｇ
ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｏｒｃｉｎｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ⁃ａｌｐｈａ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ
Ｐ ｐａｓｔｏｒｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｎｅｒｇｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｓｈｉｆｔ［ Ｊ］ ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ
ａｎｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１２，３５（７）：１１２５⁃１１３６．
［１３］ 　 Ｗａｎｇ Ｚ，Ｗａｎｇ Ｙ，Ｚｈａｎｇ Ｄ，ｅｔ ａｌ． Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ
ａｎｄ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｔｅ ｌｙａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｓｏｒｂｉｔｏｌ ｃｏ⁃
ｆｅｅｄｉｎｇ ｗｉｔｈ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］ ．
Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，１０１（４）：１３１８⁃１３２３．
［１４］ 　 Ｂｌａｋｅ Ｍ Ｓ， Ｊｏｈｎｓｔｏｎ Ｋ Ｈ， Ｒｕｓｓｅｌｌ⁃Ｊｏｎｅｓ Ｇ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｒａｐｉｄ，
ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ⁃ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ
ａｎｔｉ⁃ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓ ［ Ｊ ］ ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
１９８４，１３６（１）：１７５⁃１７９．
［１５］ 　 Ｗａｎｇ Ｘ Ｐ，Ｘｉｎｇ Ｓ Ｌ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ
ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ ［ Ｊ ］ ． Ｔｉａｎｊｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，２００９，２３（３）：４０⁃４１．
［１６］ 　 Ｊｉｎ Ｈ，Ｚｈｅｎｇ Ｚ Ｙ，Ｇａｏ Ｍ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙｔａｓｅ ｉｎ
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ ｕｓｉｎｇ ａｎ ＡＮＮ ｐａｔｔｅｒｎ
ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ｂａｓｅｄ ｏｎ⁃ｌｉｎｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ［ Ｊ］ ．
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ，２００７，３７（１）：２６⁃３３．
［１７］ 　 Ｓｈｉ Ｈ，Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｋ． Ｏｎ⁃ｌｉｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ
ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｉｇｎａｌ ｆｌｏｗ ｄｉａｇｒａｍ［Ｊ］ ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９８，５８（２ ／ ３）：１３９⁃１４８．
［１８］ 　 Ｙｕ Ｒ Ｓ，Ｄｏｎｇ Ｓ Ｊ，Ｚｈｕ Ｙ Ｍ，ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｐｏｒｃｉｎｅ
ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ⁃ａｌｐｈａ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ
ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉ⁃ｖａｒｉａｂｌｅｓ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ［ Ｊ ］ ．
Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１０，３３（４）：４７３⁃４８３．
［１９］ 　 Ｊａｈｉｃ Ｍ，Ｇｕｓｔａｖｓｓｏｎ Ｍ，Ｊａｎｓｅｎ Ａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ
ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ
ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ［Ｊ］ ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００３，１０２（１）：４５⁃５３．
（责任编辑　 周晓薇）
２２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷